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DNA甲基化与肿瘤张丕显（05级博士研究生）摘要：本文综述了DNA甲基化的研究进展。哺乳动物DNA甲基化主要发生在5-CpG-3的C上，生成5-甲基胞嘧啶(5mC)。DNA的甲基化可致基因突变（CT）与基因沉默。基因的甲基化沉默机制有两种：由于启动子区的甲基化导致启动子区结构改变，启动困难；甲基化引起组蛋白脱乙酰化而致染色质结构改变，关闭基因。目前，甲基化检测常用甲基化特异的PCR（MSP），检出限可达0.1%。 肿瘤中普遍存在DNA甲基化状态的改变。表现为总体的甲基化水平降低与局部的甲基化水平升高。表现为抑癌基因与修复基因的高甲基化与反转录转座子、癌基因的去甲基化。造成肿瘤甲基化改变的原因可能与甲基转移酶、p21WAF1及染色质结构改变有关,而甲基转移酶的调控机制尚不清楚.关键词: DNA, 甲基化, 肿瘤引子人类对基因本质的认识逐步深入, 目前正经历着更全面的认知过程。早期遗传学家认为, 基因是一个遗传的功能单位, 决定某种遗传性状, 它们在染色体上占有一定的位置, 并可发生突变和交换;随着DNA 作为蛋白质遗传密码载体的发现, 分子遗传学和遗传工程技术的迅速发展, 遗传学界基本上接受了下述定义: 基因是编码一条多肽链的特定DNA 片段。近几年来随着学科的进展, 一些研究者对上述看法提出了质疑13。人类基因组计划中DNA 测序工作的基本完成, 只确定了3 万多个基因, 仅是果蝇的2 倍多, 很难想象DNA 含有充分的遗传信息以调控人类如此复杂有机体发育和生存的全过程4。实际上在人类细胞中只有数千个基因有活性, 因此维持细胞的正常功能, 决定什么样的一组基因有功能, 而另一组基因无功能, 都是十分重要的。如果出错就会引起严重的后果, 据估计至少3 个基因错误表达就能诱发正常细胞癌变2。这样在人类基因组含有两类遗传学信息, 传统意义上的遗传学信息提供了生命所必需的蛋白质的模板; 而表遗传学的信息提供了何时、何地和何种方式应用这些遗传学信息的指令4。表遗传学1942 年由Waddington 首先提出, 研究基因型产生表型的过程, 此后Holliday进行了一系列的探讨5。目前认为, 表遗传学是研究没有DNA 序列变化、可遗传的基因表达(活性)的改变。还有研究者从不同角度进行描述, 例如相对于DNA 序列质的改变的遗传学研究, 表遗传学被定义为研究基因表达水平(量变) 信息的遗传。也有研究者从遗传学角度, 把表遗传学定义为非孟德尔遗传, 或没有DNA 序列改变的核遗传。2003年10月，人类表观基因组协会（Human Epigenome Con-sortium,HEC）宣布开始投资实施人类表观基因组计划(Human Epigenome Project,HEP),标志着生命科学的研究已悄然进入后基因(表基因)时代.而甲基化是表遗传学作用的主要形式.DNA甲基化DNA 甲基化是指生物体在DNA 甲基转移酶(DNA methyltransferase ,DMT) 的催化下,以s-腺苷甲硫氨酸(SAM) 为甲基供体,将甲基转移到特定的碱基上的过程。DNA甲基化可以发生在腺嘌呤的N -6位、胞嘧啶的N -4位、鸟嘌呤的N -7位或胞嘧啶的C-5位等8。但在哺乳动物,DNA甲基化主要发生在5-CpG-3的C上.生成5-甲基胞嘧啶(5mC) 9.反应如下:图1 DNA甲基化人类的Cp G以两种形式存在,一种是分散于DNA 中,另一种是CpG结构高度聚集的CpG岛。在正常组织里,70 %90 %的散在的CpG是被甲基修饰的,而CpG岛则是非甲基化的10 。DNA甲基化分析的方法分析DNA甲基化的位点与程度的实验方法有两类：一类（M SREs）利用对甲基化碱基敏感的限制性内切酶。该酶不能切割甲基化的碱基位点，从而产生片段差异，电泳后，根据片段与量的差异找到甲基化位点与甲基化程度6；另一类是利用将没有甲基化的C变为其它碱基或其它物质，而甲基化的C不会发生相应变化来识别甲基化位点。甲基化特异的PCR (M ethylation-specific PCR,MSP)7是较好的常用的方法。该法用 HSO3-处理单链DNA，使所有未甲基化的C脱氨转变为U,而甲基化的C则保持不变。然后经特异性扩增放大，测序。C位点就是甲基化位点，C的量即甲基化量。该法灵敏度高, 可检出比例为千分之一的甲基化等位片段,且对DNA 的质和量要求也低, 能用于微量的DNA 或石腊包埋组织DNA 的甲基化分析。 甲基化酶 目前, 在真核生物中发现了3 类DNA 甲基转移酶(Dnmt1、Dnmt2、Dnmt3a、Dnmt 3b): Dnmt1 主要是维持DNA 的甲基化; Dnmt2 可与DNA上特异位点结合, 但具体作用尚不清楚; Dnmt3 主要是参与DNA 的从头甲基化。Dnmt3b 基因的RNA和蛋白在肿瘤组织中明显的高表达, 而Dnmt1 和Dnmt3a 在肿瘤组织中仅适度过表达。对10 例肿瘤组织中上述基因的表达分析发现, 5 个样本中Dnm t3a 高表达; 6 个样本中Dnmt1 高表达; 8 个样本中Dnmt3b 高表达 11 。甲基化的作用1基因C T突变DNA 甲基化引起基因突变的机制主要是由于DMT催化反应形成。DMT可以加快C(胞嘧啶) 和5mC 脱氨,封闭U(尿嘧啶) 的修复,并且使U T 改变,故DMT 促使CpG序列的C T突变12 。图2 CT突变抑癌基因p53就是一个典型的例证。50% 实体瘤病人出现p53基因突变。突变中24% 是CpG 甲基化后脱氨引起的CT 突变。2影响基因错配修复DNA 错配修复系统(DNAmismatch repair system ,MMR) 是指存在人类细胞中的一种修复DNA 碱基错配的安全保障体系,它是由一系列特异修复DNA碱基错配的酶分子组成。Ahujia 等13 研究发现MMR 缺陷时,CpG岛的甲基化增强,并认为MMR 与DNA 甲基化有关。在基因错配修复过程中甲基化具有导向识别作用,而在错配修复基因表达缺陷的原因中基因突变和基因启动子区的高甲基化是其主要原因14 。3基因沉默目前认为,甲基化影响基因表达的机制有下列几种: 直接作用。基因的甲基化改变了基因的构型,影响DNA特异顺序与转录因子的结合,使基因不能转录; 间接作用。基因5端调控序列甲基化后与核内甲基化CG序列结合蛋白(methyl CG-binding p rotein)结合,阻止了转录因子与基因形成转录复合物; DNA去甲基化为基因的表达创造了一个良好的染色质环境。DNA去甲基化常与DNase I高敏感区同时出现,后者为基因活化的标志15。如图所示: 具有转录活性的DNA,在甲基化后与MBD(methyl-binding domain )蛋白如MBD2、MeCP2结合, 而该蛋白上连着的组蛋白脱乙酰基酶(HDAC1和2)使组蛋白脱乙酰化,导致染色质结构变化,转录抑制.( MTA2, metastasis-associated protein 2; RbAp46/48, retinoblastoma-associated protein 46/48;RNA pol II, RNA polymerase II; SAP18/30, Sin3-associated polypeptides 18/30)16甲基化与肿瘤现在的研究认为DNA甲基化与肿瘤密切相关。肿瘤的DNA甲基化改变表现为总体的甲基化水平降低与启动子区CpG岛的甲基化水平升高。抑癌基因与修复基因的甲基化导致抑癌基因沉默与修复基因失活,造成肿瘤抑制丧失与基因损伤增加; 而总体地低甲基化使反转录转座子、癌基因活化，使染色体不稳定。高甲基化在肿瘤中，常见的被甲基化的抑癌基因与修复基因列于表1。它们与细胞周期调控（如p16INK4a, p15INK4a, Rb, p14ARF)、 DNA修复(BRCA1, MGMT)、细胞凋亡(DAPK, TMS1)、抗药性、分化、血管生成与转移等相关联。表1 常见的被甲基化的抑癌基因与修复基因及其作用基因基因沉默对肿瘤的意义肿瘤类型APC对细胞增殖、迁移、粘附、骨架重组及染色质稳定性失去调节作用乳腺癌17、肺癌18、食管癌、结肠癌、胃癌、胰、 肝癌BRCA1与DNA 修复与转录激活有关乳腺癌19、卵巢癌20 CDKN2A/p16周期素依赖性蛋白激酶抑制剂GIT 21、头与颈部瘤22、NHL23、肺癌 21DAPK1钙/钙调素-依赖的丝氨酸/苏氨酸磷酸化酶; 凋亡抑制肺癌24E-cadherin增强增殖、侵袭与转移乳腺癌 25、甲状腺癌26、胃癌27ER激素抵抗乳腺癌28、前列腺癌29GSTP1失去对致癌物活性代谢产物的解毒作用前列腺癌30、乳腺癌31、肾癌31hMLH1缺损DNA错配修复,基因点突变结肠癌32、胃癌27、子宫内膜瘤33、卵巢癌34MGMTp53-相关基因，与DNA 修复及耐药性有关肺癌24、脑瘤35P15细胞的过度激活与增殖非白血性白血病36、淋巴瘤37, 38、鳞状细胞癌、肺癌 RASSF1A失去了对G1/S负调控抑制作用肺癌39、乳腺癌39、卵巢癌39、肾癌40、鼻咽癌41Rb不能抑制DNA复制和细胞分裂必需的基因转录成视网膜细胞瘤42、少突神经胶质(细胞)瘤43VHL错误的降解RNA结合蛋白质，改变RNA稳定性肾细胞癌40缩写: APC, adenomatous polyposis coli; BRCA1, breast cancer 1; CDKN2A/p16, cyclin-dependent kinase 2A; DAPK1, death-associated protein kinase 1; ER, estrogen receptor; GSTP1, glutathione S-transferase Pi 1; hMLH1, Mut L homologue 1; MGMT, O-6 methylguanine-DNA methyltransferase; RASSF1A, Ras association domain family member 1; Rb, retinoblastoma; VHL, von Hippel-Lindau; GIT, gastrointestinal tract; NHL, non-Hodgkins lymphoma.P16基因: p16基因5-CpG岛甲基化已被证实并且与多种肿瘤中p16的转录抑制有密切的关系。而且,用5-aza-dC干预甲基化的细胞系可导致启动子区域甲基化水平的严重下降而使p16 基因重新表达和随后的G1/S细胞周期循环阻滞44 。Boltze等45发现甲状腺肿瘤中p16 基因的突变或等位基因缺失并不多见,并认为p16 基因启动子甲基化是p16 在甲状腺肿瘤发生过程中失活的机制。采用MSP (methylation-specific PCR)检测77例甲状腺肿瘤和15例正常甲状腺组织中p16 启动子区的甲基化状态,结果显示高甲基化发生在13%的正常组织、33%的滤泡状腺瘤、44%的乳头状癌(papillary thyroid cancer, PTC)、50%的滤泡状癌( follicular thyroid cancer, FTC)、75%的差分化癌、85%的未分化癌中。同时伴随着启动子的高甲基化p16蛋白表达缺失。上述结果提示p16启动子区的高甲基化是甲状腺肿瘤发生中的早期事件并与肿瘤的进展和分化有关。RASSF1A 基因: RASSF1A 基因定位于3p21.3,是一种新的肿瘤抑制基因,与多种人类肿瘤有关。RASSF1A基因是继p16基因以来所发现的在肿瘤中甲基化程度最高、最广泛的基因之一,大量研究表明RASSF1A 表达缺失和启动子区高甲基化有着广泛的肿瘤谱,故该基因有望在多种肿瘤的早期诊断、预后判断中发挥重大作用。研究表明甲状腺癌中RASSF1A 启动子CpG岛区在9个甲状腺癌细胞系中完全甲基化,其基因表达缺失,经去甲基化处理后其基因表达恢复46 。在38例原发性甲状腺癌中, 71%的样本存在RASSF1ACpG岛的高甲基化。Xing等47用适时定量MSP研究了包括良性腺瘤在内的各种甲状腺肿瘤中RASSF1A 的甲基化状况。结果发现, RASSF1A 的异常甲基化在早期的良性腺瘤即是一个多发事件,而在癌中甲基化水平更显著。RASSF1A 启动子区CpG岛的高甲基化能致RASSF1A 基因的转录失活,这种表遗传的失活是甲状腺肿瘤发生中的一个早期步骤,在甲状腺肿瘤的恶性发展中可能发挥着重大的作用。 有些基因，在肿瘤中，普遍被甲基化，如p16、RASSF1A。而有的基因只在特定的肿瘤中被甲基化，如GSTP1，在90%前列腺癌中高甲基化，相反，在急性髓细胞样白血病中大多没有甲基化30，36。目前，研究得最详细的肿瘤是肺癌，发现其40多种基因存在一定程度的DNA甲基化改变，而其中高甲基化的是RARb、RASSF1A、CDNK2A、CHD13和 APC.48低甲基化低甲基化的缺陷在恶性肿瘤（malignancies）中广泛存在49,50。在实体瘤如转移的肝细胞癌51、在颈癌50, 前列腺癌52以及在恶性血液病如B-细胞慢性淋巴细胞性白血病34中都很普遍。总体的低甲基化在许多癌症中观察到，如乳腺癌、颈癌、脑瘤等。并且，其程度与恶性程度有正比关系53。癌细胞基因组低甲基化主要发生在卫星系列、重复系列、中心粒区域以及原癌基因系列54,55.03年，美国science杂志同期刊登的三篇文章 56, 57, 58 已经肯定了DNA 的总体低甲基化导致的基因不稳定性对肿瘤的发生起着构成原因的作用。在老鼠模型中，目前已经证明从胚胎到成体发育过程中，利用DNA甲基化转移酶( DNMT )的突变导致染色体去甲基化，可以引起老鼠基因组不稳定和导致淋巴瘤56,57。低甲基化致癌的机制有三种：u低甲基化促进了有丝分裂的重组，导致杂合性丢失（LOH）和核型重排。中心粒系列去甲基化使染色体非整倍体化59。v转座元件的再活化，如本来出于沉默状态的LINES核Alu等重复序列由于去甲基化而活跃起来，可能移动到基因组其它位置，破坏基因的功能60。w 基因组印记的丢失61。印记丢失可能导致某些与细胞增殖和转化相关基因过表达，而与细胞分化和凋亡相关基因的表达受阻。值得提出是：人们绝对相信低甲基化可直接激活癌基因。实验中也的确观察到癌基因的低甲基化，如 H-ras 62 和 c-myc 63。但并没有找到它们的低甲基化与转录增加的相关性。是技术性问题，还是在本质上它们的低甲基化就与转录没有关系？ 肿瘤甲基化改变的原因是增加了甲基化酶的表达吗？一谈到甲基化的调控因素，人们首先想到的是甲基化酶。Vertino 64发现在immortalized human fibroblasts中DNMT1高表达，并使 CpG 岛甲基化增加。在其它不同的肿瘤中也同样观察DNMT1的高表达65，66，67，68。但随后的研究表明，DNMT1增加的水平与肿瘤标志物相比却是下降了69，70，71。这提示DNMT1水平的升高是肿瘤细胞增殖的结果。DNMT1是甲基化维持酶。肿瘤细胞有较高的甲基化水平。随着肿瘤细胞数量的增加，DNMT1应该具有较高的水平才能维持肿瘤细胞的甲基化水平。更令人不解的是，当Rhee, I等72灭活了DNMT1gene后，发现对HCT116结肠癌细胞的甲基化水平一点影响也没有，也不能使高甲基化的p16等抑癌基因去甲基化。这些研究结果，使人们难以相信DNMT1在肿瘤的甲基化改变中发挥着重要作用。至于DNMT3a与DNMT3b，报道是相矛盾的，有的说观察到了他们的升高73，74，有的说没有70，71。目前看来，甲基化酶对肿瘤甲基化异常的直接作用只能打上“？”了。是p21waf1的作用吗？在这个故事里，人们提出了p21waf1占位的假说：肿瘤中出现的总体低甲基化与CpG岛高甲基化是由于DNMT1锚定目标进行甲基化的位置被其它物件所占据，使之不能进行甲基化，导致整个基因的甲基化水平降低。而自由的、没事干的DNMT1错误地将CpG岛上的C甲基化了,导致了CpG岛高甲基化. 该假设的根据是:uDNMT1与p21waf1(周期素依赖性蛋白激酶抑制剂)在PCNA(proliferating cell nuclear antigen)上有相同的结合域75,而DNMT1与PCNA的结合对于DNMT1锚定复制复合体非常重要;v来自p21waf1的小肽的确对DNMT1-PCNA复合体有很强的抑制作用75;w在正常细胞中, DNMT1与p21waf1的表达是互相排斥的, 而在肿瘤细胞中两者能同时表达76;x p21waf1在乳腺癌、肺癌、卵巢癌及肝细胞癌的早期高表达77, 78, 79, 80. 其它因素对肿瘤甲基化异常的解释假说还很多，如大复合体学说、组蛋白的乙酰化与染色质结构异常等。其中染色质结构异常比较有力。在正常细胞中，散在的C是被甲基化的，而CpG岛没有被甲基化.这本身说明了是CpG岛的整体结构抑制了对它的甲基化,是它的结构特点或是与它结合的蛋白抑制了甲基化酶对它的甲基化.当某种因素导致它的结构特点以及与它连接的那个蛋白结构改变时,它便被甲基化.可能是CpG岛被甲基化后的结构更易被甲基化导致CpG岛高甲基化.事实上, CpG岛上C含量高,自然是高甲基化.问题与展望 DNA的甲基化涉及基因的“开”与“关”，因此意义重大。但对DNA甲基化我们还知之太少，可以说DNA甲基化研究才刚刚开始，许多急待解决：u怎样提高甲基化检测的灵敏与准确度？v正常组织与肿瘤组织的甲基化精细“图谱”是怎样的？w甲基化的选择性x甲基化的调控高效的甲基化治疗解决这些问题的难度不小，但相信通过广大科研工作者的共同努力一定会迎来甲基化的完全理解与控制。为人民卫生服务。参考文献1W u C et al . Genes, Genetics, and Epigenetics: A Correspondence.Science, 2001, 293 (5532) : 1103-1105.2Wolff A P. Chromatin remodeling: why it is important in cancer.Oncogene, 2001, 20 (24) : 2988-2990.3Pennisi E. Behind the Scenes of Gene Expression.Science, 2001 , 293 (24) : 1064-1067.4Robertson KD. DNA methylation, methyltransferases, and cancer. Oncogene, 2001, 20 (24) : 3135-3155.Abstract: The field of epigenetics has recently moved to the forefront of studies relating to diverse processes such as transcriptional regulation, chromatin structure, genome integrity, and tumorigenesis. Recent work has revealed how DNA methylation and chromatin structure are linked at the molecular level and how methylation anomalies play a direct causal role in tumorigenesis and genetic disease. Much new information has also come to light regarding the cellular methylation machinery, known as the DNA methyltransferases, in terms of their roles in mammalian development and the types of proteins they are known to interact with. This information has forced a new view for the role of DNA methyltransferases. Rather than enzymes that act in isolation to copy methylation patterns after replication, the types of interactions discovered thus far indicate that DNA methyltransferases may be components of larger complexes actively involved in transcriptional control and chromatin structure modulation. These new findings will likely enhance our understanding of the myriad roles of DNA methylation in disease as well as point the way to novel therapies to prevent or repair these defects.5Holliday R. Mutation Res, 2001, 483 (Supp ll) : s36 周玉球.DNA甲基化分析技术的研究进展.国外医学遗传学分册2001,24(6):303-3087 Herman JG et al . Methylation-specific PCR: A novel PCR assay for methylation status of CpGislands。Proc Natl A cad SciU SA , 1996, 93: 9821-9826.Abstract: Precise mapping of DNA methylation patterns in CpG islands has become essential for understanding diverse biological processes such as the regulation of imprinted genes, X chromosome inactivation, and tumor suppressor gene silencing in human cancer. We describe a new method, MSP (methylation-specific PCR), which can rapidly assess the methylation status of virtually any group of CpG sites within a CpG island, independent of the use of methylation-sensitive restriction enzymes. This assay entails initial modification of DNA by sodium bisulfite, converting all unmethylated, but not methylated, cytosines to uracil, and subsequent amplification with primers specific for methylated versus unmethylated DNA. MSP requires only small quantities of DNA, is sensitive to 0.1% methylated alleles of a given CpG island locus, and can be performed on DNA extracted from paraffin-embedded samples. MSP eliminates the false positive results inherent to previous PCR-based approaches which relied on differential restriction enzyme cleavage to distinguish methylated from unmethylated DNA. In this study, we demonstrate the use of MSP to identify promoter region hypermethylation changes associated with transcriptional inactivation in four important tumor suppressor genes (p16, p15, E-cadherin, and von Hippel-Lindau) in human cancer.8Ahmad I, Rao DN. Chemistry and biology of DNA methyltransferases. Crit Rev Biochem MolBiol, 1996, 31: 361-380.9 Vertino PM , Yen RW, Gao J , et al. De novo methylation of CpG island sequences in human fibroblasts overexpressing DNA(cytosine- 5) - methyltransferase1Mol Cell Biol ,1996 ,16 (8) :4555Abstract: Recent studies showing a correlation between the levels of DNA (cytosine-5-)-methyltransferase (DNA MTase) enzyme activity and tumorigenicity have implicated this enzyme in the carcinogenic process. Moreover, hypermethylation of CpG island-containing promoters is associated with the inactivation of genes important to tumor initiation and progression. One proposed role for DNA MTase in tumorigenesis is therefore a direct role in the de novo methylation of these otherwise unmethylated CpG islands. In this study, we sought to determine whether increased levels of DNA MTase could directly affect CpG island methylation. A full-length cDNA for human DNA MTase driven by the cytomegalovirus promoter was constitutively expressed in human fibroblasts. Individual clones derived from cells transfected with DNA MTase (HMT) expressed 1- to 50-fold the level of DNA MTase protein and enzyme activity of the parental cell line or clones transfected with the control vector alone (Neo). To determine the effects of DNA MTase overexpression on CpG island methylation, we examined 12 endogenous CpG island loci in the HMT clones. HMT clones expressing > or = 9-fold the parental levels of DNA MTase activity were significantly hypermethylated relative to at least 11 Neo clones at five CpG island loci. In the HMT clones, methylation reached nearly 100% at susceptible CpG island loci with time in culture. In contrast, there was little change in the methylation status in the Neo clones over the same time frame. Taken together, the data indicate that overexpression of DNA MTase can drive the de novo methylation of susceptible CpG island loci, thus providing support for the idea that DNA MTase can contribute to tumor progression through CpG island methylation-mediated gene inactivation. 10Ehrlich M , Wang RY.H1 5 - methylcytosine in eukaryotic DNA1.Science,1981 ,212 :135011Keith D et al. Differential mRNA expression of the human DNA methyltransferases (DNMTs) 1, 3a and 3b during the G0/G1 to S phase transition in normal and tumor cells.Nucleic Acids Research, 2000; 10: 2108Abstract: DNA methylation is essential for mammalian development, X-chromosome inactivation, and imprinting yet aberrant methylation patterns are one of the most common features of transformed cells. One of the proposed causes for these defects in the methylation machinery is overexpression of one or more of the three known catalytically active DNA methyltransferases (DNMTs) 1, 3a and 3b, yet there are clearly examples in which overexpression is minimal or non-existent but global methylation anomalies persist. An alternative mechanism which could give rise to global methylation errors is the improper expression of one or more of the DNMTs during the cell cycle. To begin to study the latter possibility we examined the expression of the mRNAs for DNMT1, 3a and 3b during the cell cycle of normal and transformed cells. We found that DNMT1 and 3b levels were significantly downregulated in G0/G1 while DNMT3a mRNA levels were less sensitive to cell cycle alterations and were maintained at a slightly higher level in tumor lines compared to normal cell strains. Enzymatic activity assays revealed a similar decrease in the overall methylation capacity of the cells during G0/G1 arrest and again revealed that a tumor cell line maintained a higher methylation capacity during arrest than a normal cell strain. These results reveal a new level of control exerted over the cellular DNA methylation machinery, the loss of which provides an alternative mechanism for the genesis of the aberrant methylation patterns obs