1、ICS11.220CCSB52中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T54872023十足目虹彩病毒1感染检疫技术规范TechnicalspecificationOfquarantineforinfectionwithdecapodiridescentvirus12024-07-01实施2023-12-29发布中华人民共和国海关总署发布中华人民共和国出入境检验检疫行业标准十足目虹彩病毒1感染检疫技术规范SN/T54872023*中国海关出版社有限公司出版发行北京市朝阳区东四环南路甲1号(100o23)编辑部:(010)65194242-7530中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷*开本88012
2、301/16印张0.75字数21千字2024年1月第一版2024年1月第一次印刷印数1一500*书号：155175897定价16.00元本文件按照GB/T1.1-2020标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位：中华人民共和国深圳海关、深圳市检验检疫科学研究院、深圳质标科技有限公司、深圳技术大学、中华人民共和国武汉海关、中国水产科学研究院黄海水产研究所、中华人民共和国湛江海关、广西壮族自治区水产科学研究院。本文件主要起草人:贾鹏、温智清、吴江、
3、刘笠、张娜、王津津、郑晓聪、刘莹、邱亮、陈孝宇、童桂香、杨冰。十足目虹彩病毒1感染检疫技术规范1范围本文件规定了十足目虹彩病毒I(DIVl)感染的临床症状，规定了DIVl的套式PCR检测方法、实时荧光PCR检测方法和综合判定。本文件适用于DIVl感染的检测和诊断。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和实验方法GB/T18088出入境动物检疫采样GB19489实验室生物安全通用要求3术语和定义本文件没
4、有需要界定的术语和定义。4缩略语下列缩略语适用于本文件。ATPaSe:磷酸腺甘酶(adenosinetriphosphatase)CTAB十六烷基三甲基漠化胺(CetyltrimethylammOniUmbromide)Ct循环阈值(cyclethreshold)DIVl十足目虹彩病毒1(decapodiridescentvirusl)DNA脱氧核糖核酸(CleoxyribonucIeicacid)dNTPs三磷酸脱氧核糖核昔酸(Cleoxynudeotidetriphosphates)EB漠化乙锭(ethidiumbromide)MCP主要衣壳蛋白(majorcapsidprotein)PC
5、R聚合酶链式反应(PolymeraSeChainreaction)5仪器和设备5. 1冷冻离心机。5.2 微量移液器。5.3 PCR扩增仪。5.4 实时荧光PCR仪。5. 5水平电泳仪。6. 6凝胶成像仪。5.7超净工作台。5. 8二级生物安全柜。6试剂和材料6. 1水:符合GB/T6682中一级水的规格。7. 2阳性对照：感染DlVl的甲壳类动物组织，由海关总署指定单位提供。8. 3阴性对照：未感染DlVl的甲壳类动物组织。9. 4空白对照：无DNA酶的水。10. 5抽提缓冲液,按A.1配制。11. 6无水乙醇，分析纯，使用前预冷至-20o12. 770%乙醇。13. 8蛋白酶K(20mgm
6、L)06.9乙酸镇(IOmg/mL)。6.10TriS饱和酚(pH7.8),分析纯。6.11酚/三氯甲烷/异戊醇(25：24:1)。6.12三氯甲烷/异戊醇(24：1)06.13TE缓冲液，按A.2配制。6.14TBE电泳缓冲液,按A.3配制。6.15Taq酶：-20C保存，避免反复冻融或温度剧烈变化。6.16dNTPs:含dCTP、dGTP、dATP、dTTP各IOmmolL,-20保存。6.17IOXPCR扩增缓冲液,按A.4配制。6.186X上样缓冲液,按A.5配制。6.192X实时荧光PCR预混液，见A.6。6.20套式PCR弓I物，浓度10moL序列如下：DIVl-FlS-GGGCG
7、GGAGATGGTGTTAGAT-3,DlVl-RI：5-TCGTTTCGGTACGAAGATGTA-3,扩增DlVIATPaSe基因457bp的片段。DIVI-F2：5-Cgggaaacgattcgtattggg-SzDIVl-R2：5-TTGCTTGATCGGCATCCTTGA-3,扩增DIVIATPaSe基因129bp的片段。6.21实时荧光PCR引物和探针,浓度10moL序列如下：DIV1-142F：5，-AATCCATGCAAGGTTCeTCAGG-3DIVl-142R：5-CAATCAACATGTCGCGGTGAAC-3DIVl-142P：5-FAM-CCATACGTGCTCGCT
8、CGGCTTCGG-TAMARA-3,扩增DIVl的MCP基因142bp的片段。7采样7.1采样对象和数量采样对象包括凡纳滨对虾Penaeusvannameis罗氏沼虾Macrobrachiumrosenbergiis日本沼虾M.nipponenses脊尾白虾EXOPaIaemOnCariniCaUda、克氏原螯虾Procambarusclarkiis红螯螯虾CheraXquadricarinatuSs斑节对虾P.monodon、中国对虾P.Chinensis、日本对虾P.japonicUS和三疣梭子蟹PortUnUStritUberCUlatUS,应采集有临床症状的样品(参见附录B)。采样数
9、量和样品运送及保存按照GB/T18088规定执行。7.2样品前处理实验室取样检测时,仔虾采集除眼球和眼柄外的完整个体;幼虾至成虾阶段可采集鳗、肝胰腺、造血组织、附肢或血淋巴;亲虾的非致死检测采集血淋巴、附肢或粪便。所取样品组织置于离心管中，立即进行DNA提取或暂存于-20。C冰箱。实验室检测条件应符合GB19489的规定。8诊断方法8.1套式PCR方法8.1.1设立对照从提取DNA开始，每个步骤均需设立阳性对照、阴性对照、空白对照。8.1.2核酸提取取30mg-50mg组织样品，加入抽提缓冲液500L,充分研磨,37孵浴1h0加入20mg/mL蛋白酶K2.5L至终浓度100gmL,混匀后置于5
10、0C水浴3h,不时旋动。将溶液冷却至室温，加入等体积TriS饱和酚，颠倒混合10min,于10000r/min离心3min0取上层水相移至新的离心管中，加入等体积酚/三氯甲烷/异戊醇(25:24:1),颠倒混合10min,于10000r/min离心1min0取上层水相移至新的离心管中，加入等体积三氯甲烷/异戊醇(24：1),颠倒混合10min,于10000r/min离心1mio取上层水相移至新的离心管中，加入100L10moL乙酸镀，混匀后，再加入两倍体积预冷无水乙醇(-20)混匀，-20放置2ho10000r/min离心IOmin,弃上清。用70%乙醇洗涤沉淀2次，每次10OOOr/min离
11、心5min,倾去上清，沉淀于室温干燥30min0向DNA沉淀中加入50LTE缓冲液，-20C保存备用。可使用同等效果的商品化核酸提取试剂盒代替以上方法。8.1.3第一步PCR反应使用引物DIVl-Fl和DlVl-Rl配制PCR反应体系。在反应管中加入IoXPCR扩增缓冲液5L,dNTPs(10mmolL)1L,上游引物(10moL)1L,下游引物(10moL)1L,Taq酶(5UL)lL,DNA模板2L,双蒸水补充总体积至25L0瞬时离心后置于PCR扩增仪。PCR反应条件如下：95预变性3min;95变性30s,59退火30s,72延伸30s,共35个循环；72。C再延伸2min;4保存。第一
12、步反应结束后，可先将PCR产物进行电泳分析，若出现457bp大小目的条带，可直接进行测序分析，否则需进行第二步PCR反应。8.1.4第二步PCR反应使用引物DlVI-F2和DlVl-R2配制PCR反应体系。在反应管中加入IOXPCR扩增缓冲液5L,dNTPs(10mmolL)1L,上游引物(10moL)1L,下游引物(10moL)1L,Taq酶(5UL)lL,第一步PCR扩增产物2L,双蒸水补充总体积至25L0瞬时离心后置于PCR扩增仪。PCR反应条件如下：95预变性3mi95C变性30s,59退火30s,72延伸20s,共35个循环；72。C再延伸2min;4保存。8.1.5琼脂糖凝胶电泳用
13、TBE电泳缓冲液配制1.5%琼脂糖(含0.5gmL溪乙咤或其替代物)凝胶板。将其放入水平电泳槽，使电泳缓冲液盖过胶面。取5LPCR产物和lL6上样缓冲液混匀后加入样品孔，5Vcm电泳约40min后，置于凝胶成像仪观察结果。可采用同等效果的其他方法替代。8.1.6测序对457bp或129bp特异性PCR扩增产物进行基因测序，并将测序结果与参考序列(参见附录C)或GenBank数据库DIVl基因序列进行同源性比较分析。8.1.7结果判定8.1.7.1阳性对照电泳可见457bp和129bp特异性目的条带，阴性对照和空白对照无457bp和129bp特异性目的条带很邨日性对照、空白对照和阴性对照成立。若
14、对照组不成立，则实验无效，应重新提取核酸并更换试剂和对照样品重新实验。8.1.7.2被检样品经套式PCR检测有457bp或129bp特异性目的条带,且测序结果与参考序列或GenBank中DIVI基因序列相符，判定为套式PCR检测结果为阳性。8.1.7.3被检样品经套式PCR检测均未扩增出457bp或129bp特异性目的条带,或虽有目的条带但测序结果与参考序列或GenBank中DIVl基因序列不相符很胖J定套式PCR检测结果为阴性。8.2实时荧光PCR方法8.2.1设立对照见8.1.Io8.2.2核酸提取见8.1.208.2.3反应体系反应总体积为25L,包含2实时荧光PCR预混液10L,上游引
15、物(10moL)0.5L,下游引物(10moL)0.5L,探针(10moL)0.5LRoX参比染料1L,模板DNA2.5L,双蒸水10Lo可使用其他等效的荧光PCR试剂盒代替以上方法。8.2.4反应条件9530s;955s,58oC45s洪40个循环。可根据实际使用PCR试剂盒推荐的PCR反应条件做适当调整。8.2.5结果判定8.2.5.1当阳性对照出现典型S型扩增曲线且Ct值36,阴性对照和空白对照无Ct值且无扩增曲线，则阳性对照、阴性对照和空白对照成立。若对照组不成立,则实验无效,应重新提取核酸、更换试剂和对照样品重新实验。8.2.5.2被检样品无Ct值且无扩增曲线,可判定为实时荧光PCR
16、方法检测结果为阴性。若被检样品Ct值36且有典型型扩增曲线,可判定实时荧光PCR方法检测结果为阳性。8.2.5.3若被检样品36Ct值40,应重新提取核酸，调整实时荧光PCR反应的模板浓度后重新实验。重新实验后，若Ct值36则判定实时荧光PCR方法检测结果为阴性；若Ct值36则判定实时荧光PCR方法检测结果为阳性。9综合判定9.1符合下列条件之一，判定为DlVl疑似感染：一有典型临床症状；一套式PCR检测结果阳性；一实时荧光PCR检测结果阳性。9.2符合下列条件之一，判定为DIVl感染：一有典型临床症状，且套式PCR或实时荧光PCR方法检测结果为阳性；一无临床症状，且套式PCR和实时荧光PCR
17、方法检测结果均为阳性。附录A（规范性）试剂及配方A.1抽提缓冲液1mol/LTrisHCI(pH8.0)0.5molLEDTA(pH8.0)加水定容至高压蒸汽灭菌，4C保存。10rL2rL1000rLA.2TE缓冲液(PH8.0)1rolLTriS-HCI缓冲液(PH8.0)0.5molLEDTA(pH8.0)10rL2mL加入约800mL的去离子水,均匀混合。溶液定容至100omL,121C高压灭菌20min,冷却至室温后,4保存。A.3TBE电泳缓冲液（10倍浓缩液,pH8.3）Tris硼酸Na2EDTA2H2O加水定容至用5rolL的HCl调DH至8.3。108g55g2.9g1000r
18、LA.410PCR扩增缓冲液KCITrisCI(pH8.3,室温)MgCI2明胶500mmol/L100mmol/L15mmol/L0.1%A. 56上样缓冲液澳酚蓝100mg,加双蒸水5mL,在室温下过夜，待溶解后再称取蔗糖25g,加双蒸水溶解后移入溪酚蓝溶液中，摇匀后定容至50mL,加入NaOH溶液1滴，调至蓝色。A.62X实时荧光PCR预混液为商业试剂。主要成分为AmPliTaqGe）IdDNA聚合酶，UNG酶，含有dUTP的dNTPs,实时荧光PCR缓冲液。可采用同等效果的其他试剂。附录B(资料性)十足目虹彩病毒1感染B.1疾病名称十足目虹彩病毒1感染(Infeetic)nWithde
19、capodiridescentvirusl)是由十足目虹彩病毒I(DeC叩Odiridescentvirusl,DIVl)感染引起的新发甲壳类急性传染病。目前，世界动物卫生组织(OIE)已将该病列入OIE疫病名录。8. 2病原DIVl包含SHIV20141215和CQIVCNol两个分离株，两者基因组同源性达99.97%。2014年7月，在中国福建养殖的红鳌螯虾(CheraXqUadriCarinatUS)首次鉴定红鳌螯虾虹彩病毒(Cheraxquad-ricarinatusiridovirus,CQIV)02014年12月,从中国浙江发病的南美白对虾(PenaeUSVannamei)中鉴定出
20、与CQlV类似病原虾血细胞虹彩病毒(ShrimPhemOCyteirideSCentVirUS,SHIV)02019年，基于CQlV和SHlV基因组分析，国际病毒分类委员会(ICTV)认定两者为同一种病毒，正式将其命名为十足目虹彩病毒1。该病毒是虹彩病毒科(Iride)Viridae)十足目虹彩病毒属(DeC叩Odiridovirus)唯一已知成员,是一种二十面体、有囊膜、直径15Onm160nm、基因组约为166kb的双链DNA病毒。8. 3临床症状该病最适发病水温约为25T32T,患病虾表现为空肠空胃，肝胰腺萎缩、颜色变浅,停止摄食、活力下降等症状。其中，患病罗氏沼虾因额剑基部甲壳下的造血
21、组织被病毒侵染而呈现明显白色病变区域，即产业上所说的白头或者白点，部分患病凡纳滨对虾会出现体色发红症状。自然条件下,凡纳滨对虾和罗氏沼虾感染后累计死亡率为80%以上。实验条件下，凡纳滨对虾、克氏原螯虾和红螯螯虾感染后累计死亡率约100%。8. 4易感宿主现已确认DlVl易感宿主包括凡纳滨对虾、罗氏沼虾、日本沼虾、脊尾白虾、克氏原螯虾、红螯螯虾、斑节对虾和三疣梭子蟹。另外，从中国对虾和日本对虾中检出DlVl核酸，但其感染活性尚未明确。监测数据表明，各生长阶段的易感宿主对DIVl均易感,4cm-7cm幼虾最易感。B. 5分布中国养殖和野生的部分种类甲壳类动物以及印度洋野生的斑节对虾均有报到。附录C
22、资料性）DIV1扩增产物序列C. 1套式PCR扩增产物参考序歹IJ（DIVlATPaSe基因）1GGGCGGGAGATGGTGTTAGATGGGCAGTCATGGATGAACCAAATGCTGACGAAATCATCADIV1-F161GTTCGGGAACGTTAAAGGGTCTCACGGGAAACGATTCGTATTGGGeTCGAGATTTGTTCCDIV1-F2121AACGAGGAAAGGAAACGAAAGAAATTATACCCTTTTTCAAATTACACATGATTTGCAACA181AgcttccagcAATCAAGGATGCCGATCAAGCAACGTGGAATcgaatcag
23、gGttattccatDIV1-R2241TcgaaagtacattcaaacatgaaaacgattgccccgttgaatttgaagaaCaaatgaaac301AGAAAACATTCCCCATGGATAAAAATTTCACAGAAAAGATTCCCGAAATGGTAAAACCCC361TGGCTTGGTATCTTATTCAGAGATGGAAGACTATCAGGAAGTGTGAAATTGTAGAGCCAG421AGATTGTAACGGTAGCTACATCTTCGTACCGAAACGADIV1-R1C.2实时荧光PCR扩增产物参考序列（DIVlMCP基因）1 AagttgagcttggaagaagtCtggatagatTCAATCAACATGTCGCGGTGAACACATeCCDIV1-142R61ATACGTGCTCGCTCGGCTTCGGGGATAAGACCACCATTCACCCAACATTGCACATTTGACDIV1-142P121AgtgagggggcaacggcgatatcacttccaACCTGAGGAACCTTGCATGGATTTTTCTCTDIV1-142F书号：155175897
