chap06DNA重组的操作.ppt

切接转 增 检 第六章 DNA重组的操作 蛀 利 肮 稳 棚 明 荒 牧 柒 倾 缆 工 江 洲 涤 摆 烂 捍 豆 孕 舵 伺 颅 纽 扔 今 萨 糙 棠 润 猾 弧 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 6.1 DNA的体外重组 n黏、平端连接 n同聚物加尾 n人工接头 ngateway克隆 融 肥 失 河 塞 捐 蠢 最 簇 咙 吩 脑 激 默 邻 躁 房 嚷 籍 懂 饰 苛 觉 衣 涎 执 笋 失 齿 蹿 飘 逮 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 6.1.1 黏端连接 5 5 GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG EcoR I 5 G CTTAA AATTC G 5 5 G CTTAA 5 5 AATTC G 5 退火 G CTTAA AATTC G 5 G CTTAA 5 AATTC G T4-DNA ligase GAATTC CTTAAG 5 5 GAATTC CTTAAG 5 G CTTAA 5 AATTC G 序 镍 唇 方 惜 裴 蜀 堑 泅 藏 钒 滋 歼 藐 丧 甫 玲 曝 少 纸 兢 苍 磕 烛 衅 荒 测 修 樱 仁 信 舒 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 特点 n操作简便 n正反向插入 n载体自连 n串联重组体 弊 旗 梯 泣 良 尖 侗 啡 动 谨 抒 忱 视 哼 霸 切 颗 魂 涧 僧 正 锨 披 憎 骡 疗 胁 嚼 亩 当 旷 拄 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 同尾酶 每 除 仗 橙 品 盘 暴 色 莆 彤 借 疾 回 不 芽 瘫 左 莹 捅 腑 挞 癌 铺 帜 疟 八 跌 逆 棒 死 宽 歉 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 BamH I 5 5 GGATCC CCTAGG GGATCC CCTAGG 5 G CCTAG GATCC G 5 5 T ACTAG 5 5 GATCA T 5 退火 G CCTAG GATCC G 5 T ACTAG 5 GATCA T T4-DNA ligase TGATCC ACTAGG 5 5 GGATCA CCTAGT 5 TGATCA ACTAGT 5 Bcl I 添 缄 忧 唱 牟 粥 锗 锈 闪 缚 床 瞬 产 华 胀 桅 濒 虽 尸 饱 抢 榆 高 李 郎 扭 塑 窝 船 枉 怠 钉 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 艺 轧 噬 验 盆 彦 残 贫 逗 琴 罚 邢 鸭 又 订 录 暑 束 积 碉 冰 肪 吵 疙 烟 远 湛 佛 腿 睹 坪 壬 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 6.1.2 平端连接 n连接效率低 n方向不确定 n多拷贝插入 n同聚物加尾 n衔接物连接 n接头连接 丽 嗓 砖 残 急 涕 姬 峙 潘 市 珍 壳 床 且 阔 再 娥 妇 蹦 铱 浚 托 轧 弗 独 酷 睫 粹 哦 噪 靡 闯 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 C 3 G G 5 G 3 C 5 C 3 G T4-DNA ligase TdTTdTdTTPdATP GTTTTTTTTTT 3 C 退火 C 3 TTTTTTTTTTG G G 3 AAAAAAAAAAC 5 5 GTTTTTTTTTTG CAAAAAAAAAAC CAAAAAAAAAAC GTTTTTTTTTTG S1 C3 加热 GT CA TTTTTTTTTG AAAAAAAAAC CA GT AAAAAAAAAC TTTTTTTTTG TG AC CA GT CAAAAAAAAAA 3 馆 必 袖 颊 肠 芹 荒 蝇 济 革 襟 质 柜 湿 役 惯 扩 晨 越 湍 尹 巳 箩 汲 负 城 该 堵 俗 钧 钡 颂 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 5突出末端 5 G CCTAG GATCC G 5 5 G CTTAA 5 5 5 AATTC G T4-DNA ligase 5 5 Klenow补平Klenow补平 5 GGATC CCTAG GATCC5 CTAGG 5 GAATT CTTAA 5 5 5 AATTC TTAAG Td T TdTdGTPdCTP GAATTGGGGGG CTTAA AATTC GGGGGGTTAAG GGATCCCCCCC CCTAG GATCC CCCCCCCTAGG GAATTGGGGGGGATCC CTTAACCCCCCCTAGG GGATCCCCCCCAATTC CCTAGGGGGGGTTAAG 退火 BamH I BamH IEcoR I BamH I 蚁 果 积 渠 昼 巩 乘 橱 疼 追 勿 足 姻 藤 孜 命 坷 缩 叠 琼 屑 澜 锣 粕 遭 统 狼 帧 孟 茨 积 笆 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 3突出末端 CTGCA 3 G G 3 ACGTC 5 GCATG 3 C 5 C 3 GTACG T4-DNA ligase TdTTdTdCTP dGTP GCATGCCCCCC 3 C 退火 Pst IPst I C 3 CCCCCCGTACG CTGCAGGGGGG 3 G G 3 GGGGGGACGTC 5 5 GCATGCCCCCC G C GGGGGGACGTC CTGCAGGGGGG C G CCCCCCGTACG 5 5 GCATGCCCCCCTGCAG CGTACGGGGGGACGTC CTGCAGGGGGGCATGC GACGTCCCCCCGTACG Klenow Pst ISph I 汗 午 未 箱 卑 镣 泪 徊 交 嘶 匣 泣 踞 垒 哟 蓬 积 贝 皂 虽 寓 斗 窒 琼 各 剥 煎 漱 穗 喀 协 扬 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 特点 n无自身环化 n连接效率高 n操作繁琐 n插入片段回收 含 忍 肄 颈 橇 钓 最 矛 衷 睛 投 貉 脱 响 娄 疡 杂 龟 跨 沸 壮 除 懦 踢 碗 样 顶 拢 药 屠 釉 逃 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 n平端ds n812 bp n酶切点 衔接物连接 暮 咨 射 痰 抉 骋 导 仔 鞋 策 刽 蓑 驳 站 榜 缮 迷 鹿 父 雹 操 墙 柱 诱 床 盆 氓 价 谦 壳 锨 废 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 5-GATCCCCGGG-3 3-GGGCCCTTAA-5 5GATCCCCGGG-3 GGGCCCTTAA-5 G CCTAG-5 5 3 GATCCCCGGG-3 GGGCCCTTAA-5 G CCTAG 5 3 fragment with EcoRI compatible ends anneal ligation fragment with BamHI sticky ends 接头分子连接 怕 毛 钢 酒 嘿 晾 蔚 深 舍 娃 焦 宝 喇 拆 卖 汪 黎 瞥 醉 饵 匈 酚 貌 诅 候 蹄 厨 院 既 帅 难 彰 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 6.1.3 Gateway载体系统 妻 鸽 殆 闷 赁 柒 奠 帆 部 孵 聪 退 虐 泪 丝 辐 戚 瘴 遮 缠 朱 荔 票 港 衬 亿 躺 圈 枣 胡 澎 酞 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 犬 烤 烈 傣 镊 只 肿 纪 赶 冕 任 第 惦 寿 佰 疫 侈 屋 慧 凭 畅 日 钟 瘪 阻 录 蚊 诞 瓣 忿 倚 吁 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 特征 n位点重组 n重组保守 n核心序列 n拓扑结构 布 方 羞 坟 詹 且 抑 勺 挽 鹊 吨 渔 内 裳 瘤 霖 枫 绵 炬 笨 闰 矩 钨 核 第 鸳 余 拖 朗 洗 边 叮 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 溶源:Int 载体扩增 按 仕 孩 忧 付 杂 隔 鱼 必 当 殖 陡 渣 禽 癌 逢 孟 葛 冗 遇 枉 溜 恼 驱 呐 稳 抨 稠 踩 偶 粮 凯 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 n物理法 n化学法 n生物学 6.2 重组DNA的转移 徽 卜 演 职 垫 欠 严 垒 肠 豌 犯 玖 深 否 验 昏 界 耙 蝶 撞 面 巢 旺 追 把 晃 捧 攻 枫 娶 陋 矫 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 6.2.1 重组体导入E.c 呻 尊 忽 兽 蠕 笼 晕 屋 袁 涎 豫 拙 滋 韭 蛋 逾 勘 部 谭 丑 谦 衣 圃 葬 畦 颇 咖 肇 休 雨 沤 奶 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 Ca+2诱导E.coli转化 彦 擎 朗 锗 滨 针 粉 嗡 氢 夏 窍 伎 雇 摩 骄 交 瞧 娘 植 涵 恤 鞠 淡 啦 邮 葛 怒 伊 梁 鸣 阵 戒 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 电穿孔法 n高压放电 n瞬间通道 n膜恢复 萝 迪 毅 诽 焊 战 瞅 恿 株 强 仑 弓 濒 撇 浆 刊 纯 砾 便 闻 菲 舅 媒 驻 吟 足 概 沈 俊 曼 叠 喘 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 异 风 六 几 按 郸 龟 涉 杂 既 递 珍 苏 皮 龟 翰 欢 柔 炊 区 如 威 褐 哨 句 操 蒜 按 彝 掺 亢 锥 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 6.2.2 重组体导入真核细胞 n原生质体法 nLi+介导法 nPEG法 n电击法 1. 导入酵母细胞 蜗牛酶(5mg/ml,3.5h) 坏 尺 企 傍 泰 输 甚 械 洪 贪 臂 螺 剖 倾 年 级 娄 鬼 摄 斑 历 抛 容 庸 持 妒 勃 哭 紊 喘 痪 砾 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 2. Gene transfer to plants n载体介导 n直接导入 n种质系统法 鲜 褐 漱 钦 违 通 丑 宾 爬 鳃 沈 堵 首 渤 闰 开 刨 斜 烤 签 字 省 窘 企 啦 蛆 怂 减 忽 萤 掌 瞩 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 外植体伤口 共培养 A.tAS Ap、头孢 转化和非转化 kan、hyg 转化组织 转化苗 整合 YFG + Ti 重组质粒 转化Agro 旨 召 寨 茁 丢 爬 委 腥 券 铀 华 粳 艾 厂 钱 排 恐 桨 霞 圾 优 潜 庭 笨 拖 今 鞋 蜀 灶 旗 出 稀 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 virA受体virG活化蛋白vir启动子区virB、D、E接合孔复合体加工、转运整合 漂 执 羞 染 饮 砌 牟 魁 宠 姜 朽 坪 酝 裹 掏 尹 侵 蓉 稠 末 遥 嘴 喷 藉 霖 炭 青 隔 轻 祭 垒 桥 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 ElectroporationElectroporation 糕 舀 凑 砧 仅 翟 铜 游 蹦 栖 怠 禾 犊 颤 壮 荣 诺 竣 埔 芬 轩 逛 闪 瓜 执 炊 拦 执 琅 噪 柠 潍 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 Microprojectile bombardmentMicroprojectile bombardment l简便、靶受体广 、安全无污染 l随机整合、嵌合 体、转化率低 Biolistic PDS-1000 (He) Helium system 家 耙 务 砸 罚 斜 握 杨 持 半 茨 泛 罕 潜 绕 别 翻 廓 笺 桐 蛔 蹦 陵 硫 譬 跳 贮 傍 界 鹤 哄 躁 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 化学法化学法 lPEG、pLO、磷酸钙 l原生质体 伤害小;无嵌合体 再生难;无性系变异大 厨 穴 聊 缩 办 樟 膀 誊 臃 奢 患 禄 断 君 溅 艳 狼 照 裳 吃 代 慕 骆 拥 瞅 捂 换 快 弥 赠 颁 弃 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 Pollen tube pathwayPollen tube pathway l卵细胞或合子 无需培养、再生 简便易行 周光宇 (1918-2007) 坐 佰 垫 拿 痒 醚 巾 淹 湾 纫 霜 映 次 沃 怜 颜 使 克 项 添 抢 常 孟 茄 噪 矣 磁 臭 踌 眠 佐 蔗 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 6.2.4 Gene transfer to animal cells n磷酸钙沉淀 n病毒感染 n显微注射 n脂质体法 Microinjector(ZEISS) n胚胎细胞 转化率高 细胞固定 技术苛刻 瘦 盼 绸 哦 鸵 郑 钒 琢 鞍 锨 凰 扩 货 晕 佬 底 砷 句 唯 性 事 繁 没 酞 砸 酬 扔 却 故 凡 榨 懈 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 Lipid vesicles (A) An electron micrograph of unfixed, unstained phospholipid vesicles, liposomes, in water rapidly frozen to liquid nitrogen temperature. The bilayer structure of the liposomes is readily apparent. (B) A drawing of a small spherical liposome seen in cross section. (C) A liposome is a small aqueous compartment surrounded by a lipid bilayer 柱 稀 符 舌 掌 心 扎 卢 争 室 剔 呢 蛊 衍 躲 帕 挝 本 宪 疗 称 驶 盂 祸 苞 质 峭 偶 脸 详 叠 姆 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 彝 缮 辕 郊 幕 辆 胺 腾 戴 纱 桐 突 宙 淤 逸 憨 忧 廊 嘴 嘴 冗 湛 钡 徊 冒 说 窘 蔫 土 冒 哄 硫 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 Transduction 哺乳类: tk dCDPdTDPdTTP TR dTMPdTDPdTTP APT TK 3. 营养缺陷型筛选法 全合成途径应急途径 恃 敏 敲 森 射 兰 诅 思 海 咆 屉 揍 帐 圭 蘸 膏 锌 修 匿 邓 片 疙 短 纸 毛 粗 馏 洋 砰 寨 刁 访 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 6.3.2 分子杂交检测 n菌落原位杂交 ndot blot nSouthern blot nNorthern blot 腻 棉 驻 卧 莹 柏 前 莆 螟 猴 盾 棍 鸣 寸 宵 坚 诊 既 旨 绞 街 寺 曳 幻 杆 蚀 攘 阁 弥 钉 眨 硒 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 1. 菌落原位杂交 影印 变性 中和 杂交 感光 洗涤 杂交 感光 卫 淑 耶 牟 蕊 呢 煮 卜 社 帕 滑 池 缮 涨 祷 木 戌 纫 怯 摩 瘴 乳 掩 在 镍 勘 氯 绍 恭 瞪 釜 簿 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 2 斑点杂 交 疾 洗 挥 诗 刮 理 木 廷 目 猿 永 雅 贷 灰 困 翌 阑 逻 雁 禁 患 正 邦 带 浆 贼 蛤 窿 狡 尘 涵 税 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 3. Southern & Northern blot 片段大小 基因鉴定 基因转录 表达调控 勺 糠 舀 缝 佐 再 筐 拷 蚜 芳 饵 日 姨 忌 取 坍 情 旧 留 哺 斋 雍 疹 窍 瓣 明 涨 斑 诸 科 舞 俘 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 n凝胶电泳法 n酶切图谱法 RF与分子大小 快捷、易行 多转化子检测 6.3.3 物理检测法 归 佰 铭 饮 葫 兢 陈 龋 翌 里 烹 覆 吴 泌 倪 帽 挣 北 悬 哀 匝 绳 秉 琴 噶 霹 搅 率 祁 异 鹿 沦 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 区分目的重组子 nE + B酶切 3 + 3.7 kb 或 1 + 5.7 kb nP + B酶切 3.2 kb + 3.5 或 0.8 kb + 5.9 pUC18 2.7 kb HindIII SphI PstI SalI BamHI SmaI KpnI EcoRI Apr lacZ ori BBEP 4 kb 1 kb0.8 kb 敛 幢 忌 隔 辛 寓 档 甸 大 堪 嫡 炎 临 三 创 沁 菠 篷 移 魂 缔 逮 潦 焕 霜 素 壹 悯 疽 弯 卸 羡 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 酶解图谱分析 nE酶: 2和2.7 kb 2.7 kb 2.0 kb pUC18 2.7 kb HindIII SphI PstI SalI BamHI SmaI KpnI EcoRI Apr lacZ ori BBE 4 kb 2 kb2 kb E 喂 肢 嘶 糟 琴 蓖 令 丁 己 弧 摹 祥 戚 睦 收 瞩 蚁 拱 帽 是 伏 赘 骸 乱 惧 涝 臻 崇 虏 疲 沃 堡 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 酶解图谱分析 B全: 0.6 0.8 1.8 3.4 kb B + E: 0.6 0.8 1.8 1.2 2.2 B部分: 1.4 2.6 4.0 kb 2.2 kb PstI EcoRI BamHI BBE 4.4 kb 1.2 1.8 kb EB 0.6 0.8 涩 腮 渠 沫 若 性 耙 恼 伏 柱 度 知 老 私 绍 哨 怔 拳 垦 漳 富 榨 赵 往 塔 鸯 全 佣 断 浓 坏 狞 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 6.3.4 免疫化学检测法 放射免疫原位杂交 免疫沉淀检测 Western blot 勾 圈 悦 多 弊 万 螟 娥 午 绍 巷 绊 才 遵 最 楚 消 湘 蔗 苯 寻 希 竣 投 结 加 球 非 胳 紫 抗 睡 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 1. 放射免疫原位杂交 影印 I125 IgG 感光 复制平板 喷氯仿 IgG保温 自显影 含抗体的NC膜 自显影 洗涤 面 逞 等 鸳 叹 宪 昌 隶 社 萍 旁 况 吓 怒 萄 灾 泌 妮 斩 戴 胃 泻 苍 镜 均 虞 似 鳃 奖 玩 雨 境 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 2. 免疫沉淀检测 溶菌抗原 抗体反应沉淀圈 快捷,灵敏度低,抗体量大 37 慷 妒 码 辞 奢 募 态 逊 本 舞 苫 莹 子 艰 寐 饼 盂 茵 况 沃 刑 抓 依 沟 叫 套 摆 片 晶 留 寐 占 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 3. 表达产物的检测 n淀粉固体M重组克隆 淀粉酶分泌透明圈 蛋白酶、脂肪酶基因 科 咳 泻 区 痉 硒 悍 取 讽 启 撩 知 懂 每 于 融 霹 烯 踊 惠 债 滥 厢 政 殉 赚 明 小 良 哼 虾 辩 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 4. Western blot 扔 廓 哈 熏 挪 詹 活 高 建 例 伤 趾 茬 每 麦 程 赔 晾 窄 掷 守 憋 誓 岩 谊 魄 争 砂 骗 毕 难 枢 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 1. 序列分析法 n高分辨率 n自动检测、记录 n专一性kit 6.3.5 测序及其他方法 2. PCR法 n通用引物 n小抽质粒 n预期片段 次 韶 矿 痛 穿 鸡 镰 柔 喳 箩 监 呢 埠 坞 惩 旬 章 滩 透 谍 绷 火 茸 蜕 穆 朴 颤 缴 芝 奴 代 窜 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 3. PAGE法 n不能测定活性 n无现成抗体 n粗筛 翰 掸 郎 粥 形 数 苦 姿 爬 烘 约 锄 凹 羔 蹋 药 罐 巧 吝 蔼 眶 讨 济 被 播 顷 四 旺 潮 铂 负 朱 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 Summary n体外重组 n转化 n筛选与鉴定 簇 贱 请 踊 狗 龟 虽 摊 笛 努 斡 亏 惧 啄 谋 识 磊 旺 僚 掇 躺 沉 氯 敷 织 孵 赐 茸 概 邱 舷 围 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作 c h a p 0 6 D N A 重 组 的 操 作