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1 药物分析实验 实验一葡萄糖中一般杂质检查（4 学时） 【实验目的与要求 】 1. 了解药物中一般杂质检查的项目、目的和意义； 2. 理解杂质限量的概念并掌握其计算方法； 3. 掌握氯化物、硫酸盐、铁盐、重金属限量检查的基本原理和操作方法。 【实验原理 】 1. 杂质限量：即药物中杂质的最大允许量。 =100% 杂质最大允许量 杂质限量 供试品量 =100% 标准溶液的浓度标准溶液的体积 供试品量 或 100% CV L S 其中， C 为标准溶液浓度，V 为标准溶液体积，S 为供试品质量，L 为杂质限量。 2. 一般杂质的限量检查 （1）氯化物的限量检查 药物中的氯化物与硝酸银在硝酸酸性溶液中作用，生成氯化银微粒而显白色浑浊，同一定量的 标准氯化钠溶液与硝酸银在同样条件下，用同法处理生成的氯化银浑浊程度相比较，判断药物中含 氯化物的限量。 Cl - + Ag + AgCl （2）硫酸盐的限量检查 药物中微量硫酸盐与氯化钡在酸性溶液中作用，生成硫酸钡微粒而显白色浑浊液，同一定量标 准硫酸钾溶液与氯化钡在同样条件下，用同法处理生成的硫酸钡浑浊程度相比较，判断药物中含硫 酸盐的限量。 SO4 2- + Ba 2+ BaSO4 （3）铁盐的限量检查 药物中的三价铁盐（若含有Fe2+，加硝酸煮沸5 分钟，可使Fe2+ 氧化为 Fe 3+）与硫氰酸盐在硝 酸酸性溶液中作用，生成硫氰酸铁配位离子而显红色，与一定量标准铁溶液与硫氰酸盐在相同条件 下，用同法处理生成的硫氰酸铁配位离子溶液进行比色，判断药物中含铁盐的限量。 2 Fe 3+ + 6 SCN - Fe(SCN)6 3- （红色） （4）重金属的限量检查 重金属一般是指能与硫代乙酰胺或硫化钠在弱酸性（pH 33.5）溶液中，作用生成硫化物的金 属杂质，如铜、银、铅、镉、汞、砷、锑、铋、锡、锌、钴、镍等。重金属不仅影响药物稳定性， 而且在体内容易蓄积，造成慢性中毒，因此必须严格控制限量。在药品生产过程中遇到铅的机会较 多，铅又易积蓄中毒，故以铅为代表。 由于在弱酸性（pH 约 3.5）溶液中硫代乙酰胺水解，产生硫化氢，可与重金属离子作用，生成 有色硫化物沉淀，与标准重金属溶液在同样条件下，按同法处理后进行比较。 CH3CSNH2+ H2O CH3CONH2+ H2S Pb 2+ + H2S PbS + 2 H + 【实验材料、试剂与仪器】 原料名称规 格用 量 葡萄糖普通市售适量 稀硝酸10 g /m L 适量 标准氯化钠溶液10 g Cl -/mL 6 mL 硝酸银试液0.1 mol/L 2 mL 标准硫酸钾溶液100 g SO 42-/ mL 2 mL 氯化钡溶液25% 5 mL 标准铁溶液0.01% 2 mL 硫氰酸铵溶液30% 3 mL 标准铅溶液l0 g Pb/ mL 适量 醋酸盐缓冲液pH 3.5 2 mL 稀焦糖溶液0.2 g/ mL 适量 硫代乙酰胺试液0.04 g/ mL 2 mL 50 mL 纳氏比色管，过滤装置，移液管，滴定管。 【实验方法与步骤 】 1. 氯化物 取葡萄糖若干克（取用量按所提供的药品中杂质的限量计算，g） ，置 50 mL 纳氏比色管中，加 蒸馏水溶解并配成25 mL (如溶液显碱性，可滴加硝酸使成中性)， 再加稀硝酸10 mL ；溶液如不澄 清，应滤过；加蒸馏水配成约40 mL，摇匀，即得供试溶液。另取标准氯化钠溶液(10 g Cl -/ mL) 6.0 mL，置另一 50 mL 纳氏比色管中，加稀硝酸10 mL，加蒸馏水配成约40 mL，摇匀， 即得对照溶液。 于供试溶液与对照溶液中，分别加入硝酸银试液1.0 mL ，用蒸馏水稀释成50 mL ，摇匀，在暗处放 置 5 min，同置黑色背景上，从比色管上方向下观察、比较，供试溶液不得比对照溶液更浑浊（本品 中氯化物限量为0.01%） 。 2. 硫酸盐 取葡萄糖若干克（取用量按所提供的药品中杂质的限量计算，g） ，置 50 mL 纳氏比色管中，加 3 蒸馏水溶解配成约40 mL (如溶液显碱性，可滴加盐酸使成中性)；如溶液不澄清，应滤过；加稀盐 酸 2 mL，摇匀，即得供试溶液。另取标准硫酸钾溶液(100 g SO 4 2-/ mL)2.0 mL ，置另一 50 mL 纳氏 比色管中，加蒸馏水配成约40 mL，加稀盐酸2 mL，摇匀，即得对照溶液。于供试溶液与对照溶液 中，分别加入25%氯化钡溶液5 mL ，用蒸馏水稀释配成50 mL，充分摇匀，放置10 min，同置黑色 背景上，从比色管上方向下观察、比较，供试溶液不得比对照溶液更浑浊（本品中硫酸盐限量为 0.01%） 。 3. 铁盐 取葡萄糖若干克（取用量按所提供的药品中杂质的限量计算，g） ，置烧杯中，加蒸馏水20 mL 溶解 后，加硝酸 3 滴，缓缓煮沸 5 分钟，放冷，转移至50 mL 纳氏比色管中，加蒸馏水稀释配成45 mL，摇 匀，即得供试溶液。另取标准铁溶液（0.01%）2.0 mL，置另一 50 mL 纳氏比色管中，加硝酸3滴，加 蒸馏水稀释配成45 mL，摇匀，即得对照溶液。于供试溶液与对照溶液中，分别加入硫氰酸铵溶液(30 100) 3 mL，摇匀，立即同置白纸上，从比色管上方向下观察、比较，供试溶液不得比对照溶液颜 色更深（本品中铁盐限量为0.001%） 。 4. 重金属 取葡萄糖若干克（取用量按所提供的药品中杂质的限量计算，g） ，置 50 mL 纳氏比色管中，加 蒸馏水 23 mL 溶解后， 加醋酸盐缓冲液 （pH 3.5） 2 mL，摇匀，即得供试品溶液。另取标准铅溶液(l0 g Pb/ mL) 2 mL （若供试品溶液带颜色，向对照液中滴加少量的稀焦糖溶液或其它无干扰的有色溶 液，使之与供试品颜色一致）与醋酸盐缓冲液（pH3.5）2 mL，置另一50 mL 纳氏比色管中，加蒸 馏水稀释成25 mL ， 摇匀，即得对照溶液。 于供试溶液与对照溶液中，分别加硫代乙酰胺试液各2 mL， 摇匀，放置2 min ，同置白纸上，从比色管上方向下观察、比较，供试溶液不得比对照溶液颜色更深 （含重金属不得超过百万分之五）。 【注意事项 】 1. 纳氏比色管的选择与洗涤 比色或比浊操作，一般均在纳氏比色管中进行，因此在选用比色管时，必须注意使样品管与标 准管玻璃色质一致（最好不带任何颜色），体积相等，管上的刻度均匀，如有差别不得相差2 mm。 比色管洗涤时避免用毛刷或去污粉等洗刷，以免管壁划痕影响比色或比浊。 2. 比色、比浊时，样品液与标准液的实验条件应尽可能一致，平行操作。 3. 严格按操作步骤进行试验，注意各种试剂的加入次序。如氯化物检查时，加适量蒸馏水配成 约 40 mL 后，再加AgNO3试液。 4. 比色、比浊前应使比色管内试剂充分混匀，主要利用手腕转动360 ° 的旋摇操作来完成。比色 方法是将两管同置于白色背景上，从侧面观察；比浊方法是将两管同置于黑色或白色背景上，自上 而下观察。 5. 重金属检查中，应注意： (1)样品管中“加水23 mL 溶解后，加醋酸盐缓冲液（pH3.5）2 mL”实验时宜采用“加水适量 溶解后，加醋酸盐缓冲液（pH 3.5）2 mL，再加水使成25 mL” ，更便于操作。加醋酸盐缓冲溶液前， 4 注意比较样品管与标准管的溶液颜色，若样品管带色，应在对照标准管中滴加少量稀焦糖液，使两 管的颜色一致，然后依法操作。 如在标准管中滴加稀焦糖溶液仍不能使颜色一致时，可取该药品项下规定的二倍量的供试 品和试液，加水配成30 mL，将溶液分成甲乙二等分，乙管中加水稀释成25 mL；甲管中加入硫代 乙酰胺试液2 mL ，摇匀，放置 2 min，经滤膜(孔径 3 m) 滤过，然后甲管中加入标准铅溶液一定量， 加水配成25 mL；再分别在乙管中加硫代乙酰胺试液2 mL，甲管中加水2 mL，依法比较，即得。 (2)标准铅溶液应在临用前精密量取标准铅贮备液新鲜配制，以防止铅的水解而造成误差。 【思考题 】 1. 药物中一般杂质主要包括哪些？ 2. 砷盐的检查方法有哪些？古蔡氏法检查砷盐，能适用于所有的药物吗?为什么？ 实验二盐酸普鲁卡因注射液中特殊杂质的检查（3 学时） 【实验目的与要求 】 1. 了解盐酸普鲁卡因的结构和性质； 2. 了解盐酸普鲁卡因注射液中的特殊杂质的检查方法； 3. 掌握 TLC 法测定有关物质的原理与测定方法； 4. 熟悉并掌握薄层板的制备与活化。 【实验原理 】 1.结构与性质 HClH2NCOOCH2CH2N(C2H5)2 C13H20N2O2 .HCl 272.15 盐酸普鲁卡因化学名为4-氨基苯甲酸 -2-(二乙氨基 )乙酯盐酸盐，白色结晶或结晶性粉末；无臭， 味微苦，随后有麻痹感；在水中易溶，在乙醇中略溶，在氯仿中微溶，在乙醚中几乎不溶；用于局 麻。 2.盐酸普鲁卡因中特殊杂质“对氨基苯甲酸 ”的来源及检查的必要性 盐酸普鲁卡因分子中含酯键，因此盐酸普鲁卡因注射液在贮藏期间，普鲁卡因可发生水解反应生 成对氨基苯甲酸和二乙氨基乙醇： COOCH2CH2N(C2H5)2 NH2 +H2O COOH NH2 + HOCH2CH2N(C2H5)2 5 盐酸普鲁卡因注射液在贮存过程中的稳定性与溶液的pH、贮存温度、容器玻璃质量、空气中氧 以及光线照射等有密切关系。如pH 为 6 的溶液，于37 放置 40 天后，分解率约为4.3 4.6%；pH 在 4.05.0 之间的溶液，久贮后仍较稳定。但保存不当，受空气及光线影响，对氨基苯甲酸可脱羧生 成苯胺，而苯胺又会被氧化成有色物质使注射液变黄，降低疗效，增加毒性。所以，中国药典2010 年版（是 ChP2010 吗？） 中规定盐酸普鲁卡因及其注射液均需要检查对氨基苯甲酸的含量，并且盐 酸普鲁卡因注射液中对氨基苯甲酸的限量不得超过标示量的1.2%。 3. 盐酸普鲁卡因注射液中特殊杂质“对氨基苯甲酸 ”的检查原理和方法 检查对氨基苯甲酸的方法曾采用溶剂抽提后比色法，该法操作麻烦、 费时。 中国药典1985 年版 至 2005 年版则采用薄层色谱法检查之。利用薄层色谱法的高分离效能，将对氨基苯甲酸与盐酸普鲁 卡因等物质分离后，喷以对二甲氨基苯甲醛溶液，在冰醋酸存在下与对氨基苯甲酸缩合形成Schiff 碱呈有色斑点，并同时与对照品溶液的主斑点进行比较。 +NCHO H3C H3C NH 2 COOH H+ N H C H3C H3C NCOOH 选用实际存在的待检杂质作为对照标准进行药物中特殊杂质检查的方法较为理想，因为对照品 与杂质系同一种物质，其色谱行为相同。ChP2010 采用高效液相色谱的方法进行检查，高效液相色 谱具有灵敏度高、高专属性等优点，但是其使用成本较高，设备价格昂贵。本实验中采用薄层色谱 法进行检查。 【实验材料、试剂与仪器】 原料名称规 格用 量 盐酸普鲁卡因注射液普通市售12 支 乙 醇AR 适 量 对氨基苯甲酸AR 0.3 mg 对二甲氨基苯甲醛溶液 2%对二甲氨基苯甲醛乙醇溶液100 mL，加入冰醋酸5 mL 制成 适 量 展开剂 苯-冰醋酸 -丙酮 -甲醇 (14:1:1:4) 适量 容量瓶 10 mL 、100 mL 各一个，薄层层析硅胶板，层析缸，点样管。 【实验方法与步骤 】 1. 供试品溶液的制备 精密量取本品，加乙醇稀释使成每l mL 中含盐酸普鲁卡因2.5 mg 的溶液，作为供试品溶液。 2. 对照品溶液的制备 精密称取对氨基苯甲酸3 mg，置 100 mL 的容量瓶中，加乙醇至刻度，摇匀，既得。 3. 盐酸普鲁卡因注射液中对氨基苯甲酸的检查（ChP2010 采用 HPLC 法） ： 吸取上述两种溶液各10 L ，分别点于含有羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶薄层板上，用苯-冰 6 醋酸 -丙酮 -甲醇 (14:1:1:4)为展开剂。 展开后， 取出晾干， 用对二甲氨基苯甲醛溶液喷雾显色。供试溶 液若显色，则与对照品相应的杂质斑点比较，其颜色与对照品溶液的主斑点比较，不得更深。 【注意事项 】 1. 薄层色谱分析中为使斑点集中，点样应分次点加，每次点加后候，其自然干燥、低温烘干或 经温热气流吠干。 2. 薄层板放入层析缸时，薄板底边应水平浸入展开剂中，待展开至溶剂前沿距玻板顶端1 cm 时，取出薄层板。 3. 展开缸必须密封，为使缸内展开剂饱和，薄层板放入展缸前可在层析缸内壁贴滤纸条让滤纸 条一端浸入展开剂中，密封层析缸，待系统平衡后再将薄层板放入展开。 【思考题 】 1. 盐酸普鲁卡因注射液中还需要检查哪些项目? 2. 盐酸普鲁卡因注射液中对氨基苯甲酸与对二甲氨基苯甲醛显色的产物是什么? 实验三盐酸普鲁卡因注射液的含量测定 （提取容量分析法）(5 学时 ) 【实验目的】 1.掌握提取容量法测定盐酸普鲁卡因注射液含量的原理和操作; 2.了解本法和重氮化法测定盐酸普鲁卡因注射液含量的优缺点. 【基本原理】 盐酸普鲁卡因是一个有机碱盐，易溶于水，不溶于有机溶剂，而其游离碱普鲁卡因则易溶于有 机溶剂，难溶于水。因此，采用氨试液将盐碱化，以氯仿提取游离碱，再蒸去氯仿，加过量的标准 硫酸溶液，再用标准氢氧化钠回滴即可。其反应式如下： NH2 COOCH2CH2N(C2H5)2 .HCl + NH3.H2O NH2 COOCH2CH2N(C2H5)2 + NH4Cl + H2O 7 NH2 COOCH2CH2N(C2H5)2 + H2SO4 .H2SO4 NH2 COOCH2CH2N(C2H5)2 2 2 由于硫酸普鲁卡因显酸性，所以选用酸性区域变色的指示剂，比如：甲基红。 【实验材料、试剂与仪器】 原料名称规 格用 量 盐酸普鲁卡因注射液普通市售5 支 氨试液- 3 mL 氯仿AR 45 mL 乙醇中性5 mL 甲红指示-适量 氢氧化钠溶液0.05mol/L 适量 硫酸溶液0.025mol/L 25 mL 分液漏斗50 mL ，过滤装置 （抽滤瓶和布氏漏斗） ，电加热套， 烧杯 1000 mL，蒸馏装置 （100 mL 烧瓶、蒸馏头、冷凝管、接液管、锥形瓶等）, 滴定管，移液管25 mL。 【实验内容】 精密吸取本品适量（约与普鲁卡因0.20g 相当）置分液漏斗中，加氨试液3 mL 成碱性，分次用 氯仿（依次为15，10，10，10ml）振摇提取，每次提取液滤过，合并氯仿液，滤器用少量氯仿洗净， 洗液与滤液合并。在水浴上蒸发至近干，加中性乙醇5 mL 与 0.025 mol/L 硫酸液 25 mL，再在水浴 上加热至氯仿的臭气完全消失，放冷，加甲红指示液数滴，用0.05 mol/L 氢氧化钠液滴定剩余的硫 酸。即得（每1ml 的 0.25mol/L 硫酸液与13.64mg 的 C13H20N2O2· HCl 相当） 。 可按下式计算标示量的百分含量 标示量 = 02.010 1000 7.272 '2 '' 42 NaOHSOH VMVM × 100 或 标示量 = 02. 010 025. 0 ) 2 25(64.13 ' ' ' 42 42 SOH NaOH SOH NaOH M V M M × 100 本品含盐酸普鲁卡因（C13H20N2O2.HCl）应为标示量的 95%-105%。 四. 注意事项 8 1. 样品液碱化前应先加氯仿，以免游离基析出，沉积于分液漏斗活塞部分，在操作中损失。 2. 提取液应用氯仿润湿的棉花滤过，防止少量水混入，避免水溶性成份的影响。 3. 加入标准溶液前，氯仿液只能蒸至近干，加入标准酸溶液后，必须完全蒸除氯仿，以免影响含量 测定结果。 五思考题 1.ChP2010 采用什么方法测定盐酸普鲁卡因注射液的含量，其操作条件有哪些要求？ 2. 盐酸普鲁卡因注射液都需要检查哪些杂质，采用什么方法检测？ 实验四水杨酸钠的双相滴定法（4 学时） 【实验目的与要求 】 1. 掌握双相滴定法的基本原理和基本操作； 2. 熟悉水杨酸钠的检测原理与操作方法。 【实验原理 】 水杨酸钠为水杨酸的钠盐，易溶于水，其水溶液显碱性，可采用盐酸标准液定量滴定。但滴定 产物游离水杨酸不溶于水，在滴定过程中妨碍终点的观察。因此，在水相中加入与水互不相溶的有 机溶剂，例如乙醚等，再以甲基橙为指示剂，边用盐酸标准溶液滴定，边强力振摇。这样，滴定中 生成的水杨酸不断被萃取到有机溶剂中，使终点变化明显，同时降低水杨酸的离解。为使滴定完全， 最后将有机层分出，用水洗涤，将可能混溶于有机层中的盐洗出，洗液并入水层，再另加入有机溶 剂，继续以盐酸标准液滴定至水层显持续的橙红色。 COONa OH + HCl COOH OH + NaCl 指示剂除用甲基橙外，也可用溴酚蓝，终点变化较为明显。 含量计算公式： 753 %100% HCl TVf C H O Na 样品量 式中： T 滴定度； f滴定液浓度校正因子；VHCl消耗滴定液体积； 【实验材料、试剂与仪器】 原料名称规 格用 量 2-(羟基 )苯甲酸钠普通市售1.5 g 乙 醚AR 50 mL 9 甲基橙指示液0.1% 1 滴 盐 酸0.5 mol/L 适量 分液漏斗250 mL，滴定管 ，磨口塞锥型瓶250 mL, 滴定管。 【实验方法与步骤 】 精密称取2-(羟基 )苯甲酸钠约1.5 g，置于 250 mL 分液漏斗中，加蒸馏水约25 mL 溶解后，加 乙醚 35 mL 与甲基橙指示液一滴，用盐酸滴定液（0.5 mol/L ）滴定，边滴边用强力振摇，至水层显 橙红色，分取水层，置250 mL 磨口塞锥型瓶中，乙醚层用蒸馏水5 mL 洗涤，洗液并入锥形瓶中， 加乙醚 10 mL 继续用盐酸滴定液(0.5 mol/L) 滴定，边滴边用强力振摇，至水层显持续的橙红色。记 录盐酸滴定液的总用量，计算2-(羟基 )苯甲酸钠的含量。每1 mL 的盐酸液 (0.5 mol/L ，需标定 )相当 于 80.05 mg 的 2-(羟基 )苯甲酸钠。 【注意事项 】 1. 双相滴定操作是在分液漏斗中进行的，因此，分液漏斗的大小要合适，操作要正确。 2. 先在分液漏斗中加入少量的水，再加入样品。 若先加入样品后再加入水，易使样品集聚在分 液漏斗底部，使漏斗底部堵塞而无法分液。 3. 滴定过程中，振摇要充分。 4. 滴定结束后，要充分静止，使分液漏中水层与醚层完全分层后，再分取水层，并注意将水层 全部分出，以免造成损失。 【思考题 】 1. 水杨酸钠的含量测定，采用盐酸标准溶液直接滴定时，有什么缺点？ 2. 双相滴定操作的关键是什么？ 3. 双相滴定法还适用于哪些药物的含量测定？ 实验五非水溶液滴定法测定马来酸氯苯那敏的含量（4 学时） 【实验目的与要求 】 1. 掌握非水溶液滴定法的原理、操作与计算方法； 2. 掌握马来酸氯苯那敏测定时结晶紫指示剂的终点颜色判断。 【实验原理 】 1. 结构与性质 10 N H3CCH3 . COOH COOHH H C16H19ClN2.C4H4O4390.87 马来酸氯苯那敏为白色结晶性粉末，无臭，味苦，在水、乙醇或三氯甲烷中易溶，在乙醚中微 溶。按干燥品计算，含C16H19ClN2.C4H4O4不得少于 98.5%. 2. 测定原理 有机弱碱，在水溶液中碱性较弱，不能直接滴定。若选择酸性溶剂，先生成有机碱的盐，使其 碱性增强，然后用高氯酸标准溶液进行滴定，这样就可以测定有机弱碱的含量。 有机碱盐的非水滴定实质上是个置换滴定。即用强酸（HClO4）置换出有机碱结合的较弱的酸。 BH +A- + HClO 4 = BH +ClO 4 - + HA 式中， BH +A- 表示有机碱盐，HA 表示被置换出弱酸。 马来酸氯苯那敏为有机碱的有机酸盐，滴定中被取代出的有机酸为弱酸，在冰醋酸中酸性弱， 不干扰滴定，因此相应盐的非水滴定和一般游离碱类药物相同，可直接进行。 【实验材料、试剂与仪器】 原料名称规 格用 量 结晶紫指示液0.5%的冰醋酸溶液2 滴 冰醋酸AR 1000 mL 马来酸氯苯那敏原料药 普通市售 0.31 g 高氯酸 70% 8.5 mL 邻苯二甲酸氢钾 AR 0.16 g 醋酸酐 AR 23 mL 1000 mL 容量瓶，滴定管，锥形瓶 ，量筒。 【实验方法与步骤 】 1. 高氯酸滴定液（0.1 mol/L ）的配制与标定 （1）配制取无水冰醋酸 750 mL ，置 1000 mL 容量瓶中，加入高氯酸（70%）8.5 mL ，摇匀， 在室温下缓缓滴加醋酐23 mL，边加边摇，加完后再振摇均匀，放冷，加无水冰醋酸至刻度，摇匀， 放置 24 h。若所测供试品易乙酰化，则须用水分测定法测定本液的含水量，再用水和醋酐调节至本 液的含水量为 0.01%0.2%。 （2）标定取在 106 干燥至恒重的邻苯二甲酸氢钾约0.16 g，精密称定，加无水冰醋酸20 mL 使溶解，加结晶紫指示液1滴，用本液缓缓滴定至蓝色，并将滴定的结果用空白试验校正。每1 mL 高氯酸滴定液（0.1 mol/L ）相当于 20.42 mg的邻苯二甲酸氢钾。根据本液的消耗量与邻苯二甲酸氢 钾的取用量，算出本液的浓度，即得。 11 （3）贮藏置棕色玻瓶中，密闭保存。 2. 含量的测定 取马来酸氯苯那敏原料药约0.15 g，精密称定，加冰醋酸10 mL溶解后，加结晶紫指示液1滴，用 高氯酸滴定液（0.1 mol/L ）滴定至溶液显蓝绿色，并将滴定的结果用空白试验校正。计算马来酸氯 苯那敏的含量。每1 mL高氯酸滴定液（0.1 mol/L ）相当于 19.54 mg的C16H19ClN2.C4H4O4。 计算方法： 3 0 0 16192444 19.54 ()10 () 0.1 C H ClN .C H O %100%100% C VV TVVF WW 式中， T：滴定度； F：浓度校正因数；W：供试品的质量；V：供试品消耗滴定液的体积；V0：空白 试验消耗滴定液的体积；C：高氯酸滴定液的实际浓度。 【注意事项 】 1. 本实验中水的含量对结果有重要影响，所以实验使用的仪器均需预先洗净烘干。 2. 滴定时的温度很重要，因为冰醋酸的体积膨胀系数较大（1.1 × 10 -3 /），其体积随温度改变 较大，温度和贮存条件都影响标准溶液的浓度。滴定供试品与标定高氯酸滴定液时的温度差不要超 过10 ，否则应重新标定；若未超过则可根据下式将高氯酸滴定液的浓度加以校正。 0 1 10 10.0011() C C tt 式中，0.0011为冰醋酸的膨胀系数，t0为标定高氯酸滴定液时的温度()， t1为测定供试品时的温度(), C0为t0时高氯酸滴定液的浓度 (mol/L) ，C1为 t1时高氯酸滴定液的浓度(mol/L) 。 【思考题 】 1. 非水溶液滴定法中，若容器、试剂含有微量水分，对测定结果有什么影响？ 2. 非水溶液滴定法测定有机碱药物的氢卤酸盐、硫酸盐、硝酸盐时，有何干扰？如何消除？ 3. 非水溶液滴定法中为什么要做空白试验？空白试验应该怎样做？ 实验六复方对乙酰氨基酚片的含量测定（8 学时） 【实验目的与要求 】 1. 掌握复方片剂中各成分含量测定的基本原理和操作方法； 2. 掌握复方片剂的分析特点； 3. 熟悉亚硝酸滴定法的原理及操作方法。 【实验原理 】 12 复方对乙酰氨基酚片中含有对乙酰氨基酚、乙酰水杨酸和咖啡因三种主要成分。 NHHO O 对乙酰氨基酚 COOH OCOCH3 乙酰水杨酸 N N N N O O .H 2O 咖啡因 各成分之间性质差异较大。对乙酰氨基酚为芳酰胺类药物，含酰胺基，呈中性，但具有潜在的 芳伯氨基，可将其在酸性条件下水解后用重氮化法测定；乙酰水杨酸为芳酸类药物，其水溶液呈酸 性，Ka = 3.27 × 10 -4，可用酸量法测定；咖啡因为黄嘌呤类生物碱，碱性极弱， Kb0.7 × 10-14，采用一 般生物碱的含量测定方法不能准确测定其含量，但可将其与碘发生定量沉淀后，再用硫代硫酸钠滴 定剩余的碘，从而求得咖啡因的含量。反应式表示如下： 1. 乙酰水杨酸的测定原理 COOH OCOCH3 NaOH COONa OCOCH3 H2O + + 由于生成的水杨酸钠属强碱弱酸盐，故易水解使溶液呈微碱性，所以选用碱性区域变色的指示剂 -酚酞。 2. 对乙酰氨基酚的测定原理 HONHCOCH 3 H + H2O HONH2.HCl + CH3COOH HONH2.HCl+ NaNO2HON2.Cl + 2 H 2O 2 NaNO 2 + 4 HCl + KI I2 + 2 KCl + 2 NaCl + 2 NO + 2 H 2O 以淀粉碘化钾指示反应终点。 3. 咖啡因的测定原理 N N O O H3C CH3 N N 2 I + KI + H 2SO4 N N O O H3C CH3 N CH3 N HII4+ KHSO4 CH3 I2 (剩余) + 2 Na2S2O32 NaI + Na2S4O6 【实验材料、试剂与仪器】 原料名称规 格用 量 复方对乙酰氨基酚片普通市售20 片 氯 仿AR 50 mL 中性乙醇对酚酞指示液显中性20 mL 酚酞指示液0.5%酚酞乙醇溶液3 滴 13 氢氧化钠溶液0.1 mol/L 适量 溴化钾AR 3 g 亚硝酸钠液0.l mol/L 适量 硫代硫酸钠液0.05 mol/L 适量 碘液0.1 mol/L 适量 稀硫酸- 25 mL 盐酸1240 mL 淀粉指示液2mL 移液管 ，分液漏斗50 mL，蒸馏装置（ 100mL 烧瓶，蒸馏头、冷凝管、接液管、锥形瓶等），电 加热套，抽滤装置（抽滤瓶、布氏漏斗，活塞、水泵等），滴定管 ，锥形瓶 ，细玻棒 ，容量瓶 ，碘量 瓶，涂有含锌碘化钾淀粉指示液的白瓷板。 【实验方法与步骤 】 取复方对乙酰氨基酚片20 片，精密称定，研细备用。 1. 乙酰水杨酸的含量测定 精密称取上述细粉适量（约相当于乙酰水杨酸0.4 g） ，置分液漏斗中，加15 mL 水，摇匀，依 次用氯仿20 mL，10 mL，10 mL ， 10 mL 振摇提取4 次，提取氯仿液用同一份水10 mL 洗涤，合并 氯仿洗液，置水浴上蒸干，残渣加20 mL 中性乙醇（对酚酞指示液显中性）溶解后，加酚酞指示液 3 滴，用氢氧化钠（0.1 mol/L ）滴定液滴定，记录所用氢氧化钠滴定液的量。每1 mL 0.1 mol/L 氢氧 化钠液相当于18.02 mg 的 C9H8O4。 按下式计算每片含乙酰水杨酸的克数： g / 片 = T V f W称样量 × W平均片重 其中： T：为滴定度； V：消耗滴定液体积；f：为滴定液浓度校正因子。 2. 对乙酰氨基酚的含量测定 精密称取上述细粉适量（约相当于对乙酰氨基酚0.25 g） ，置锥形瓶中，加稀硫酸25 mL，缓 缓加热回流60 min，冷却至室温，析出水杨酸，滤过。滤渣与锥形瓶用盐酸液(12)40 mL 分数次洗 涤，每次 5 mL，合并滤液与洗液，加溴化钾3 g，摇匀溶解。室温下，用亚硝酸钠（0.l mol/L ）滴定 液迅速滴定，滴定时将滴定管的尖端插入液面下约2/3 处，边滴边搅拌，至近终点时，将滴定管尖 端提出液面，用少量的水洗涤尖端，洗液并入溶液中继续缓缓滴定，至用细玻棒蘸取溶液少许，划 过涂有含锌碘化钾淀粉指示液的白瓷板上，即显蓝色的条痕，停止滴定，5 min 后再蘸取少许，划过 一次，如仍显蓝色的条痕，即达终点， 记录所用亚硝酸钠滴定液的量。每 l mL 的亚硝酸钠 （0.l mol/L ） 滴定液相当于15.12 mg 的 C8H9NO2。 按下式计算每片含对乙酰氨基酚的克数： 14 g / 片 = T V f W称样量 ×W平均片重= 0.01512 V W称样量 ×W平均片重 × × 0.1 M'NaNO2 式中： ' 2 NaNO M为亚硝酸钠液的实际浓度，0.1 为亚硝酸钠液的理论浓度。 3. 咖啡因的含量测定。 精密称取上述细粉适量(约相当于咖啡因50 mg)，置小烧杯中，加稀硫酸5 mL ，振摇数分钟使 咖啡因溶解。过滤，滤液置50 mL 容量瓶中，用水洗涤滤器与滤渣3 次，每次 5 mL ，将滤液与洗液 合并，精密加碘液 （0.l mol/L ）25 mL，用水稀释至刻度，摇匀， 在避光、 约 25 条件下放置15 min。 摇匀，过滤，弃去初滤液。精密量取续滤液25 mL 置碘量瓶中，用硫代硫酸钠（0.05 mol/L ）滴定液 滴定，至近终点时，加淀粉指示液2 mL，继续滴定至蓝色消失，并将滴定结果用空白试验校正，记 录所用硫代硫酸钠滴定液的量。每l mL 的 0.1 mol/L 碘液相当于5.305 mg 的 C8H10N4O2· H2O。 按下式计算每片含咖啡因的mg 数： 平 均片 重 称样 量 片W W fVT m g I 2 2/ 平均片重 称样量 样空 W W MVVT OSNa 20 2 ' 322 【注意事项 】 1. 采用酸量法测定乙酰水杨酸时，对乙酰氨基酚、咖啡因对它无干扰，但处方中加入的稳定剂 酒石酸或枸椽酸会影响测定，故采用氯仿提取后测定，以消除稳定剂的影响。 2. 由于乙酰水杨酸结构中含有酯键，易水解，生成的水杨酸和醋酸，要多消耗氢氧化钠，所以 应在中性乙醇中进行分析，并控制滴定温度在515 ，以防止其水解。 3. 提取及洗涤时注意： a. 提取 -洗涤过程中，不能让水层长时间地接触活塞部分，以免甘油淀粉糊被溶解而发生渗漏。 b. 每次提取液都置第二只分液漏斗中，并经同一份水洗涤，洗涤液收集入锥形瓶，并合并洗涤 液。即经过4 次提取， 4 次洗涤，然后将4 次提取 -洗涤液合并入同一锥形瓶中。 4. 氯仿溶剂应该在水浴上蒸馏回收，收集于磨口锥形瓶中，不能敞口蒸馏或敞口接收馏液。 【思考题 】 1. 在测定乙酰水杨酸、对乙酰氨基酚、咖啡因时，如何确定其各自的取样量? 2. 测定对乙酰氨基酚时，指示终点的方法都有哪些？ 3. 试述外加指示剂指示终点的原理、方法及缺点，如何克服这一缺点？ 4. 能否采用一般含氮碱的方法测定咖啡因的含量，为什么? 实验七氯霉素眼药水的高效液相色谱分析法（5 学时） 15 【实验目的与要求 】 1. 学习掌握内标法测定组分含量的原理与操作方法； 2. 熟悉外标法在测定组分的含量中的应用； 3. 学习高效液相色谱仪的结构及正确使用方法； 4. 了解氯霉素眼药水的含量测定方法。 【实验原理 】 1. 内标法 其方法是精密称取一定量的样品和内标物，制成适当溶液后进样分析，根据样品和内标物的重 量及其相应的峰面积（或峰高），求出某组分的含量。原理如下： 根据物质的重量与其峰面积（或峰高）成正比，有 iii AfW。 在绝对校正因子法( i f)中： 组分 样 内标 内标内标样 内标内标 内标 内标内标内标 100%100 ' W W f f A A W W i Af Af WW Af Af W W iii ii i iii 在相对校正因子（ 内标i f ）法中： 内 内 内标 内标 A W A W f f f i i i i iii A A W fW 内 内 内标 组分 内标 样 内 内标样 100%100 i ii f W W A A W W i 当峰形对称，峰窄时还可以用峰高代替峰面积来定量。 内标法可以消除仪器与操作或制备样本时带来的误差。 2. 外标法 又称校正法或定量进样法。该法要求能准确地定量进样。其方法是配制一系列已知浓度的标准 液，在同一操作条件下，取相同量注入色谱仪，测量其峰面积(或峰高 )，作峰面积 (或峰高 )与浓度的 标准曲线。 然后在相同条件下，注入同量样品溶液，测量待测组分的峰面积(或峰高 )，根据标准曲线， 计算样品中待测组分的浓度。 16 【实验材料、试剂与仪器】 原料名称规 格用 量 对硝基苯酚AR 200 mg 氯霉素 AR 100 mg 甲 醇GR 适量 氯霉素眼药水普通市售1 支 容量瓶，移液管，高效液相色谱仪。 【实验方法与步骤】 （一）实验条件 色谱仪高效液相色谱仪 色谱柱反相 C18柱 温度室温 流动相内标法甲醇 : 水(60: 40) 外标法甲醇 : 水(80: 20) 流速0.7 mL/min 检测器UV 检测器 （二）标准贮备液的制备 1. 1 mg / mL 氯霉素标准贮备液的配制 精密称取氯霉素约100 mg 置 100 mL 容量瓶中，以甲醇溶解，并稀释至刻度，摇匀，即得。 2. 2 mg/ mL 对硝基苯酚(内标 )标准贮备液的配制 精密称取对硝基苯酚约200 mg 置 l00 mL 量瓶中，以甲醇溶解，并稀释至刻度，摇匀，即得。 (三) 内标法测定氯霉素的含量 1. 相对校正因子的测定 分别精密加入氯霉素标准贮备液1，2，3，4，5 mL，置 5 个 l0 mL 容量瓶中，再分别精密吸取 对硝基苯酚标准贮备液各2.5 mL 用甲醇稀释至刻度，摇匀。待色谱仪基线平稳后，分别进样 20 L， 得色谱图。测量对硝基苯酚及氯霉素峰面积或峰高，按公式计算相对校正因子，本实验中，由于峰 形较窄，可采用峰高法。 2. 样品含量测定 精密吸取眼药水适量(约相当于氯霉素500 mg，标示量为2.5 mg/ mL)，置 l0 mL 容量瓶中，并 加入对硝基苯酚的贮备液2.5 mL，用甲醇稀释至刻度，摇匀，进样20 L，得色谱图。按下式计算 标示量的百分含量 %100%100% 内标 样品 内标 内标 标示量 i ii f W W h h W W (四) 外标法测定氯霉素的含量 17 1. 标准曲线的 绘制 分别吸取氯霉素标准贮备液 1、2、3、 4、5 mL，置 5 个 l0 mL 容量瓶中，用甲醇稀释至刻度， 摇匀，各进样20 L，以峰面积或峰高对浓度作图，得标准曲线。 2. 样品 的测定 精密吸取眼药水适量(约相当于氯霉素2.5 mg)，置 l0 mL 容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀， 进样 20 L， 得色谱图， 根据峰面积或峰高从标准曲线上查得相应的浓度，并计算标示量的百分含量。 【注意事项 】 1. HPLC 使用的流动相必须经滤膜过滤及脱气处理，可用超声波、 机械真空泵或水力抽气泵脱气。 2. 严格防止气泡进入色谱系统。吸液软管必须充满流动相，吸液管的烧结不锈钢过滤器必须始 终浸在溶剂内。如变换溶剂瓶，必须先停泵，再将过滤器移到新的溶剂瓶内，然后再开泵使用。 3. 色谱分析完成后，必须马上清洗柱子，避免过夜，以保证色谱柱的寿命。特别是反相柱用过 含酸、 碱或盐流动相后 ，应先用水 冲洗 ，再用甲醇 -水充分冲洗， 每种冲洗溶剂一般冲洗30 min左右， 特殊情况应延长冲洗时间。否则，残存的酸碱可能会侵蚀仪器部件，析出的盐类可能会堵塞管道。 本实验的流动相中含有醋酸盐缓冲液，故测定完毕后，要先用水冲洗柱子至基线平稳（约060 min以上），再用含水的甲醇溶液或纯甲醇溶液冲洗3060 min。 4. 标准贮备液的配制应精密称定重量，先用少量甲醇溶解后，再用甲醇稀释至刻度，否则因部 分未溶导致浓度不准确。 【思考题 】 1.怎样选择流动相？ 2. 内标物应具备哪些条件？ 3. 变换溶剂时，直接将一种互不相溶的溶剂替换前一种溶剂，对色谱行为有何影响?如何消除 这种影响 ? 实验八维生素 B1片剂的含量测定（5 学时） 【实验目的与要求 】 1. 掌握差示分光光度法消除可能存在干扰的原理； 2. 熟悉差示分光光度法的基本测定方法； 3. 了解维生素B1的结构与性质； 4. 熟悉维生素B1的检测原理及操作方法。 【实验原理 】 1.结构与性质 18 N NH3C NH2 N + S CH3 Cl-.HCl OH C12H17ClN4OS . HCl 337 维生素 B1由嘧啶环和噻唑环通过亚甲基结合而成的一种B族维生素，为白色结晶或结晶性粉末； 溶于水，微溶于乙醇、氯仿，有微弱的特臭，味苦，有引湿性，露置在空气中，易吸收水分。在碱 性溶液中容易分解变质。它的生理功能是能增进食欲