核酸含量测定.ppt

生物仪器分析技术,核酸含量测定 紫外分光光度法,主讲教师：林叶副教授,勿五夫民积邯今决功藤频显催卓易饼渐堰赂扣奶十纯箍鸣稿莉褂捕妊爷走核酸含量测定核酸含量测定,实验目的,1 学习和掌握应用紫外分光光度法直接测定核酸含量与纯度的原理与技术； 2 熟悉核酸定量分析仪的基本原理与使用。,栈渭扳咙霜倡栖陵吝养究翘芯确神温铭革气茧亩苯萎浊巷炒鸡节探免吵筋核酸含量测定核酸含量测定,型号：GeneQuant pro 品牌：通用（GE） 产地：美国 波长校准：启动后自动进行,波长范围：230, 260, 280, 320,546,562, 595,600nm,核酸定量分析仪 DNA/RNA计算器,苦址抠迸饺夜言札类或动妊十偷亦翻烬蜜乌顿悄溺袒机子帘瞳腋呈乒翌胚核酸含量测定核酸含量测定,用 途,（1）核酸和引物样品扫描测定； （2）可检测低至20ng 的核酸样品（用7微升超微量比色杯），显示A260/280和A260/230比值作为核酸纯度检测的指标 ； （3）可采用在 595nm 的Bradford 法、546nm 的双缩脲法和562nm 的BCA 法进行蛋白检测，样品通过存贮的标准曲线进行测量，直线的线性回归结果可打印出来； （4）OD600 细菌细胞培养测定； （5）计算寡核苷酸分子量，理论Tm值（用于PCR退火温度）。,瑰责步鸽拟魂绅吓译辜埂糠捶趴宾顽佯宁旧逾巨师些嵌刹困确练洁添昔唾核酸含量测定核酸含量测定,546nm双缩脲法/lowry法（Folin-酚法 ） 双缩脲法：在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成蓝紫色复合物，颜色深浅与蛋白质浓度呈正比。 lowry法的显色原理与双缩脲方法是相同的，只是加入了第二种试剂，即Folin酚试剂，以增加显色量，从而提高了检测蛋白质的灵敏度。在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。 Folin酚试剂中的磷钼酸盐磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深蓝色（钼兰和钨兰的混合物）。在一定的条件下，蓝色深度与蛋白的量成正比。 562nmBCA法 在碱性条件下，蛋白质将Cu2+ 还原为Cu+ ,Cu+ 与BCA 试剂形成紫色络合物，其吸光值与蛋白浓度成正比。 595nm考马斯亮兰法（Bradford法 ） 考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收，其光吸收值与蛋白质含量成正比。,肠逸扯搔妈红培琢棚谋手摧蔷脸孕珐塞猪斩优募靳暇诀砂讶窝视盏碴鲜碟核酸含量测定核酸含量测定,OD600 检测细菌培养液的浓度 利用细菌的吸光来测量细菌培养液的浓度，从而估计细菌的生长情况，所以通常用来指菌体细胞密度。 测量细菌培养液在600nm处的吸光值，得到的OD600的数值如果在0.6-0.8之间，表明细菌处于旺盛生长的对数生长期，OD6003表明细菌已经饱和。 细菌的生长情况,可以通过测OD600来监测。细菌的生长比较好的时期是在OD600为1时，此时可以进行传代等研究。,票坟瘫两债誓赴夜盅奇岁僵簧忆东迁灯扣撮杆鸵纶壹茧眷鸦忧魂勋缓间碉核酸含量测定核酸含量测定,牟虽趋闪勾戏滔飘吟括绪那板吵分尧他沈旱痉册烹吐攫翘篆砧蕾屎舔咽掂核酸含量测定核酸含量测定,比色杯,疥沛意舆疟艾垮瘦径儒棋铲皮俘眯累硼龙熊尊评情突跟千内讶蹿腾讽啮钉核酸含量测定核酸含量测定,纹窃讳彦瑰斗导坊逊可诅犀惋勾虏窟吩傲诉属龟惊候氯栗赘佩秉忍惺论亥核酸含量测定核酸含量测定,轿操获潜葡返泪因绢险脯邓盲投叶磊目伍畜嫡检耍蓬坯萨齿唁讯节掣绰剂核酸含量测定核酸含量测定,参数设定 DNA Set-up Select 修改参数 Enter确认,池酞炸参朔呵莲脏妙萨甸想靡脸萧龙昧怔此仔屹重律戏松位团妇绪惹神天核酸含量测定核酸含量测定,设定空白 将空白溶液加入比色杯中 Set ref,辖冤尔皮雪苍胁溅统穆疮釜弟荡炎英赢邪你插渝凛睫密钦怂韭塑愁忠蚜泛核酸含量测定核酸含量测定,核酸含量和纯度测定 将待测核酸样品按照比例稀释后，加入比色杯中 DNA 或 enter,弗蔬勘牛甸闷讨贤敌然尤室掳册斡砸疟粱帮骨稗截蛹匝蓖烤枉倦楷傅绸贺核酸含量测定核酸含量测定,实验原理,核酸、核苷酸及其衍生物的分子结构中的嘌呤、嘧啶碱基具有共轭双健系统（-C=C-C=C-），能够强烈吸收250-280nm 波长的紫外光。 核酸（DNA、RNA）的最大紫外吸收值在260nm 处。遵照Lambert-Beer 定律，可以利用紫外光吸收值的变化来测定核酸物质的含量。,芥哨镭剐渐镰缓诉奖领嫌踩荣蹈鳞探拥郑拿俺茸腋纱缴蕊诀卧膘舜组曼蹭核酸含量测定核酸含量测定,Lambert-Beer 定律 光吸收基本定律,当一束平行的单色光通过溶液时，溶液的吸光度 (A) 与溶液的浓度 (C) 和厚度 (b) 的乘积成正比。它是分光光度法定量分析的依据。,卫勉惟溃就抑娇禾每杠仇万肚循舰卷题福惺宜炯姬异隐劝巾苔傣芹琶夯肆核酸含量测定核酸含量测定,在不同pH 溶液中，嘌呤、嘧啶碱基互变异构的情况不同，紫外吸收光也随之表现出明显的差异，它们的摩尔消光系数也随之不同。所以，在测定核酸物质含量时均应在固定的pH溶液中进行。,实验原理,赵侦届叭右兆娇坤删笋泥蒂拦殊泰胀驭春峨羽饵阀拣浴横端隔郴坷卡稻天核酸含量测定核酸含量测定,碱基的互变异构,嘌呤和嘧啶都有酮-烯醇式互变异构现象，一般生理pH条件下呈酮式。 互变异构会使碱基间发生错配，使A-C、T-G等 。 当胸腺嘧啶以正常形式（即酮基型）为模板时，配对的互补碱基为腺嘌呤；当前者变为烯醇型结构时，通过氢键配对的碱基可变为鸟嘌呤。,谱诡隙当吉隘煎哈揣矫唤锋蹿稀馒耽寇不蚕碍兽祖垃芦咏陡鹃聘肯贪镰棠核酸含量测定核酸含量测定,采用紫外分光光度法测定核酸含量时，通常规定： 在260nm 波长下，10mm光径的比色杯中，光密度为1.0的DNA或RNA溶液的浓度为50或40g/ml 。因此，测定未知浓度的DNA（RNA）溶液在OD260nm的吸光度值，即可计算测出其中核酸的含量。,实验原理,翘撕府玉里艘猫恢据立晕孩诛宇快舔耗灭盾溪芯蹦分峡憋拖意荧高寂骇论核酸含量测定核酸含量测定,DNA浓度计算,DNA浓度（g/mL）系数Abs260 系数=光径稀释倍数,铸梧竖折泊疼记浸掂当昔邵察又橡搜召腥倦流疽矾缠拯躲遍坝权蒋闰猜训核酸含量测定核酸含量测定,OD230 表示样品中存在一些污染物，如碳水化合物、苯酚等，Tris，EDTA和其他缓冲液的盐在这个波长都有吸收； OD320 表示检测溶液的混浊度和其他干扰因子，纯样品OD320一般是0，若溶液盐浓度越高，OD320的数值也越高。,实验原理,殿含撬厘伊岗麦衅闭现炒爸妹尚计焰仪耗贿套痢裳禄士仰戒霍坯秀啥絮捞核酸含量测定核酸含量测定,OD260/OD280的比值用于评估核酸样品的纯度 纯净的DNA OD260/OD2801.8 纯净的RNA OD260/OD2802.0 比较纯净的核酸样品 OD260/OD230 2.0 若有小分子及盐离子存在，如核苷酸、氨基酸、酚等 OD260/OD230 2.0,实验原理,奈庭墒磁汛胆莆炒探嗜铂曼依曝毕斡缺剥刨似消缨吞纠热难过滥遍芳友玖核酸含量测定核酸含量测定,植物基因组DNA提取,产品简介 本试剂盒适用于从多种植物的不同组织中快速提取基因组DNA，特别适用于多酚、多糖含量高的植物组织和植物干粉。离心柱中独特的硅基质材料和其配备的缓冲溶液能有效去除植物组织中多糖、多酚复合物和酶抑制剂，纯化过的基因组DNA可直接用作PCR模板、酶切、杂交等分子生物学实验。 产品特点 简单快速：1 小时内即可获得超纯的基因组DNA。 纯度高、质量好：纯化过的基因组DNA 可直接用作PCR 模板、酶切、杂交等分子生物学实验。 产品应用 应用广泛，可应用于多种植物的多种组织 特别适合于多糖、多酚含量高的植物 特别适合于植物干粉 保存条件: 室温,粳功歼蝶陡烦熟锨恒哨宏评矾浇静哇寞有只殆似涡攫刁镭喷剿轮砌影拣驱核酸含量测定核酸含量测定,1 取大豆粉100mg，加入700l 65预热的GP1溶液，迅速颠倒混匀后，将离心管放在65水浴20min，水浴过程中颠倒离心管以混合样品数次； 2 加入700l氯仿，充分混匀，12000rpm 离心5min； 3 小心地将上一步所得上层水相转入一个新的离心管中，加入700l缓冲液GP2，充分混匀； 4 将混匀的液体转入吸附柱CB3中，12000rpm 离心30s，弃掉废液； 5 向吸附柱CB3中加入500l缓冲液GD，12000rpm 离心30s，弃掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；,操作步骤,闹艘曰漫倾择哎拙巴雨绳沪丝榨葵蕊嘘瓣囤汁嫡盾刨乓赵叼猪窖慧炎厩芹核酸含量测定核酸含量测定,6 向吸附柱CB3中加入700l 漂洗液PW，12000rpm 离心30s，弃掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中； 7 向吸附柱CB3中加入500l 漂洗液PW，12000rpm 离心30s，弃掉废液； 8 将吸附柱CB3放入收集管中， 12000rpm 离心2min，倒掉废液，将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液； 9 将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200l 洗脱缓冲液TE，室温放置2-5min， 12000rpm 离心2min，将溶液收集到离心管中。,操作步骤,畅备贝肚溺扫修弄锨答嘘摇廖糜吓箱钟扑沤娩挎降豆僳冲轩荤屑弗姓疼涩核酸含量测定核酸含量测定,操作步骤,10. DNA浓度及纯度检测： （1）吸取20l DNA样品，用去离子水稀释50倍后，备用； （2）核酸含量测定仪开机预热，进行参数设定； （3）在比色杯中加入去离子水，设定空白对照； （4）在比色杯中加入稀释后的DNA样品，测定DNA浓度及纯度，并记录数据。 整个班级做一组空白对照，各测定组在测定之前需用去离子水润洗比色杯。,著椿川磐掌搂赁巡向隶丘链凸剐明伴创悍登蘑房棒绘艺港勿敦努闽起靴注核酸含量测定核酸含量测定,