2019-2020学年高中生物第6章第2节DNA片段的扩增--PCR技术检测含解析中图版选修1.doc

第二节 DNA片段的扩增PCR技术一、DNA在细胞内的复制1所需的酶：解旋酶、DNA聚合酶和RNA聚合酶等。2引物：一段RNA。3原料：四种脱氧核苷酸。4原则：碱基互补配对原则。二、PCR技术的过程1把PCR缓冲液、DNA模板、一对引物、四种脱氧核苷酸、DNA聚合酶、Mg2等成分加入到微量离心管中。2把离心管置于95的高温中，使DNA碱基对之间的氢键断裂，DNA双链拆开成为两条单链。3将离心管置于55的环境中，使一对引物分别结合到两条分开的模板链上。4再将离心管转置于72的环境中，在DNA聚合酶的催化下，游离的脱氧核苷酸从引物的一端进行顺次连接，从而形成两条新的子链。这样高温变性、低温复性和中温延伸三个步骤便构成了PCR过程的一个循环。三、实验操作1准备(1)为了避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的离心管、吸头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌。(2)如果没有PCR仪，可以设置3个恒温水浴锅，温度分别为95、55和72，然后按要求在3个水浴锅中来回转移PCR的微量离心管即可。2扩增3检测利用DNA在260nm的紫外线波段的吸收值曲线来测定相应含量。即：DNA的浓度(g/mL)×稀释倍数。预习完成后，请把你认为难以解决的问题记录在下面的表格中问题1问题2问题3问题4一、DNA复制(体内)与PCR技术(体外)体内复制PCR反应不同点解旋在解旋酶作用下，细胞提供能量，部分解开加热至95 左右，双链全部解开，不需解旋酶引物一小段RNA单链DNA分子片段合成子链在引物基础上，一条链连续合成，另一条链不连续合成分别从两条链的引物端开始，都是连续合成，控制温度72 特点边解旋边复制，半保留复制体外迅速扩增TaqDNA聚合酶不需要需要循环次数受生物体自身控制30多次温度体内温和条件高温(可变)相同点需提供DNA复制的模板四种脱氧核苷酸为原料都需要一定的缓冲溶液子链延伸的方向都是从5端到3端解旋酶的作用是使DNA两条链的氢键断开，而DNA聚合酶与DNA连接酶都是催化形成磷酸二酯键。DNA聚合酶是将单个核苷酸加到已有的单链片段的3端上，需要模板，而DNA连接酶连接的是两条DNA片段的缺口，不需要模板。二、PCR技术的实验操作程序1PCR扩增前的准备移液准备三个水浴锅2PCR扩增循环预变性时间延长最后一次延伸时间延长3检测PCR扩增效果(1)稀释4绘图(DNA的紫外线吸收曲线图)PCR技术的原理及过程如图为某一次循环的产物，请据图回答问题。(1)PCR一般要经历三十多次循环，每次循环可分为_、_、_三个步骤。(2)PCR技术与细胞内DNA复制在解旋时原理不同：细胞内复制利用_使双链间氢键断裂，而PCR技术利用_原理，使双链氢键断裂。以引物为标识，可判断出此产物最早为第_次循环的产物。(3)PCR反应中，如果以引物为标识，共有几种DNA分子产生？你能把它们画出来吗？【审题导析】【精讲精析】(1)PCR的每一轮循环包括高温变性、低温复性和中温延伸三步，从第二轮循环开始，每次循环的产物也作为模板参与反应。(2)DNA分子在细胞内复制时。在解旋酶的作用下使氢键断裂，而在体外，DNA在95 的高温中变性。即双螺旋解开，成为单链；当温度慢慢降低后，两条彼此分离的单链又会重新结合形成双链。在PCR反应中，以引物为标记，第一次循环时，以加入的DNA为模板，两条DNA链可分别由引物和引物与其结合并在DNA聚合酶的作用下延伸，所以形成的每个子DNA中只有一种引物；从第二次循环开始，上次产生的DNA分子又可作为模板参与反应，所以会出现DNA分子两端均含引物的情况，如图所示：因此题干中所出现的情况是第一次循环的产物。(3)产生的DNA分子有3种：只含引物的，只含引物的和既含引物也含引物的。【答案】(1)高温变性低温复性中温延伸(2)解旋酶热变性一(3)共有3种，分别为：当PCR反应体系的温度由变性后快速冷却到50 左右时，引物与模板结合，一般不考虑解开的两个DNA模板链的重新结合，原因：a.模板DNA比引物长得多而且复杂的多，不易重新结合；b.引物与模板间的碰撞机会远远多于模板互补链间的碰撞；c.加入的引物量足够大而模板链数量少。PCR技术是把DNA片段在体外酶的作用下，合成许许多多相同片段的一种方法，利用它能快速而特异地扩增任何要求的目的基因或DNA分子片段，它的基本过程如图所示：注：图中短线表示每次扩增过程中需要的引物。每个引物约含2030个脱氧核苷酸，并分别与两条单链DNA结合，其作用是引导合成DNA子链。(1)PCR技术的原理是模拟生物体内_的过程。(2)PCR扩增过程中需要对DNA片段进行高温处理，其目的是_，此过程在生物体内称为_，需_酶的参与。(3)假如引物都用3H标记，从理论上计算，所得DNA分子中含有3H标记的占_。(4)假定DNA片段含200对脱氧核苷酸，经3次扩增，从理论上计算需要_个游离脱氧核苷酸。【解析】(1)(2)由图可知高温变性的过程就是DNA在高温条件下解旋的过程，在生物体内则需要酶的催化才能进行。低温复性时两条DNA分子都需要引物；(3)每次低温复性时，引物都与两条单链DNA结合，进而形成双链DNA，所以所得DNA中均含3H。扩增3次一共形成了8个子代DNA片段，需游离的脱氧核苷酸数为(81)×4002 800个。【答案】(1)DNA复制(2)使DNA两条链彼此分开解旋解旋(3)100%(4)2 8001PCR技术最突出的优点是()A原理简单B原料易找C所用DNA聚合酶具有耐热性D快速、高效、灵活、易于操作【解析】PCR技术实际上是在体外模拟细胞内的DNA复制过程，形成大量特异性的DNA片段。原理复杂、原料多样，但操作却十分简单。快速、高效、灵活和易于操作正是PCR技术的突出优点。【答案】D2下列哪种温度下DNA会发生复性()A95 B55 C37.5 D72 【解析】DNA解旋在95 环境下，复性温度为55 ，在72 时，DNA链得以延伸。【答案】B3TaqDNA聚合酶由水栖高温菌分离而得。其生长适宜温度为70 75 。回答下列问题：(1)用TaqDNA聚合酶代替一般的DNA聚合酶是使PCR普及应用的关键。因为普通的酶不能耐受94 时使双链DNA变性的温度。因此，每次循环都要_，TaqDNA聚合酶的发现和应用解决了上述问题，提高了PCR的效率，使PCR技术趋向_。(2)PCR反应扩增DNA片段时，_决定了扩增片段的长短。(3)若加入的模板是两个相同的DNA分子，如果只想要“拷贝”这两个长长的DNA分子中“特定区间”，在其他条件均理想时，经过三十次循环，理论上能获得_个“特定区间”片段。【解析】普通DNA聚合酶在DNA变性温度条件下失活，因此，必须循环一次更换一次新酶才能保证DNA复制顺利进行，而TaqDNA聚合酶在94 的DNA变性条件下不会失活，故可以反复利用，解决了PCR聚合酶只能从两引物的3端开始连接脱氧核苷酸，是DNA片段延伸的起始位点，两引物的5端决定了扩增产物DNA片段终点。每个DNA分子中“特定区间”经过30次PCR反应后理论上可获得230个“特定区间”，其中两个位于DNA分子的两条链上，不是“特定区间”片段。故两个DNA经30次PCR循环后获得的“特定区间”片段理论上有230×24。【答案】(1)加入新酶自动化(2)两个引物(3)230×24学业达标测评(十五)一、选择题1RNA引物的合成所需的酶是()ADNA解旋酶BDNA聚合酶CRNA聚合酶 DRNA解旋酶【解析】细胞内DNA复制时的RNA引物是由RNA聚合酶催化形成的。【答案】C2PCR过程与细胞内的DNA复制相比，主要有两点不同，它们是()PCR过程需要的引物是人工合成的DNA单链PCR过程不需要DNA聚合酶PCR过程中DNA解旋不依靠解旋酶，而是通过对反应温度的控制来实现的PCR过程不需要解旋，直接以双链DNA为模板进行复制A BC D【解析】PCR过程与细胞内的DNA复制相比主要有两点不同：是引物不同，PCR过程以DNA为引物，细胞内DNA复制时以RNA为引物。是解旋的方法不同，PCR过程通过热变性解旋，DNA复制依靠解旋酶解旋。【答案】B3PCR技术利用了DNA的_原理，来控制DNA的解聚与结合()A特异性 B稳定性C热变性 D多样性【解析】在PCR中，DNA的解聚与结合是通过热变性来完成的。【答案】C4PCR仪实质上是一台自动调控温度的仪器，下列关于它调控不同温度的目的叙述错误的是()A95 ，使DNA分子变性，解开螺旋B55 ，使DNA分子恢复双螺旋结构，恢复活性C72 ，使DNA分子开始复制，延伸D72 ，使DNA分子恢复双螺旋结构，恢复活性【解析】72 时，DNA分子在DNA聚合酶的作用下开始复制、延伸。【答案】D5DNA在_nm的紫外线波段存在一强烈的吸收峰，其峰值的大小与DNA含量有关()A220 B240C260 D280【解析】DNA对紫外线的吸收峰值在260 nm处。【答案】C6下图中PCR第二轮产物a、b、c、d分别是以PCR第一轮产物的哪一条单链DNA为模板复制产生的()A BC D【解析】以链为模板复制而来的DNA应只含有引物(a)；以链为模板复制而来的只有引物(d)；b、c是以、为模板复制而来的。【答案】D7在PCR扩增DNA的实验中，根据设计，一分子DNA经30次循环后，应得到约230个DNA分子，但结果只有约210个DNA分子。出现该现象的原因可能是()循环次数不够TaqDNA聚合酶活力不够或其活性受到抑制引物不能与亲链结合系统设计欠妥 A BC D【解析】该现象属于在PCR扩增中假阴性现象。其原因有：(1)TaqDNA聚合酶活力不够或其活性受到抑制导致催化效率降低，得到的产物比预期的少；(2)引物设计不合理，可能不能与模板DNA结合，导致无法进行扩增；(3)提取的模板数量或质量不过关，可能不能起模板作用，也无法进行扩增；(4)PCR系统设置不妥，达不到预期的效果；(5)循环次数过少，产物的量比预期的少。【答案】D二、非选择题8PCR技术是把某一DNA片段在实验条件下，合成许许多多相同片段的一种方法，利用这种技术能快速而特异的扩增任何要求的目的基因或者DNA分子片段，“人类基因组计划”的研究中常用到这种技术。请结合有关知识，回答有关此技术的一些问题：(1)PCR技术能把某一DNA片段进行扩增，依据的原理是_。(2)在实验条件下，DNA分子进行扩增，除了所要扩增的DNA片段外，还需要_、_和_等条件。(3)某DNA片段有160个碱基，其中有腺嘌呤35个，若让该DNA分子扩增三次(即复制三次)至少需要腺嘌呤脱氧核苷酸和鸟嘌呤脱氧核苷酸的数目分别是_和_个。【解析】(1)DNA分子具有双螺旋结构，扩增时DNA分子双链之间的氢键断裂，两条链彼此分开，各自吸收细胞内的脱氧核苷酸，按照碱基互补配对原则合成一条新链，然后新旧链联系起来，各自形成一个完整的DNA分子。(2)PCR反应的条件：稳定的缓冲液环境，DNA模板，分别与模板DNA两条模板链相结合的两种引物，A、T、G、C四种脱氧核苷酸。耐热的DNA聚合酶，一般用TaqDNA聚合酶。能严格控制温度变化的温控设备。(3)在DNA片段中，有腺嘌呤35个，可求出鸟嘌呤为45个，DNA分子扩增三次需要腺嘌呤脱氧核苷酸35×(231)245个，鸟嘌呤脱氧核苷酸45×(231)315个。【答案】(1)DNA分子具有双螺旋结构和DNA分子中碱基的互补配对(2)四种脱氧核苷酸引物DNA聚合酶(3)245315第 9 页 共 9 页