相差显微镜与泽尔尼克.ppt
相差显微镜与泽尔尼克,1953年诺贝尔物理学奖,相差显微镜,位相差显微镜（phase contrast microscope）一种将光线通过透明标本细节时所产生的光程差（即相位差）转化为光强差的特种显微镜。 1942年制造了第一台相差显微镜，由于此项发明，泽尔尼克于1953年获诺贝尔奖。,泽尔尼克 （Frits Frederik Zernike, 1888-1966）,1888年7月16日出生于荷兰阿姆斯特丹一个数学教师的家庭里。他父母都是数学教师。,因论证相衬法，特别是发明相衬显微镜，获得了1953年度诺贝尔物理学奖。,原理,人眼只能区分光波的波长（颜色）和振幅（亮度），对于无色通明的生物标本，未经染色的标本（如活的细胞），其形态和内部结构往往难以分辨。 显微镜中所观察的许多物体，如生物切片、油膜和位相光栅等，均具有较高的透明度。光波通过这些物体时，只改变入射光波的位相而不改变它的振幅，这种物体称为“位相物体”。,怎么办？,相衬法(相差法),由于细胞各部分的折射率和厚度的不同，光线通过这种标本时，直射光和衍射光的光程就会有差别。随着光程的增加或减少，加快或落后的光波的相位会发生改变（产生相位差）。 位相（相位）：任一时刻光的振动状态，（振幅相同的光不同时刻振动状态不同，光是余弦函数变化的 ） 光程：光在媒质中通过的路程和该媒质折射率的乘积。将光在介质中传播的路程折合为光在真空中传播的相应路程 。,光的相位差人的肉眼感觉不到，但相差显微镜能通过其特殊装置环状光阑和相板，利用光的干涉现象，将光的相位差转变为人眼可以察觉的振幅差（明暗差），从而使原来透明的物体表现出明显的明暗差异，对比度增强，使我们能比较清楚的观察到普通光学显微镜和暗视野显微镜下都看不到或看不清的活细胞及细胞内的某些细微结构。,构造（特殊光学装置）,a. 环状光阑（Ring slit /annular diaphragm ）: 位于光源与聚光器之间 作用是使透过聚光器的光线形成空心光锥，焦聚到标本上。 装在聚光镜的下方，而与聚光镜组合为一体-相衬聚光镜。它是由大小不同的环形光阑装在一圆盘内，外面标有10X、20X、40X、100X等字样，与相对应倍数的物镜配合使用。,构造,b. 相板（Phase plate）: 装在物镜的后焦平面处 两部分： 1共轭面：半透明的环状 未发生偏斜的直射光通过 将直射光推迟一定波长，两组光波合轴后光波相加，振幅加大，标本结构比周围介质更加变亮，形成亮反差 2补偿面： 通过衍射光的部分 将衍射光推迟一定波长，两组光线合轴后光波相减，振幅变小，形成暗反差（或称正反差），结构比周围介质更加变暗。 有相板的物镜称”相衬物镜”，外壳上常有”Ph”字样。,C.合轴调节望远镜 : 使环状光阑的像与相板共轭面完全吻合，实现对直射光和衍射光的特殊处理。否则应被吸收的直射光被泄掉，而不该吸收的衍射光反被吸收，应推迟的相位有的不能被推迟，这样就不能达到相差镜检的效果。 由于环状光阑是通过转盘聚光器与物镜相匹配的，因而环状光阑与相板常不同轴。为此，相差显微镜配备有一个合轴调节望远镜（在镜的外壳上标有“CT”符号），用于合轴调节。 D.绿色滤光片 由于使用的照明光线的波长不同，常引起相位的变化，为了获得良好的相差效果，相差显微镜要求使用波长范围比较窄的单色光，通常是用绿色滤光片来调整光源的波长。,示意图,Specimen:样本 Objective:物镜 Condenser:聚光镜 Deflected light: 相板（Phase ring） 环形光阑（annular phaseplate）,相差的产生,光通过透明物体时是要慢下来的，为了把直接传播的光和被物体衍射的光区分开来，在聚光器的焦平面上放一环形光栅，并在两个物镜之间插入一个相板，使相板上的环形条纹与环形光栅的象恰好重（通过合合轴调节望远镜 ）。这样，直接光全部穿过位相板上的环纹（共轭面），而衍射光多半穿过纹道的外部（补偿面）。,振幅差的产生,两组光线再经后透镜的会聚，又复在同一光路上行进，而使直射光和衍射光产生光的干涉，变相位差为振幅差。 这样在相差显微镜镜检时，通过无色透明体的光线使人眼不可分辨的相位差转化为人眼可以分辨的振幅差（明暗差）。,应用,相差显微镜能观察到透明样品的细节，适用于对活体细胞生活状态下的生长、运动、增殖情况及细微结构的观察。因此，是微生物学、细胞生物学、细胞和组织培养、细胞工程、杂交瘤技术等现代生物学研究的必备工具。,暗视野显微镜,原理,丁达尔现象： 在日常生活中，室内飞扬的微粒灰尘是不易被看见的，但在暗的房间中若有一束光线从门缝斜射进来，灰尘便粒粒可见了,特殊光学设备,使用中央遮光板或暗视野聚光器，使光源的中央光束被阻挡不能由下而上地直接通过标本进入物镜。 从而使光线改变途径，倾斜地照射在观察的标本上，标本遇光发生反射或散射，让散射的光线投入物镜内。 此时，整个视野是黑暗的，样品与背景差别变大大，从而可以清楚看到透明微小颗粒。,应用,注意：在暗视野中所观察到的是被检物体的衍射光图像并非物体的本身，所以只能用于观察物体的存在和运动，不能辨清物体的细微结构。,大致比较,the end,
