1、RT-PCR技术技术一、真核生物基因一、真核生物基因的的表达表达 真核生物的基因含有大量的非编码区，称为内真核生物的基因含有大量的非编码区，称为内含子含子（intronintron），真正编码蛋白的区段是被内），真正编码蛋白的区段是被内含子含子隔开的，这些编码区叫做外隔开的，这些编码区叫做外显子显子（exonexon）。真核生）。真核生物的物的DNADNA转录成为转录成为RNARNA之后，经过剪切和拼接，去掉之后，经过剪切和拼接，去掉这些非编码区，才形成这些非编码区，才形成成熟的成熟的mRNAmRNA，由，由mRNAmRNA再翻译再翻译成蛋白质。成蛋白质。基因基因mRNAmRNAmRNAmRN
2、A蛋白质多肽链蛋白质多肽链蛋白质多肽链蛋白质多肽链真核生物基因的表达真核生物基因的表达转录转录翻译翻译外显子外显子内含子内含子二、二、RT-PCR技术技术的的应用应用 RT-PCRRT-PCR是一种将是一种将cDNAcDNA合成与合成与PCRPCR技术结合分析基因表技术结合分析基因表达的快速灵敏的方法，主要用于：达的快速灵敏的方法，主要用于：检测检测mRNAmRNA表达信息表达信息,进行进行基因表达差异分析基因表达差异分析等研究等研究 克隆克隆cDNAcDNA 构建构建cDNAcDNA文库文库 实验一实验一Trizol法提取细胞总法提取细胞总RNA（一步法）（一步法）真核细胞总真核细胞总RNA
3、RNA主要由主要由rRNArRNA（80-85%80-85%）、）、tRNAtRNA和核内小分子和核内小分子RNA(10-15%)RNA(10-15%)、mRNAmRNA（1-5%1-5%）组成，其中组成，其中rRNArRNA、tRNAtRNA和和mRNAmRNA位于细胞质中。位于细胞质中。大多数真核细胞大多数真核细胞mRNAmRNA在其在其33端均有一多聚端均有一多聚A(Poly A)A(Poly A)尾巴。尾巴。n真核细胞真核细胞RNA的种类的种类 RNA实验失败的主要原因是RNA酶的污染。由于RNA酶广泛存在而稳定，可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌等，只要存在少量的RNA酶就会
4、引起RNA的降解，而所制备的RNA的纯度和完整性又可直接影响RNA分析的结果，所以建立一个无RNA酶的环境对于制备RNA很重要。n实验前的准备实验前的准备常用的常用的RNARNA酶抑制剂：酶抑制剂：1.焦磷酸二乙酯（焦磷酸二乙酯（DEPC）：与）：与RNA酶的活性基团组氨酸酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合的咪唑环结合，有高致癌性，有高致癌性。（实验准备阶段使用）（实验准备阶段使用）2.异硫氰酸胍异硫氰酸胍、氯仿、氯仿：提取提取RNA同时也使同时也使RNA酶失活。酶失活。3.RNA酶的蛋白抑制剂（酶的蛋白抑制剂（RNasin）：从大鼠肝或人胎盘中）：从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。提取得来
5、的酸性糖蛋白。（合成（合成cDNA阶段使用）阶段使用）1.在实验室最好有专门的RNA操作区，离心机、移液器、试剂等专用。RNA操作区应保持清洁，并定期进行除菌。2.相关耗材(Ep管、Tip头)应先用0.1%DEPC水浸泡过夜并高压消毒。也可直接使用厂家供应的无RNase的Ep管、Tip头。3.金属器械和玻璃器皿应在使用前于180的高温下干烤6hr或更长时间。4.塑料器皿可用0.1%DEPC水浸泡或用氯仿冲洗5.配制的溶液应尽可能加入DEPC至终浓度0.1%处理12hr以上，然后用高压灭菌除去残留的DEPC。（不能用DEPC或高压灭菌的试剂，如Tris、DTT等，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水
6、配制，然后经0.22m滤膜过滤除菌）6.人的唾液和汗液含有RNA酶，故在操作中应戴手套，避免讲话。7.一些组织如脾脏比其它组织含有更多的RNA酶；细菌比哺乳动物细胞含有更多的RNA酶。因此从这些样本中制备RNA应采取更严格的预防措施。Trizol是一种苯酚与异硫氰酸胍(GTC)的混合物，异硫氰酸胍可裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使RNA与蛋白质分离。加入氯仿可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚促使RNA进入水相，离心后，RNA保留在水相中，DNA和蛋白质保留在有机相中。转移水相，加入异丙醇沉淀RNA，从而得到纯化的总RNA。n实验原理实验原理准备试剂准备试剂：Trizol,Trizol,氯仿，异丙醇，
7、氯仿，异丙醇，DEPCDEPC水水，7 70 0乙醇乙醇(需用需用DEPCDEPC水水配制配制)TrizolTrizol的用量：的用量：组织组织 l ml l ml5050100mg;100mg;细胞细胞 l ml l ml10cm10cm2 2培养瓶面积或培养瓶面积或10106 6个细胞个细胞n操作步骤操作步骤取材取材:用生理盐水漱口后，含生理盐水约用生理盐水漱口后，含生理盐水约23min，用，用15ml离心管离心管（4000rpm5min）收集细胞）收集细胞(同管多次离心同管多次离心)，弃上清，弃上清沉淀中加入沉淀中加入1mlTRIzol，旋涡震荡旋涡震荡10s重悬沉淀，重悬沉淀，加样枪打
8、匀溶加样枪打匀溶液后液后转移至转移至1.5mlEP管管，1530放置放置5min加入加入0.2ml氯仿氯仿，用手摇晃用手摇晃15s，1530放置放置5min12000rpm离心离心15min小心吸取上清，转移至小心吸取上清，转移至新新的的1.5mlEp管，加入管，加入等体积的异丙醇等体积的异丙醇，1530放置放置10min12000rpm离心离心15min，小心去上清，加入，小心去上清，加入1ml70%乙醇乙醇，震荡数，震荡数秒，秒，8000rpm离心离心5min小心小心去去上清上清，室温干燥，室温干燥5min，加入，加入10ulDEPC水，打匀水，打匀55水浴水浴10分钟助溶分钟助溶RNAR
9、NA保存保存：溶解在无溶解在无RNAase的水或的水或TE中，在中，在-70或更低温度或更低温度中中保存保存时间在时间在一年一年以内以内，但避免反复冻融，但避免反复冻融，应应分装保存。分装保存。从富含从富含RNase的样品（如胰脏、肝脏）中分离到的的样品（如胰脏、肝脏）中分离到的RNA需溶解在去离子甲酰胺中存于需溶解在去离子甲酰胺中存于-70，至少可以保存一年。，至少可以保存一年。需使用需使用RNA时，可以加入时，可以加入NaAc至终浓度至终浓度0.3M，12000g离离心心5分钟，分钟，70%乙醇洗涤后再用乙醇洗涤后再用无无RNAase的水或的水或TE溶解。溶解。RNARNA提取结果的鉴定提
10、取结果的鉴定：紫外分光光度法测定紫外分光光度法测定260/280nm比值比值大约为大约为2.0，如如果比值过低，表明有蛋白质或酚污染。果比值过低，表明有蛋白质或酚污染。RNA浓度浓度(g/ml)=OD260稀释度稀释度40。RNA电泳鉴定电泳鉴定通过通过甲醛变性甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测琼脂糖凝胶电泳检测RNA是否有降解是否有降解电泳检测结果有三条清晰的电泳检测结果有三条清晰的rRNA带：带：28S，18S和和5S（普通的（普通的1%琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳也可用于鉴定，也可用于鉴定，电泳槽电泳槽用用去污去污剂处理剂处理，水冲水冲干净，用新鲜的电泳缓冲液）干净，用新鲜的电泳缓冲液）Tota
11、lRNA实验二实验二RT-PCR cDNA的的合成包括第一链和第二链合成包括第一链和第二链cDNA的合成的合成：第一链第一链cDNA的合成是以的合成是以mRNA为模板，反转录为为模板，反转录为cDNA，由逆由逆转录酶催化，该酶合成转录酶催化，该酶合成DNA时需要时需要引物引导，常用引物是引物引导，常用引物是oligodT、随机引物或基因、随机引物或基因特异引物（特异引物（GSP）。第二链合成是以第一链为模板，由第二链合成是以第一链为模板，由DNA聚合酶催聚合酶催化。化。RNA模板模板逆转录酶逆转录酶DNA-RNA杂化双链杂化双链RNRNaseHaseH降解降解RNARNA单链单链DNADNAD
12、NA聚合酶聚合酶c cDNART-PCRTaqTaq酶酶oligo(dT)18特异性下游引物特异性下游引物随机引物随机引物 n两步法两步法RT-PCRcDNA第一链的合成第一链的合成常用的反应体系常用的反应体系10RT反应缓冲液反应缓冲液 2uldNTP Mixture（各（各10mM）2ulRNAase inhibitor(40U/ul)0.5uloligo(dT)18 1ul逆转录酶逆转录酶 1ul总总RNA 0.51ugDEPCfree水水 补足体系至补足体系至20ul操作步骤操作步骤：在发给每人一份的已制备分装的逆转录反应管里加入在发给每人一份的已制备分装的逆转录反应管里加入8ul总总
13、RNA溶液溶液0.2mlEp管，迷你离心机离心数秒，放置管，迷你离心机离心数秒，放置PCR仪中仪中4230min（合成（合成cDNA第一链）第一链）855min（灭活逆转录酶）（灭活逆转录酶）n一步法一步法RT-PCR 在一步法在一步法RT-PCRRT-PCR中，逆转录和中，逆转录和PCRPCR在同时在同时为逆转录和为逆转录和PCRPCR优化的条件下，在优化的条件下，在同同一管一管内内进进行。行。优势：在处理大量样品时易于操作；减少优势：在处理大量样品时易于操作；减少残余污染；可以得到更高的灵敏度。残余污染；可以得到更高的灵敏度。缺点：无法优化反应条件；缺点：无法优化反应条件；一旦失败，必须重
14、新提取总一旦失败，必须重新提取总RNARNA 方案示例：0.1-1ug 总RNA 200一500 umol/L的dNTP(每种)0.5umolL 基因特异引物（上下游）200 U AMV逆转录酶 1Taq聚合酶缓冲液 0.5-15mmolL MgCI2 1 mmo1L DTT 1.5U Taq聚台酶 终体积为50ul。半定量半定量RT-PCR（semi-quantitativeRT-PCR）检测特定基因的表达水平，检测的手段主要有Northern、半定量RT-PCR、荧光定量PCR（realtime-PCR/Q-PCR）、基因芯片等手段。半定量RT-PCR是常用的一种简捷、快速、特异的RNA定
15、量测定方法。通过mRNA 反转录成cDNA，再进行PCR 扩增,扩增产物以指数形式增长,通过测定PCR 产物的数量,就可以推测各样品中特异mRNA的相对含量。虽然此法只能测定mRNA 的相对含量,但在比较模型组和对照组样品之间特异mRNA 的表达差异时足以说明问题.1.总总RNA 的纯度和完整性鉴定的纯度和完整性鉴定 总RNA 提取之后，用紫外分光光度计测定其纯度和浓度，OD260/280 应在1.8 2.0 之间；然后再用1%琼脂糖凝胶对总RNA进行电泳，以鉴定其完整性，浓度不高、完整性不好的标本应谨慎选用，以免影响后面的实验结果。2.内参基因内参基因 半定量RT-PCR需选用体内稳定表达且
16、在其它生理条件下不受影响或影响很小的管家基因片段作为内参。半定量 RT-PCR多以-actin基因片段作内参，-actin蛋白在各种细胞内的含量都稳定在10%左右。另外常用的内参照还有GAPDH,它是一种细胞内代谢酶,其基因属于保守性强的“管家基因”,该基因在生物体内普遍存在且稳定表达.-MG、18S rRNA基因 也是常用的内参。不同的生物体其生命过程和生理过程各不相同,选用何种内参要根据目的基因和实验的具体情况而定.3.引物设计引物设计 为了将扩增的cDNA同痕量的基因组DNA扩增产物分开，可以设计分别同分开的外显子退火的引物。来源于cDNA的PCR产物会比来源于痕量的基因组DNA的产物短
17、设计扩增内参的引物应使其退火温度与目的基因引物相差小于3，扩增片段与目的基因扩增片段相差200 bp 以上，便于观测结果。4.同管扩增同管扩增 半定量 RT-PCR属于内标式非竞争性PCR定量技术，内参需要与目的基因同管扩增。有时内参基因表达水平相对目的基因太高，会抑制目的基因的扩增，可采用内参引物后加的方式。5.PCR 循环数的确定循环数的确定 PCR 反应遵循酶促反应定律，开始的循环内扩增产物呈指数累积,产物与模板呈线性关系,半定量RT-PCR 技术正是利用的这一线性关系,通过扩增产物来对比总RNA中目的基因的表达。RT-PCR应在平台期前结束,否则低水平表达的mRNA 可能会增加到与高
18、水平表达的mRNA 相同的拷贝数,因此,为避免平台效应的影响,合适的循环数是PCR 半定量方法的关键因素之一。（一般为30以内）通过预试验,在不同循环周期取样电泳后灰度分析,以待测基因与内参比值的对数分别与循环周期作图,最后确定扩增效率最大的循环数,这样可有效地避免因平台效应引起的误差6.结果分析结果分析 将PCR 扩增产物进行电泳，电泳图谱经凝胶分析软件进行灰度分析，得到待测基因与内参基因扩增条带的积分光密度值（IOD），计算各组样品间IOD待测基因/IOD内参基因的比值，比值越大，说明该组样品表达丰度越高。实验试剂：实验试剂：2 2PCR Mix:TaqPCR Mix:Taq酶，四种酶，四
19、种dNTPdNTP，PCRPCR反应反应bufferbuffer引物：上下游特异性引物引物：上下游特异性引物水（水（dd Hdd H2 2O O）：用以补足体积）：用以补足体积cDNAcDNA 实验操作及注意事项实验操作及注意事项实验操作及注意事项实验操作及注意事项n 建立建立PCRPCR反应体系反应体系 扩增扩增-actin-actin基因基因 -actin-actin引物引物 2 2 l l cDNA cDNA 4 4 l l 2 2PCR Mix PCR Mix 1 15 5 l l 水水 9 9 l l total volumetotal volume 3030 l l 此步注意事项此
20、步注意事项此步注意事项此步注意事项：1.每次加样要换每次加样要换Tip头，以防试剂的互相污染头，以防试剂的互相污染2.避免重复避免重复加样加样或漏加样或漏加样。3.加样一定要准确，正确使用微量移液器是关键。加样一定要准确，正确使用微量移液器是关键。4.加完试剂后离心将液体汇集管底。加完试剂后离心将液体汇集管底。5.对没有热盖的对没有热盖的PCR仪要加封石蜡油。仪要加封石蜡油。n扩增扩增-actin-actin基因基因程序的建立程序的建立预变性预变性94 5min变性变性94 45s复性复性59 45s延伸延伸72 1min续延伸续延伸72 10min保存保存43 3 3 30 0 0 0 cy
21、cles cycles cycles cyclesDNA琼脂糖凝胶电泳检测琼脂糖凝胶电泳检测DNA一、关于电泳与琼脂糖凝胶电泳一、关于电泳与琼脂糖凝胶电泳 电泳及其基本原理电泳及其基本原理电泳及其基本原理电泳及其基本原理 常用的电泳方法常用的电泳方法常用的电泳方法常用的电泳方法 琼脂糖凝胶电泳的特性及其应用（分琼脂糖凝胶电泳的特性及其应用（分琼脂糖凝胶电泳的特性及其应用（分琼脂糖凝胶电泳的特性及其应用（分离、鉴定和纯化）离、鉴定和纯化）离、鉴定和纯化）离、鉴定和纯化）利用物质的两个差异来分离物质利用物质的两个差异来分离物质利用物质的两个差异来分离物质利用物质的两个差异来分离物质电荷差异电荷差异
22、电荷性质电荷性质 电荷数量电荷数量分子差异分子差异分子大小分子大小 分子形状分子形状二、关于电泳与琼脂糖凝胶电泳二、关于电泳与琼脂糖凝胶电泳电泳及其基本原理电泳及其基本原理电泳及其基本原理电泳及其基本原理 常用的电泳方法常用的电泳方法常用的电泳方法常用的电泳方法 琼脂糖凝胶电泳的特性及其应用（分琼脂糖凝胶电泳的特性及其应用（分琼脂糖凝胶电泳的特性及其应用（分琼脂糖凝胶电泳的特性及其应用（分离、鉴定和纯化）离、鉴定和纯化）离、鉴定和纯化）离、鉴定和纯化）三、三、DNA琼脂糖凝胶电泳原理琼脂糖凝胶电泳原理 在在pH8.0pH8.0（碱碱性性）的的环环境境中中DNADNA的的磷磷酸酸基基团团解解离离
23、使使DNADNA在在该该环环境境中中带带上上负负电电荷荷，在在电电场场中中向向正正极极方方向向泳泳动动，因因为为各各种种DNADNA分分子子的的电电荷荷数数、构构象象、分分子子量量不不同同，它它们们在在通通过过凝凝胶胶立立体体网网络络是是所所受受的的动动力力和和阻阻力力不不同同，所所以以泳泳动动的的速速度度有有差差异异，达达到到分分离离的的目目的。的。n实验材料及试剂实验材料及试剂实验材料及试剂实验材料及试剂 材料：材料：材料：材料：-actin-actin基因基因基因基因扩增扩增扩增扩增产物产物产物产物 试剂：试剂：试剂：试剂：1%1%琼脂糖琼脂糖琼脂糖琼脂糖凝胶凝胶凝胶凝胶（配制配制配制
24、配制方法方法方法方法）电泳缓冲液：电泳缓冲液：电泳缓冲液：电泳缓冲液：11 TAETAE（1010 上样缓冲液：溴酚蓝、二甲苯青、甘油上样缓冲液：溴酚蓝、二甲苯青、甘油上样缓冲液：溴酚蓝、二甲苯青、甘油上样缓冲液：溴酚蓝、二甲苯青、甘油）溴化乙锭溴化乙锭溴化乙锭溴化乙锭（其它荧光染料如花青类染料（其它荧光染料如花青类染料（其它荧光染料如花青类染料（其它荧光染料如花青类染料SYBRGreenISYBRGreenI及及及及GoldViewGoldView等）等）等）等）琼脂糖凝胶板的制备（凝固后拔梳）琼脂糖凝胶板的制备（凝固后拔梳）琼脂糖凝胶板的放置（加样孔在负极）琼脂糖凝胶板的放置（加样孔在负极）-actin-actin 扩增产物扩增产物10ul10ul2ul2ul上样缓冲液上样缓冲液(每块胶留一孔加每块胶留一孔加Maker10ul)Maker10ul)，电泳（，电泳（100V,100V,约约1h1h）紫外检测紫外检测n实验操作及注意事项实验操作及注意事项实验操作及注意事项实验操作及注意事项 50bp100bp200bp300bp400bp
