(完整word版)GST_pull_down试验方法(自己总结)(2),推荐文档.doc
12.GST蛋白的表达和纯化12.1 GST蛋白的表达（1) 将表达GST融合蛋白的质粒转入BL21大肠杆菌菌株中。（2) 挑单克隆于3ml LA(LB+Amp)培养基中，37摇菌过夜，获得种子液。（3) 将种子液稀释于50ml2XYTA(YTG+Amp)培养基中，使起始OD600为0.1。（4) 28,220rpm摇菌培养2小时。（5) 加入50l 100mM IPTG,1627摇菌培养18小时。（6) 收菌，将菌液倒入大离心管，2管/50ml菌液，4 5krpmx5min离心，弃上清。（7) 加入10ml PBS/管，重悬细胞,5krpm离心5min，弃上清。（8) 加入2mlPBS/管，重悬细胞。转移至5ml离心管。（9) 超声破壁破壁前，在细胞悬液中加20l 10mg/ml PMSF,80l蛋白酶抑制剂(100x)。破壁参数：Frequency:100200w60s， pause20s run 40s,5cycles破至菌体由浑浊变为澄清。加100l 20%TritonX100，冰上放置30min。（10) 将裂解液分入1.5ml离心管中，4离心12krpm×10min，取上清。（11) 吸取少量上清，加入蛋白电泳上样缓冲液，在沸水中煮3min。离心（12krpm,1min），取上清作SDS-PAGE电泳，检测表达情况。12.2 准备50%GST Sepharose 4Bslurry（1) 将原75%Glutathione Sepharose 4B的slurry弹至混匀。（2) 取677l原液/管，3krpm离心5min，弃上清。（3) 加500lPBS，颠倒混匀，3krpm离心5min，弃上清。反复5次。（4) 加500lPBS，颠倒混匀，配成50%Glutathione Sepharose 4B备用。12.3 GST融合蛋白的纯化（1) 在新鲜制备的细胞裂解液上清中加入20l 50%Glutathione Sepharose 4B，4，摇床上摇，反应30min60min。（2) 3krpm离心5min，弃上清。该Sepahrose上即结合了GST融合蛋白，（如果仅仅是做纯化效果检测或者蛋白表达量很高，可以只接合一次，如果要结合更多则接着往下做）（3) 在管中加入离心后的1.5ml新鲜制备的细胞裂解液的上清，4，反应30min60min。3krpm离心5min，弃上清。重复该步骤多次，就可以使Sepahrose上结合610ml 裂解液中的GST融合蛋白。（4) 在管中加入预冷的200lPBS（沿壁加入，小心勿剧烈，以免打断珠子与蛋白的联接）,轻晃悬浮珠子，将Sepharose洗涤一次， 3krpm离心3min，弃上清。（5) 反复三次（最后一次以小枪吸净珠子表面水膜，其余几次可以中枪吸，尽量吸净但不吸走珠子），即获得结合有GST融合蛋白的Sepharose。（6) 如果用于检测，在Sepharose加入1520l 1×蛋白电泳上样缓冲液，在沸水浴中煮3min。12krpm离心1min，取上清作SDS-PAGE电泳。（7) 如果用于pulldown测试，参见pulldown 步骤。14.体外蛋白质结合分析（GST-pull down）（1) 将结合有GST融合蛋白的Glutathione Sepharose 4B悬浮在500lNETN缓冲液中加入2030l含有其他蛋白的溶液，例如pET发酵的产物,细胞表达的产物等，同时采用结合有GST空蛋白的Glutathione Sepharose 4B平行操作作为对照。（2) 在水平摇床上，4晃动48小时。（3) 离心（3.6krpm,2min）。吸去上清，注意不要扰动底层的Sepharose.（4) 加入200l缓冲液H对Sepharose进行洗涤。注意加入缓冲液H时要贴壁加，不要直接冲击Sepharose，随后轻柔晃动，使Sepharose重悬即可。（5) 低速离心（3krpm，2min）吸去上清，注意不要扰动底层的Sepharose。（6) 重复步骤的洗涤23次。（7) 吸干Sepharose上方的水层后，加入2030l 1×蛋白电泳上样缓冲液，沸水浴4min，冻存于20。（8) 做SDS-PAGE和Western检测另一个蛋白。GST 试验流程（梗概）：（1） Glutathione 琼脂糖珠预处理。（2） GST融合蛋白挂柱：取适量GST-融合蛋白与10l已经处理过的beads置于1.5ml离心管中， 4, 摇床孵育过夜。（3） 孵育过夜的蛋白质与beads的混合液于4,500g离心5min，上清收集，观察融合蛋白是否饱和地挂在beads上，用1ml冰冷的细胞裂解缓冲液洗三次beads。（4） 把转染目的基因的细胞（5×106）裂解在0.5ml细胞裂解液里（含蛋白酶抑制剂），最大转速4离心20min,收集上清液。（5） 将细胞裂解液上清加入beads中，混匀，4，摇床3h。（6） 3h后，用冰冷的细胞裂解缓冲液洗三次。（7） 加15l 2×SDS上样缓冲液，煮沸5min. （8） SDS-PAGE,Western Blot或质谱仪分析。（9） 对照（GST）同样处理。13.pET融合蛋白的表达与纯化13.1 pET32a融合蛋白的表达（1) 将表达融合蛋白的质粒转入BL21DE3中。（2) 挑单克隆于3ml LA培养基中，37摇菌过夜，获得种子液。（3) 将种子液稀释于50ml 2×YTG中，使起始OD600为0.1。（4) 28,220rpm摇菌培养2小时。（5) 加入50l 100mM的IPTG,22摇菌培养6小时。（6）收菌，将菌液倒入大离心管，2管/50ml菌液，45krpm离心5min，弃上清。（7) 加入10mlNi-lysis buffer/管，重悬菌体。5krpm离心5min，弃上清。（8) 加入2mlNilysis buffer/50ml菌液，vortex重悬菌体。转移至5ml离心管。（9) 超声破壁破壁前，在细胞悬液中加20l 10mg/ml PMSF,80ul蛋白酶抑制剂。破壁参数：Frequency:100200w,60s pause20s run 40s,5cycles破至菌体由浑浊变为澄清。加100l 20%TritonX100，冰上放置30min。（10) 将裂解液分入1.5ml离心管中，4离心12krpm×10min，取上清。（11) 吸取少量上清，加入蛋白电泳上样缓冲液，在沸水中煮3min。离心（12krpm,1min），取上清作SDSPAGE电泳，检测表达情况。13.2 pET32a融合蛋白的纯化（1) 在新鲜制备的细胞裂解液上清中加入20lNi-NTA珠子 ，4，摇床上摇反应30min60min。（2) 离心3krpm×5min，弃上清。该珠子上即结合了pET32a融合蛋白，（如果仅仅是做纯化效果检测或者蛋白表达量很高，可以只接合一次，如果要结合更多则接着往下做）（3) 在管中加入离心后的1.5ml新鲜制备的细胞裂解液的上清，4，反应30min60min。离心3krpm×5min，弃上清。重复该步骤多次，就可以使珠子上结合610ml 裂解液中的pET融合蛋白。（4) 在管中加入预冷的200lWash buffer（沿壁加入，小心勿剧烈，以免打断珠子与蛋白的联接）,轻晃悬浮珠子，洗涤一次，离心3krpm×3min，弃上清。（5) 反复三次（最后一次以小枪吸净珠子表面水膜，其余次可以中枪吸，尽量吸净但不吸走珠子），即获得结合有pET融合蛋白的Ni-NTA。（6) 加入60lElution buffer，不必吹打，晃动洗脱蛋白。离心3krpmx5min，吸净上清，pET融合蛋即在上清中。（7) 如果用于检测，取12l样品，配成1520l 1×蛋白电泳上样缓冲液，在沸水浴中煮3min。离心12krpm×1min，取上清作SDS-PAGE电泳。（8) 如果用于pull down测试，参见pull down 步骤。GST pull down与IP之间区别：Co-IP 一般来说是证明两个蛋白的相互作用，但不排除通过第三个蛋白介导的间接相互作用。GST pull down 一般可用来证明直接的相互作用。GST pull down也并非都是原核表达来源，真核也可以表达作为饵蛋白GST pull-down实验是一个行之有效的验证酵母双杂交系统的体外试验技术,近年来越来越受到广大学者的青睐。其基本原理是将靶蛋白-GST融合蛋白亲和固化在谷胱甘肽亲和树脂上,作为与目的蛋白亲和的支撑物,充当一种“诱饵蛋白”,目的蛋白溶液过柱,可从中捕获与之相互作用的“捕获蛋白”(目的蛋白),洗脱结合物后通过SDS-PAGE电泳分析,从而证实两种蛋白间的相互作用或筛选相应的目的蛋白,“诱饵蛋白”和“捕获蛋白”均可通过细胞裂解物、纯化的蛋白、表达系统以及体外转录翻译系统等方法获得。此方法简单易行,操作方便。GST：谷胱甘肽巯基转移酶(glutathione S-transferase)GST:体外纯化蛋白，预测有相互作用的蛋白放在一起（EP管中）证明二者是否有直接相互作用。体外可能相互作用，但在体内不一定相互作用。IP：体内（细胞内证明）两种蛋白是否相互作用，但二者不一定直接作用，可能通过桥梁作用在一起（间接作用）
