1、微小RNA及其在恶性淋巴增殖性疾病中作用的探讨进展微小RNA及其在恶性淋巴增殖性疾病中作用的探讨进展【摘耍】在动植物基因组中广泛存在一类非编码蛋白的RN基因，产生长度大约为19-25个核昔酸的RNA,它们被命名为微小RNA(microRNA,IniRNA)O这是一类具有调整其他基因表达活性的小KNAo在生物的发育过程中发挥着重要作用。本文对这类基因的特征、生物学功能、产生与作用机制和在恶性淋巴增殖性疾病中作用的探讨进展作一综述。【关健词】miRNA；非编码RNA；恶性淋巴增殖性疾病ProgressontheResearchofMicroRNAand1.tsFunctionsin1.ymphoi
2、dMa1.ignanciesReviewAbstractP1antandanina1genonescontainanabundanceofsma11genesthatproduceRNAsofabout22nuc1eotidesin1ength,WhichwasdubbedasinicroRNA(miRNA).Thesenew1.yfOundendogenousRNAsmayparticipateinawiderangeofgeneticregu1atorypathwaysandp1.ayanimportantro1.eintheorganismdeve1.opment.Thispaperre
3、viewedtherecentstudiesandprogressonthecharacteristiesfunctionsandmechaniSmsofthemicroRNAs,aswe1.Iastheadvancesofresearchon1.yinphoidma1.ignancies.KeywordsmiRNA;non-codingRNA;Iymphoidma1.ignancies很多年来，DNA和蛋白质始终是基因组探讨中的主角，而RYA只是被看作来往于DNA和蛋白质间的信使而已。最近，越来越多的证据已清晰地表明，RNA在几乎全部动植物物种中扮演的角色远比我们早先料想的活跃。真核生物中存
4、在两种主要的非编码RXA(non-codingRNA),并发挥着重要的作用。一类为小干扰RN(Sma1.1.interferingRNA,siRNA),另一为微小RNA(microRNA,miRNA)oIniRNA是一种大小19-25nt的单链小分子RN,最早.被确认的miRNA是在线虫中的1in-4(1993年)1和1.et-7(2000年)2,3,它们参加调控线虫的发育时序(deve1.opmenttiming),由于它们的长度很短而且作用时间短暂，所以1.in-4和1.et-7一起先被称为时间小RNA(Sma1.1.tempora1.RNA,StRNA1.后来随着大量的miRNA被发觉，
5、对这些小分子RNA的基因序列、加工表达方式、生理功能等方面探讨表明，miRNA发挥着特别重要的、基因表达的调整作用，从一个全新的角度来相识基因及其表达调整的本质。2002年美国科学杂志评出的年度十大科技突破中，miRNA的发觉名列榜首。到目前为止已报道了在人类、果鸵、植物等多种生物物种中有将近1400个miRN被报道。现在除了1.in-4和1.et-7外，其他miRNA统一用miRY（#代表数字）表示，而相应的编码基因则用mir-#（#代表数字）表示O本文就miRNA特征和功能的探讨进展以及与恶性淋巴增殖性疾病的关系作一综述。微小RNA的特征miRNA广泛存在于其核生物中，与其他醺核甘酸相比，
6、主要有以下特征。（1）一般来源于染色体非编码蛋白区的一段，本身不具有开放读框（ORF）及蛋白质编码基因的特点，现已鉴定的miRNA没有一个与已知的表达序列标签（EST）匹配，说明它们是由不同于mRNA的特殊转录单元表达的4o（2）成熟的miRN长度一般为19-25nt,是由具有发夹结构的约70-9On1.的单链RNA前体经过切的（RNA）Dicer前加工后生成5,它们可以和上游或下游的序列不完全配对形成茎环结构,这种茎环结构参加了成熟miRNA的加工。（3）成熟的miRN5端有一磷酸基团，3端为羟基，定位于RNA前体的3端或者5端，且具有独特的序列特征。其5端第一个碱基对U有剧烈的倾向性，而对
7、G却有抗性,但第2-4个碱基缺乏U,一般来讲，除第4个碱基外，其他位置碱基通常都缺乏Ce（4）miRNA基因不是随机排列的，其中有一些成簇存在。多个miRNA基因共同转录成一个前体RNA,然后成熟的miRNA从这个前体上加工而来61.来F1.同一个基因震中的miRNA具有较强的同源性，而不同基因族中的miRNA同源性较弱。例如线虫中一组高度相关的miRNA基因mir-35-mir-41,集中簇生在2号染色体的Ikb片段上，共同转录成1个前体miRNA,然后加工形成7个成熟的miRNA,在胚胎和成虫早期均高度表达，而在其他发育阶段不表达。(5)多数miRNA的基因结构和功能在进化中呈现保守性，各
8、种miRNA都能在其他种系中找到同源体。约12%的miRN在线虫、果蝇、哺乳动物和植物中呈现保守性，经序列比对发觉，这些保守片段中的碱基差异仅为1.-2nt其中miR-kmiR-3kmiR-87在非脊椎动物和行椎动物中高度保守。对miRNA的表达和进化保守性的说明是：为数众多的miRNA构成了调整性RNA家族，通过与11RNA内的特定靶序列互补配对，参加这些基因的表达调控7(6)miRNA的表达具有阶段特异性和组织特异性，即在生物发育的不同阶段里有不同的miRNA表达，在不同组织中表达不同类型的IniRNA8。大多数miRNA的表达具有时序性，miR-3、miR-7基因只在果蝇胚胎形成时表达，
9、而miR-1.,miR-12的含量在果蝇幼虫阶段急剧上升，并在成虫期维持较高水平，同时在全部阶段都存在的miR-9和miRT1.的含量却急剧削减9小鼠胚胎中miR-I也呈阶段性表达，只在胚胎形成的阶段可以探测到其存在。miRN的表达具有细胞和组织特异性，Barte1.等10发觉在已经鉴定的16个miRNA中，有15个只在特定的植物组织中高水平表达。miR-1在人类和成年鼠心肌组织中特异性表达，在其他组织中检测不到：miRT7、miR-20位于He1.a细胞同一基因簇内，并在斑马鱼细胞中表达，但在鼠肾和蛙卵巢细胞中未检测到；miR-1和1.et-7都在成年果蝇中表达，而不在20-24小时的胚胎细
10、胞中表达，在He1.a细胞中却只测到1.e1.-7miRNA.在不同的细胞和组织中不同的发育时间中差异表达，显示了它们在限制个体发育中的特定功能。微小RA的功能目前只有极少的miRN功能被初步阐明，绝大部分miRN的功能（特殊是在哺乳动物中）还不清晰。miRNA在生物的整个发育过程中可能有以下重要的功能。个体发育的调控在线虫的发育过程中Iin-4和1.et-7呈生长阶段的特异性表达，通过对mRNA序列特异的反义抑制，对线虫幼虫不同发育阶段的过渡进行调控。1.in-4限制幼体早期发育阶段（幼虫1期到幼虫2期）的细胞分化，而1.et-7限制幼虫4期以后的阶段到成体的转换，诱导发育进展。Gary等1
11、1曾报道缺乏或过度表达Iin-4和IetT都会引起异时表型（异时是指祖先和后代种类在发育事务相应时间上互不相同的状况），即变更了发育过程中速度调控的过程。在植物miRNA的探讨中，发觉植物心皮工厂（CarPeIfaCtOry,car）突变株中3个miRNA的表达水平显著下降。植物心皮工厂是一个类似切酶的酶，参加植物的发育，其缺失突变株表现为胚胎和叶片发育的缺陷。试验结果提示，这种缺陷是由于缺少miRNA加工而造成的101.参加细胞分化和组织发育Iin-4、Iet-7、Ini1.1.4、mir-23和矮脚鸡（bantam）基因已被证明在细胞分化和组织发育中起重要作用。Chcn等13首次阐述了哺乳
12、动物中miRNA的功能，利用逆转录病毒作载体使miR-181在鼠科动物的造血祖细胞中异样地表达，然后用不同的条件处理这些细胞，分析B淋巴细胞和T淋巴细胞，发觉B淋巴细胞量加倍，而T淋巴细胞不受影响。这示意miRNA可能在鼠类和人的细胞发育分化中起着关键的作用。双侧不对称性（biIa1.cra1.asymmctry）是很多生物神经系统发育过程中的正常现象，然而对这种机制现在了解得还很少。Johnston等14发觉，在线虫神经细胞中有一种miRMA（此种miRNA的基因被称为1.sy-6）限制着左/右神经细胞的不对称基因表达(cog-1是1.sy-6miRNA靶基因)，这可部分说明神经系统功能的非
13、对称性。调控基因的表达人类基因中有超过20%的基因是由被miRN所调整的15,一些miRNA通过调整下调肥mRN的表达16。对IinY和1.et-7的探讨表明，miRN的主要功能是进行转录后调控(Post1.ranscriptiona1.rcgu1.a1.ion)OmiRNA可以通过两种机制中的一种调整靶基因的表达，其中之一是结合到靶mRN3UTR,抑制其翻译：二是像siRNA作用一样结合到靶上并降解靶mRN17miRNA可以作为触发RNA干扰(RMi)的分子18参加细胞增殖19、死亡20、细胞凋亡21和脂肪代谢22。miRNA还可能与转座的抑制、基因重组有关，可能参加转录和转录后水平的基因表
14、达调控，因此，认为miRNA可能和高等真核生物中调整基因表达的转录因子一样重要。miRNA的加工机制和作用机制加工机制据体内外试验探讨表明，miRNA的生成至少须要两个步骤：第一步在细胞核内，将长的内源性转录木(Pri-miRNA)加工为70-9Ont的茎环的二级结构的前miRN(PreFiRNA),执行此过程的酶是RNaSen1.家族中一员DrOSha,其作为核心核酸随执行核内miRNA前体加工的起始23,24；其次步在细胞质中，将茎环的二级结构前体加工为成熟的miRNA,执行此过程的酶为RNaSe1.n超家族中另一员切酶(dicer),后者是一种ATP依靠的核酸内切丽。亚细胞定位探讨证明，
15、这两个生物过程分别局限于细胞核和细胞质内，因此细胞中确定还存在一转运体系，将pre-miRN从细胞核运输至细胞质。由此可见，miRNA的表达可从上述三个方面进行调控25。Pre-miRNA在被dicerargonaute曳合物特异性识别，并剪切成22nt左右的单链小RNA,miRNA是pre-miRN茎中的一个臂。DiCer可以剪切pre-miRN5端的一个臂，也可以剪切3端的一个臂或者是同时剪切两个臂71.Dicer及其同源物DCRT是一类多结构域的RNaseIII样蛋白，对双链RNA或茎环结构RNA进行剪切，产生长度约为22nt、5末端为单磷酸基、3末端为羟基的RNA产物26。作用机制Am
16、bros17探讨发觉1.in-4和Iet-7与靶mRNA的3UTR部分互补结合，从而抑制了蛋白质的合成。在植物中探讨发觉miRNA和靶mRNA完全互补最终导致了靶mRN的降解12。而在动物中miRNA与靶mRNA通过不严格的碱基配对，抑制了mRNA的翻译27,而此时并不诱导mRNA的降解。然而，有时状况并非完全如此：在动物中，这种碱基是否严格配对将确定基因缄默方式，假如miRNA和靶mRNA完全互补它就能进入RNAi途径并且引导靶mRN降解而不是抑制翻译28在拟南芥(arabidopsis)中即使miR-JAW和其靶序列不完全配对，它也能够通过降解mRN来调控转录因子TCP家族的五个成员29,
17、其详细机理I=I前还不清晰。miRNA与SiRNA的联系和区分从miRNA很简单联想到另外一种外源性的RNA小分子小干扰NA(siRNA),miRNA与siRNA之间存在很多相同之处：在加工方面，siRNA与miRNA从双链前体加工到成熟的22nt左右的小分子RNA,都是dicer产物，因此具有dicer产物的特点；在功能效应方面，二者的生成都需argonaute家族蛋白的存在，同是RISC(RNAinterferenCeSPeCifiCityCOn1.P1.ex,RISC)的组分，因此在SiRWV和miRNA介导的缄默机制上有重叠。但miRNA在以下儿个方面与siRNA不同:miRNA是细胞
18、内RNA的固有组分之一,而siRNA是在RNAi生成过程中形成的中间体，也即SiRM是在病毒感染或人工插入dsRN后诱导而成的：dicer酶对两类RNA的加工过程不同,miRNA为不对称加工，仅来自含茎-环结构RA前体的一侧臂，剩余部分很快降解，而siRNA是对称来源于双链RNA的前体的两侧传；成熟的miRNA是以单链形式存在的，而成熟的SiRNA是双链形式存在。虽然推想miRN具有双链RNA前体，但是在Northern印迹试验中未检测到双链RNA前体，可能是因为前体存在的时间特别短暂；SiRMA与靶11RNA完全互补配对结合，引导核糖核酸防熨合体RISC的形成，使它能精确特异地在siRNA互
19、补区域里剪切，导致目标mRNA降解。miRNA与靶RNA并不完全互补，存在错配现象，引起翻译抑制，或者其他一些遗传调整，并不导致目标RNA的降解SiRNA的初序列有一个核甘酸突变，就会影响到RNAi的缄默效应，而miRNA是不能完全识别的，也不会影响到miRNA途径的调整效应：miRNA在转录后水平和翻译水平起作用，而siRNA为转录后水平调控，SiRNA介导靶mRNA的位点特异性裂解，而已知的miRNA介导3UTR互补的转录后翻译抑制。随着探讨的深化，这种区分变得模糊不清。例如，在线虫中，siRNA像miRNA一样，有可能是单链的30。另外,在线虫和He1.a细胞中，1.et-7基因的miR
20、NA起着和siRNA相像的作用，也出现在RISC蛋白曳合体中。当它遇到完全配对的目标RNA时，可导致目标RNA剪切28。探讨认为，假如与目标RNA存在完全配对，RISC蛋白复合体介导RNA剪切，假如是不完全配对，则是翻译抑制，机制的选择可能主要或完全依靠于与靶RNA的互补程度31,32。MicroRNA与恶性淋巴增殖性疾病miRNA在恶性疾病中的作用引起很大的关注，认为miRNA在肿痛发病中起重要作用33。Ca1.in等34探讨发觉50%以上的miRNA基因定位于与肿痛相关的区域或脆性区域。最近耶鲁高校癌症中心的JOhnSOn等35探讨发觉，一个与肺癌有关的染色体区域上的1.et-7是癌基因R
21、aS表达的一种调整因子。1.et-7通过与Ras基因结合来调整Ras,并抑制Ras蛋白的翻译，在肺癌组织中，1.et-7表达低于其他正常肺组织，而Ras蛋白则明显增加。在恶性淋巴增殖性疾病中，miRN干脆参加染色体的缺失，大约50%的慢性淋巴细胞白血病（C1.1.）中有染色体13q1.4的缺失，miRT5和miR-16基因定位于染色体的13q1.4位置上，在C1.1.病人中发觉这两个基因的表达有缺失或下调现象存在36。近来Eis等37探讨发觉在一些B细胞淋巴瘤，包括充满性大B细胞淋巴痛（D1.BaI中miR755的拷贝数较正常循环中B细胞高10-30倍。活化B细胞型D1.BC1.的miR-15
22、5拷贝数明显高于生发中心型D1.BC1.,且前者具有较差的预后，可以认为miRT55的表达量可以作为B细胞淋巴瘤的诊断和预后指标。我们运用Northern印迹的方法在G519、HRc57、RCK8、BEVA、0C1.-1.Y8和MD901的6个B细胞淋巴瘤细胞系中均检测到miR-28的表达，未发觉表达差异。Ca1.in等38运用基因芯片技术对C1.1.样本中数百个miRNA前体和miRNA进行检测，依据结果将C1.1.分为两组，且与C1.1.疾病状态和ZAP-70的表达有关，认为miRNA的表达与此类白血病的生物学和临床行为亲密相关。展望与前景近年来大量的miRNA被发觉，使得人们对RNA的功
23、能有了一个全新的相识，同时也为人们供应了一种全新的角度来相识生物基因和基因表达调整的本质。尽管在以miRNA为代表的非编码RNA探讨方面已经取得了突破性的进展，已经有大量的非编码RNA被发觉，它们的功能也是特别多样和重要，但是，毫无疑问细胞中还有大量的非编码RNA未被我们发觉，确定还有很多非编码RNA形式的功能有待我们去探究。当前人类基因组安排已经基本完成，全面探讨不同细胞在不同时期的全部非编码RNA的种类和功能成为后基因组时代的必需和必定。随着探讨的深化，miRNA将在生命起源、早期进化、基因困难性和疾病原理等方面产生更为重要的影响。【参考文献】I1.eeRC,FeinbaumR1.,mbr
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