1、输血科Rh血型确证试验标准操作规程1、目的：规范实验室工作人员的操作程序，确保实验过程及结果的准确性与可靠性。2、范围：本规程适用于本实验室Rh血型鉴定试验操作。3、职责3.1工作人员进行的Rh血型鉴定试验技术操作应熟练掌握。4、程序4.1 基本原理Rh血型系统中主要的抗原有五种，即D、C、c、E、e,可用相应的抗血清，即抗-D、抗（、抗-c、抗-E、抗-e来检测红细胞上的Rh抗原。在临床输血中一般只检测D抗原，凡被检红细胞与抗-D血清凝集者为RhD阳性，不凝集者为RhD阴性。其它Rh血型抗原的检测与D抗原一样，加相应的抗血清即可。鉴定抗原的方法由抗血清的性质而定，如IgM抗体用盐水法，IgG
2、抗体用抗人球蛋白法和酶法等。4.2 RhD定型4.2.1 原理利用红细胞凝集试验，受检红细胞与抗-D试剂血清反应，凝集者为RhD阳性，不凝集者为RhD阴性。4.2.2 材料1）试剂：经国家批准且批批检定合格的IgM/IgG单克隆或多克隆抗-D。2）受检材料：受检者全血、受检者红细胞盐水悬液。3)已知RhD阳性、阴性红细胞各一份。4.3.3方法步骤1)玻片法(1)操作：在标记的洁净玻片上加1滴抗-D(IgM或IgM+IgG)试剂，再加1-2滴40-50%受检红细胞悬液，用玻棒混匀并将混合物均匀铺成一个直径15mm的区域，轻摇玻片，2分钟内判读结果。同时做阴、阳性对照。(2)结果判定：红细胞凝集为
3、阳性结果；细胞悬液均匀为阴性结果。若对结果有怀疑，应选用试管法重新试验。(3)注意：玻片法一般只适合临床体检时的RhD定型，不适用用于输血前献血者和受血者的RhD血型鉴定。2)试管法：(1)操作：在标记的试管中分别加1-2滴抗-D,再加1滴2-5%的受检红细胞悬液，混匀，IOoOg离心15秒，轻摇试管悬浮细胞扣，判读结果。同时做阴、阳性对照。(2)结果判定：红细胞凝集为阳性结果。红细胞悬液均匀为阴性结果。RhD阳性红细胞与抗-D试剂应出现2+以上的凝集，如果凝集强度小于2+或1+,应考虑是D变异型或红细胞自凝等，需加做其它试验来确认。对于阴性结果，患者的血型可解释为RhD阴性，但对于献血者须进
4、一步做RhD阴性确认试验，以免漏检D变异型。3)微孔板法：(1)操作：在一个微量板孔中加1滴抗-D,再加入1滴2-5%受检红细胞盐水悬液，轻叩板边，混匀孔内物质，约200g离心30-60秒，用手轻叩或借助振荡器悬浮细胞扣，判读结果。同时做阴、阳性对照。(2)结果判定：红细胞凝集为阳性结果。红细胞悬液均匀为阴性结果，其余解释同试管法。4)微柱凝集法：微柱凝胶法选用市售的Rh血型定型卡。(1)操作：在抗-D孔中加入50Ui1%的受检红细胞悬液，轻叩凝胶卡混匀孔内物质，用专用离心机离心后判读结果。(2)结果判定：红细胞凝集块位于凝胶表面或分布于凝胶中为阳性结果；红细胞红细胞完全沉积在微柱凝胶管的底部
5、为阴性结果。凝集强度的判读见第一节中的微柱凝胶法凝集反应评分标准，其余解释同试管法。4.3 RhD变异型(弱D)及RhD阴性确认试验4.3.1 原理红细胞表面存在正常D抗原，则该细胞与抗D(IgM)试剂发生直接凝集，与抗D(IgG)试剂发生致敏反应，抗球蛋白试验阳性可检出。该细胞Rh血型为阳性；若红细胞表面D抗原位点数减少或抗原结构产生变异，则该细胞与抗D(IgM)试剂不发生直接凝集，与抗D(IgG)试剂发生致敏反应，抗球蛋白试验阳性，该细胞Rh血型为D弱反应型，可统称为D变异型；红细胞无论在间接凝集试验还是在直接凝集试验中发生凝集都应为RhD阳性。若不存在D抗原，则该细胞无论在间接凝集试验还
6、是在直接凝集试验中均不发生凝集,该细胞Rh血型为阴性。用抗C、抗C、抗E3种Rh定型试剂通过血凝试验来检查红细胞上是否存在相应抗原。用抗筛细胞检测血清中是否存在不规则抗体，如果存在用谱细胞进行抗体鉴定，以确定抗体的特异性。4.3.2 材料D试剂：抗D试剂（IgM+IgG、IgG分别来自三个不同的厂家或批号）、抗C/c/E试剂、抗人球蛋白试剂（抗lgG）、抗筛细胞、谱细胞2）受检材料：3-5%受检者红细胞盐水悬液。4.3.3 方法D试管法（按试剂厂家说明书操作）：（1）操作：取6支小试管，分别标记为抗-C、抗-C、抗-E、抗-Dl（lgM+lgG）抗D2（lgM+lgG）抗D3（IgM+IgG）
7、向试管内分别加入相应试剂2滴,再向每管中加入已配制好的受检者红细胞悬液1滴;轻轻摇动试管充分混匀，离心15秒（3400转/分），轻摇试管中沉淀，观察凝集情况，并将C、c、E抗原鉴定结果记录，如果E抗原显阳性，需补充添加e试剂鉴定e抗原。若盐水直接凝集试验中抗D（lgM+lgG）管均为阳性，则为RhD阳性；若三管中任一管以上为阳性，按RhD变异型对待。若均为阴性，继续进行Rh阴性确认试验。将上述3支试管放入37恒温水浴箱中，孵育30分钟，三次洗涤后加入抗球蛋白试剂，离心15秒（3400转/分），观察结果，任何一管阳性结果，按RhD变异型对待；如果均为阴性，则为RhD阴性。Rh血型鉴定应严格控制
8、温度和时间，因Rh抗原、抗体凝集反应快、比较脆弱，观察反应时，不可用力过大。（2）结果判定:红细胞凝集为阳性结果，确认为RhD阳性，红细胞不凝集为阴性结果，确认为RhD阴性。如鉴定结果只与抗D血清起反应，而与抗C、-c、-E、-e都不凝集，则受检者为Rh缺失型，以-D-表示。对于阳性结果，应加做受检红细胞的直接抗人球蛋白试验，结果阴性，RhD定型结果才可靠。4.4 RhC、c、E、e抗原检测4.4.1 原理利用红细胞凝集试验，受检红细胞与抗-C、抗-c、抗-E和抗-e试剂血清反应，凝集的红细胞上有相应的抗原，不凝集的红细胞上无相应的抗原。4.4.2 材料D试剂：抗-C、抗-c、抗-E和抗-e试剂血清或Rh分型凝胶卡。2）受检材料：受检者红细胞盐水悬液。4.4.3 方法试管法、微柱凝胶法，操作及结果判定同RhD血型定型。
