1、林夕 2013-12-02LOGO分析方法验证目录1234分析方法验证的定义 分析方法验证的参数 分析方法验证方案设计 需验证分析方法的分类 分析方法验证的定义USP:分析方法验证是一个按照已建立的实验室研究来证明程序的性能参数符合期望的分析应用要求的过程。ICH分析方法验证的目标是阐明分析方法适用于它所期望的应用目的。FDA方法验证是一个阐明分析方法适合于其使用目的的过程。WHO文件化的证明任何工艺、程序或方法能真实持续获得期望结果的活动。SFDA 证明任何操作规程或方法、生产工艺或系统能够达到预期结果的一系列活动。总结：分析方法验证指通过适当的实验数据和分析的文件化记录来阐明某一分析方法性
2、能参数符合分析应用目的要求的过程 分析方法分类lICH：鉴别测试；杂质的定量分析；杂质的限度分析；药物物质或药物产品中活性成分或药物产品中其他成分的 定量测试。lUSP：用于原料药中主要成分或药物制剂中活性成分（包括防腐 剂）定量测试的方法；用于原料药中杂质或制剂中降解成分测定的方法，包括定 量和限度测试；用于性能参数测试的方法（如，溶出度，药品释放度）；鉴别测试。分析方法验证参数验证参数：Accuracy 准确度Precision 精密度Specificity 专属性Detection Limit 检出限Quanittation Limit 定量限Linearity 线性Range 范围Ro
3、bustness 耐用性 Specificity 专属性指有其他成分（杂质、降解物、辅料等）存在情况下指有其他成分（杂质、降解物、辅料等）存在情况下采用的方法能准确测定出被测物的特性，能反映该方采用的方法能准确测定出被测物的特性，能反映该方法在有共存物时对供试物准确而专属的测定能力，是法在有共存物时对供试物准确而专属的测定能力，是指该法用于复杂样品分析时是否受到相互干扰程度的指该法用于复杂样品分析时是否受到相互干扰程度的度量。度量。通常通过分析空白溶液、空白辅料溶液、供试品溶通常通过分析空白溶液、空白辅料溶液、供试品溶液、对照溶液，将所获分析结果进行比较。液、对照溶液，将所获分析结果进行比较。
4、由于有些方法用于稳定性样品检测，需要具有一定的由于有些方法用于稳定性样品检测，需要具有一定的稳定性指示效应，因此需要该方法能对经过适当条件稳定性指示效应，因此需要该方法能对经过适当条件破坏后的样品也能进行准确的检测，即强制降解实验破坏后的样品也能进行准确的检测，即强制降解实验 Specificity 专属性鉴别反应鉴别反应-应能与可能共存的物质或结构相似化合应能与可能共存的物质或结构相似化合物区别，不含被分析的样品，以及结构相似或组分中物区别，不含被分析的样品，以及结构相似或组分中的有关化合物，均应呈负反应的有关化合物，均应呈负反应含量测定和杂质测定含量测定和杂质测定-色谱法和其他方法，应附代
5、色谱法和其他方法，应附代表性图谱，亦说明专属性。图中应标明各组份的位置，表性图谱，亦说明专属性。图中应标明各组份的位置，色谱法中的分离度应符合要求色谱法中的分离度应符合要求杂质可获得的情况下，对于含量测定，试样中可加入杂质可获得的情况下，对于含量测定，试样中可加入杂质或辅料，考察测试结果是否受干扰；对于杂质测杂质或辅料，考察测试结果是否受干扰；对于杂质测定，也可向试样中加入一定量的杂质，考察杂质间是定，也可向试样中加入一定量的杂质，考察杂质间是否得到分离否得到分离 Precision 精密度精密度是指在规定条件下，同一个均匀样品，经多次取样测精密度是指在规定条件下，同一个均匀样品，经多次取样测
6、定所得结果之间的接近程度。用偏差（定所得结果之间的接近程度。用偏差（d d）、标准偏差）、标准偏差(SDSD)、相对标准偏差相对标准偏差(RSDRSD)表示表示重复性重复性(repeatability):(repeatability):在相同条件下，由同一个分析人在相同条件下，由同一个分析人员测定所得结果的精密度；在规定的范围内，至少用员测定所得结果的精密度；在规定的范围内，至少用6 6次测次测定结果评价，如制备三个不同浓度样品各测三次或把被测物定结果评价，如制备三个不同浓度样品各测三次或把被测物浓度当作浓度当作100%100%，至少测，至少测6 6次进行评价次进行评价中间精密度中间精密度 同
7、一实验室同一实验室，不同时间由不同分析人员用不同，不同时间由不同分析人员用不同设备所得结果的精密度设备所得结果的精密度重现性重现性(reproducibility)(reproducibility)不同实验室不同实验室，不同分析人员测定，不同分析人员测定结果的精密度结果的精密度数据要求：需报告各个单值、数据要求：需报告各个单值、Mean Mean SD SD，RSDRSD和置信区间。和置信区间。Precision 精密度1.1.含量测定方法的精密度含量测定方法的精密度直接取同一稳定均一供试品进行检测直接取同一稳定均一供试品进行检测2.2.杂质测定方法的精密度杂质测定方法的精密度直接采用供试品行
8、进检测直接采用供试品行进检测对供试品进行一定条件的破坏后，使供试品产生一对供试品进行一定条件的破坏后，使供试品产生一定杂质，对破坏后的供试品进行检测定杂质，对破坏后的供试品进行检测向供试品中加入已知杂质后进行检测向供试品中加入已知杂质后进行检测取取APIAPI配制成杂质限度浓度的溶液进行检测配制成杂质限度浓度的溶液进行检测 Precision 精密度精密度问题讨论精密度问题讨论当以当以API代替杂质进行精密度实验时，其浓度选择代替杂质进行精密度实验时，其浓度选择精密度与准确度的区别精密度与准确度的区别 Detection Limit 检出限检出限系指试样在确定的实验条件下，被测物能被检测出的检
9、出限系指试样在确定的实验条件下，被测物能被检测出的最低浓度或含量。它是限度检验效能指标，无需定量测定，最低浓度或含量。它是限度检验效能指标，无需定量测定，只要指出高于或低于该规定浓度即可。只要指出高于或低于该规定浓度即可。非仪器分析目视法：非仪器分析目视法：用已知浓度的被测物，试验出能被可用已知浓度的被测物，试验出能被可靠地检测出的最低浓度或量靠地检测出的最低浓度或量信噪比法信噪比法:用于能显示基线噪音的分析方法（仪器分析方用于能显示基线噪音的分析方法（仪器分析方法），是把已知低浓度试样测出的信号与空白样品测出的信法），是把已知低浓度试样测出的信号与空白样品测出的信号进行比较，算出能被可靠地检
10、测出的最低浓度或量。一般号进行比较，算出能被可靠地检测出的最低浓度或量。一般以信噪比以信噪比3131或或2121时的相应浓度或注入仪器的量确定检测时的相应浓度或注入仪器的量确定检测限限根据响应值的标准差和斜率进行计算根据响应值的标准差和斜率进行计算 a:a:响应值的标准差响应值的标准差 S S：校正曲线的斜率：校正曲线的斜率 Quantitation Limit 定量限指样品中被测物能被定量测定的最低量，结果应具有一定准指样品中被测物能被定量测定的最低量，结果应具有一定准确度和精密度要求。确度和精密度要求。信噪比法信噪比法:用于能显示基线噪音的分析方法（仪器分析方用于能显示基线噪音的分析方法（
11、仪器分析方法），是把已知浓度试样测出的信号与空白样品测出的信号法），是把已知浓度试样测出的信号与空白样品测出的信号进行比较，算出能被准确、可靠地检测出的最低浓度或量。进行比较，算出能被准确、可靠地检测出的最低浓度或量。一般以信噪比一般以信噪比101101时的相应浓度或注入仪器的量确定定量时的相应浓度或注入仪器的量确定定量限限根据响应值的标准差和斜率进行计算根据响应值的标准差和斜率进行计算 a:a:响应值的标准差响应值的标准差 S S：校正曲线的斜率：校正曲线的斜率 Quantitation Limit 定量限检测限与定量限问题讨论检测限与定量限问题讨论对于已知杂质与未知杂质的检出限和定量限应对
12、于已知杂质与未知杂质的检出限和定量限应该样测定该样测定检测限、定量限是否需要做到信噪比检测限、定量限是否需要做到信噪比3:1 3:1 和和 10:110:1做检测限、定量限时对于有校正系数的已知杂做检测限、定量限时对于有校正系数的已知杂质该怎样报告质该怎样报告定量限与报告限、限度的关系定量限与报告限、限度的关系 Linearity线性线性在设计的范围内，测试结果与试样中被测物浓度直接呈在设计的范围内，测试结果与试样中被测物浓度直接呈正比关系的程度。线性通常用最小二乘法处理数据求得正比关系的程度。线性通常用最小二乘法处理数据求得回归曲线的斜率（回归曲线的斜率（SlopeSlope）来表示。）来表
13、示。数据要求：至少需要五个浓度考察线性，需提供相数据要求：至少需要五个浓度考察线性，需提供相关系数、关系数、y y轴截距以及截距与轴截距以及截距与100%100%浓度响应值比值的绝对浓度响应值比值的绝对值（是检定的可能偏差）、值（是检定的可能偏差）、y y轴截距轴截距95%95%置信区间等参数，置信区间等参数，应列出回归方程数和线性图应列出回归方程数和线性图采用储备液稀释法采用储备液稀释法单独称量配置法单独称量配置法含量检测线性实验通常采用含量检测线性实验通常采用APIAPI配制一系列浓度进行；杂配制一系列浓度进行；杂质检测通常采用质检测通常采用APIAPI代替杂质或者加已知含量的杂质配制代替
14、杂质或者加已知含量的杂质配制一系列浓度进行一系列浓度进行 Linearity线性线性线性问题讨论线性问题讨论线性测试是否需要加对应比例的辅料线性测试是否需要加对应比例的辅料线性范围是否需要包括定量限或者报告限线性范围是否需要包括定量限或者报告限线性、准确度、精密度三者有何关系线性、准确度、精密度三者有何关系 Range范围范围指达到一定精密度、准确度和线性的条件下，测指达到一定精密度、准确度和线性的条件下，测试方法适用的最高、最低低限浓度或量的区间。试方法适用的最高、最低低限浓度或量的区间。范围应根据分析方法的具体应用和线性、准确度、范围应根据分析方法的具体应用和线性、准确度、精密度结果和要求
15、确定。精密度结果和要求确定。原料药和制剂含量测定范围为原料药和制剂含量测定范围为80%-120%80%-120%；制剂含；制剂含量均匀度范围为量均匀度范围为70%-130%70%-130%；杂质测定应为被测杂；杂质测定应为被测杂质报告限到限度的质报告限到限度的120%120%；溶出度应为测定范围的；溶出度应为测定范围的20%20%，如规定了限度范围，应为下限的，如规定了限度范围，应为下限的-20%-20%至至上限的上限的+20%+20%，例如缓释片，例如缓释片1h70%,1h70%,则验则验证范围定为证范围定为0-90%0-90%。某些情况下对于释放度有可。某些情况下对于释放度有可能还需要考虑
16、定量限。能还需要考虑定量限。Accuracy 准确度准确度是指用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的准确度是指用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度，用回收率程度，用回收率%表示；测定回收率表示；测定回收率R R（recoveryrecovery）的具体）的具体方法可采用方法可采用“回收试验法回收试验法”和和“加样回收试验法加样回收试验法”。回收试验：空白回收试验：空白+已知量已知量A A的对照品测定的对照品测定,测定值为测定值为M M加样回收试验加样回收试验 已准确测定药物含量已准确测定药物含量P P的真实样品的真实样品+已知量已知量A A的对照品（或标准品）测定，测定值为的对照品（
17、或标准品）测定，测定值为M M数据要求数据要求:规定的范围内，至少用规定的范围内，至少用9 9次测定结果评价，如制次测定结果评价，如制备高、中、低三个不同浓度样品各测三次备高、中、低三个不同浓度样品各测三次 Accuracy 准确度1.1.含量测定方法的准确度含量测定方法的准确度原料药原料药可用已知纯度的对照品或样品进行测定，可用已知纯度的对照品或样品进行测定，或用本法所得结果与已建立准确度的另一方法或用本法所得结果与已建立准确度的另一方法测定的结果进行比较测定的结果进行比较制剂制剂可用含己知量被测物的各组分混合物进行可用含己知量被测物的各组分混合物进行测定，即采用在空白辅料中加入原料药对照品
18、测定，即采用在空白辅料中加入原料药对照品的方法的方法如不能得到制剂的全部组分，可向制剂中加入如不能得到制剂的全部组分，可向制剂中加入已知量的被测物进行测定，或与另一个已建立已知量的被测物进行测定，或与另一个已建立准确度的方法比较结果准确度的方法比较结果 Accuracy 准确度2.2.杂质测定方法的准确度杂质测定方法的准确度对于可得到已知纯度杂质标准品的杂质检测，对于可得到已知纯度杂质标准品的杂质检测，可以向已知杂质含量的原料药或制剂中加入已可以向已知杂质含量的原料药或制剂中加入已知纯度的杂质标准品知纯度的杂质标准品进行测定，或用本法所得进行测定，或用本法所得结果与已建立准确度的另一方法测定的
19、结果进结果与已建立准确度的另一方法测定的结果进行比较行比较对于未知杂质或无法得到杂质标准的杂质检测，对于未知杂质或无法得到杂质标准的杂质检测，可以以可以以APIAPI代替杂质，通过外标法测定代替杂质，通过外标法测定APIAPI的回的回收率来评价方法准确性；收率来评价方法准确性；或用本法所得结果与或用本法所得结果与已建立准确度的另一方法测定的结果进行比较已建立准确度的另一方法测定的结果进行比较 Accuracy 准确度3.3.溶剂残留测定方法的准确度溶剂残留测定方法的准确度用含己知量被测物的各组分混合物进行测用含己知量被测物的各组分混合物进行测定，即采用在基质中加入被测溶剂对照品定，即采用在基质
20、中加入被测溶剂对照品的方法；或用本法所得结果与已建立准确的方法；或用本法所得结果与已建立准确度的另一方法测定的结果进行比较度的另一方法测定的结果进行比较 Accuracy 准确度 准确度问题讨论准确度问题讨论设计浓度的范围设计浓度的范围辅料或者基质加入比例辅料或者基质加入比例准确度测试过程需考虑方法中供试品溶准确度测试过程需考虑方法中供试品溶液的实际配置过程对检测的影响液的实际配置过程对检测的影响 Robustness耐用性耐用性l指测定条件稍有变动时，结果不受影响的承受程度，为常规检指测定条件稍有变动时，结果不受影响的承受程度，为常规检验提供依据。是衡量实验室和工作人员之间在正常情况下实验验
21、提供依据。是衡量实验室和工作人员之间在正常情况下实验结果重现性的尺度结果重现性的尺度;如果方法易受到分析条件的影响，或要求如果方法易受到分析条件的影响，或要求苛刻，应注明。苛刻，应注明。分析溶液的稳定性分析溶液的稳定性滤膜吸附性滤膜吸附性样品提取时间样品提取时间液相色谱的变动：液相色谱的变动：流动相流动相PHPH（0.5)0.5)流动相组成流动相组成(有机相有机相5%5%）色谱柱（同一厂家不同批号或两个不同厂家）色谱柱（同一厂家不同批号或两个不同厂家）温度（温度（5 C)5 C)流速流速(10%10%）检测波长检测波长(5nm)5nm)分析方法验证成功的前提条件分析方法验证成功的前提条件仪器已
22、经确认、校准并在校准有效期内仪器已经确认、校准并在校准有效期内经过培训的人员实施经过培训的人员实施可靠稳定的对照品可靠稳定的对照品可靠稳定的实验试剂可靠稳定的实验试剂确认受试样品的稳定性、代表性（均一性）确认受试样品的稳定性、代表性（均一性），在规定时间内无降解，在规定时间内无降解合理设计的验证方案合理设计的验证方案 分析方法验证方案设计分析方法验证方案设计方法背景介绍方法背景介绍方法描述及使用目的方法描述及使用目的验证参数项目的选择及实验是设计验证参数项目的选择及实验是设计适当可接受标准的制定适当可接受标准的制定方案的审核和批准方案的审核和批准分析方法验证方案设计分析方法验证方案设计鉴别实验
23、验证参数选择：鉴别实验验证参数选择：Specificity 专属性（专属性（USP&ICH要求）要求）Precision 精密度精密度分析方法验证方案设计分析方法验证方案设计杂质限度检测验证参数：杂质限度检测验证参数：Accuracy 准确度（准确度（ICH不要求）不要求）Specificity 专属性专属性Detection Limit 检出限检出限Range 范围（范围（ICH不要求）不要求）Robustness 耐用性耐用性Precision 精密度精密度分析方法验证方案设计分析方法验证方案设计杂质定量检测验证参数：杂质定量检测验证参数：Accuracy 准确度准确度Precision 精密度精密度Specificity 专属性专属性Quanittation Limit 定量限定量限Linearity 线性线性Range 范围范围Robustness 耐用性耐用性分析方法验证方案设计分析方法验证方案设计含量含量/溶出度验证参数标准：溶出度验证参数标准：Accuracy 准确度准确度Precision 精密度精密度Specificity 专属性专属性Linearity 线性线性Range 范围范围Robustness 耐用性耐用性
