优化高效液相色谱法检测鸡肉中氟喹诺酮类药物残留情况.docx

优化高效液相色谱法检测鸡肉中氟喹诺酮类药物残留情况诺氟沙星(NO)、恩诺沙星(EN)、环丙沙星(CIP)、达氟沙星(DAN)和沙拉沙星(SA)为常见的氟喹诺酮类抗菌剂，目前在畜禽生产中被广泛应用 此类药物使用不当导致的药物残留可能直接危害人体健康，也可能使致病菌产生耐药性，间接对人类健康造成影响 多个国家和地区均规定了氟喹诺酮类药物的最高残留限量 检测动物源食品中氟喹诺酮类药物残留的方法有微生物法、酶联免疫法(ELISA)、毛细管区带电泳法、电解分析法、高效液相色谱法(HPLC)、高效液相色谱 质谱联用法(HPLC-MS)等 目前，在鸡肉产品的检测中，常采用的方法是动物性食品中氟喹诺酮类药物残留检测 高效液相色谱法(农业部 1025 号公告 14-2008) 本试验以此标准为基础，简化了试验前处理方法，优化了检测过程 经试验验证，该法非常适合大批量处理样品，大量节省了处理时间和所需耗材，较大幅度降低成本，方法的灵敏度和回收率均可满足我国现行兽药残留检测分析的要求1 材料与方法1 1 药品和试剂恩诺沙星对照品、环丙沙星对照品、诺氟沙星对照品、达氟沙星对照品、沙拉沙星对照品，均为中国兽医药品监察所产品，磷酸二氢钾、磷酸、三乙胺、氢氧化钠溶液(分析纯，广州试剂厂)，乙腈(色谱纯，Fisher 公司)1 2 仪器和设备Agilent 高效液相色谱仪( 美国 Agilent 公司) 配荧光检测器，高速匀质机及振荡器(德国 IKA 公司)，高速台式冷冻离心机(美国 Thermo 公司)1 3 试液配制分别称取恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星对照品各10 mg，置于同一个 10 mL 容量瓶中，用 0.05 mol·L 1的氢氧化钠溶液溶解定容至刻度，制得质量浓度均为 1 mg·mL 1的混合储备溶液 准确称取达氟沙星对照品10 mg，0. 05 mol·L 1的氢氧化钠溶液溶解定容至 10 mL，使其质量浓度为 1 mg·mL 1 准确称取沙拉沙星对照品10 mg，0. 05 mol·L 1的氢氧化钠溶液溶解定容至 10 mL，使其质量浓度为 1 mg·mL 1置 2 8 冰箱中保存备用，有效期 1 个月取上述恩诺沙星、环丙沙星和诺氟沙星的混和储备液 100 μL，达氟沙星储备液 20 μL，沙拉沙星储备液 200 μL，置于同一个 100 mL 容量瓶中，用流动相定容至刻度，配置成恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星的质量浓度为 1 μg·mL 1，达氟沙星质量浓度为0. 2 μg·mL 1，沙拉沙星质量浓度为 2μg·mL 1的混合标准溶液提取液:称取 2 g 三氯乙酸于容量瓶中，加水至100 mL，制得的三氯乙酸溶液与乙腈按体积比 3 1的比例混合，搅拌均匀，得到提取液磷酸/三乙胺溶液:取磷酸 3. 4 mL，用水稀释至1 000 mL，配成 0. 02 mol·L 1的磷酸溶液，用三乙胺调 pH 至 2. 4 临用配制(易产生沉淀)1 4 测定方法1 4 1 供试材料的制备 将市售的鸡肉样品用高速匀浆机绞碎得到供试试料，将空白鸡肉样品绞碎得到空白试料，在空白试料中添加适宜浓度的标准溶液作为空白添加试料1 4 2 提取与净化 称取 1 g 试料，置于匀浆杯中，加提取液 4 mL，高速匀浆 1 min 匀浆液转入 15 mL聚丙烯离心管中，振荡 30 min，16 000 r/min，离心 8min，取上清液过 0. 2 μm 滤膜，装入进样瓶，待测1 4 3 色谱条件 色谱柱:Agilent TC-C18250 mm ×4. 6 mm(i d)，粒径 5μm 流动相:V(0. 02 mol ·L 1磷酸/三乙胺溶液) V (乙腈) = 80 20 流速:1mL·min 1 检测波长:激发波长 280 nm ;发射波长450 nm 进样量:20 μL1 5 线性范围与检出限空白样品中加入混合标准液配制成的诺氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星、达氟沙星、沙拉沙星系列标准溶液 高效液相色谱仪检测后，以峰面积为纵坐标，药物质量浓度为横坐标，进行线性回归分析 在空白样品中添加不同质量浓度混合标准溶液，按"1. 4"的方法进行处理，检测后取信噪比 S/N = 3 对应的样品浓度为方法检出限(LOD)，信噪比 S/N =10 对应的样品浓度为方法定量限(LOQ)1 6 回收率和精密度向空白待测样品中分别添加 3 个浓度水平的混合标准液，按"1. 4"的方法进行处理，每个浓度重复5 次，连续做 3 个批次，计算回收率和变异系数2 结果与分析2 1 色谱分析在试验选定的条件下，测得诺氟沙星的保留时间为 6. 67 min，环丙沙星为 7. 19 min，达氟沙星为8. 18 min，恩诺沙星为 9. 07 min，沙拉沙星为 12. 93min，峰形尖锐，分离完全，空白组织样品在上述保留时间无干扰峰出现(图 1)2 2 方法的检出限及标准曲线空白鸡肉样品中添加不同质量浓度的标准工作溶液 ，诺氟沙星、环丙沙星和恩诺沙星的残留定量限为 10 μg · kg 1，达 氟 沙 星 的 残 留 定 量 限 为 2μg·kg 1，沙拉沙星的残留定量限为 20μg·kg 1诺氟沙星、环丙沙星和恩诺沙星的线性范围为 10 100 μg·kg 1，达氟沙星为 2 20μg·kg 1，沙拉沙星为 20 200 μg·kg 1 对质量浓度不同的混合标准使用液进行色谱分析，工作曲线的线性范围、回归方程、相关系数见表 1 可见，本方法灵敏度高、线性范围较宽，有一定的实用价值2 3 方法的回收率与精密度对鸡肉样品分别进行4 个浓度的添加试验，测得的回收率为84.71% 99.66%，批内变异系数为020% 4. 42% ，批间变异系数为 0. 33% 2. 68% (表 2)2 4 抽样检测从市场上购买 30 个鸡肉样品，每份样品 2 个重复，按本方法进行制样和检测，结果发现一例鸡肉样品中诺氟沙星残留量为 43. 5 μg·kg 1，平行样品中诺氟沙星的质量浓度为 41. 4 μg·kg 1，其余样品均未检出氟喹诺酮药物的残留 表明该方法检测鸡肉中氟喹诺酮类药物残留量的重现性非常好，相对偏差保持在 3%之内，数据可靠3 讨论与结论3 1 样品前处理方法的优化动物源食品中基质干扰复杂，富含脂肪和蛋白质，选择并优化样品的前处理方法对结果的准确性尤为重要 本试验在农业部 1025 号公告-14-2008 所采用方法的基础上，对样品的前处理过程进行了一定的优化 该标准检测方法采用磷酸盐缓冲液提取完后，离心取上清液，过固相萃取柱，从而除去样品中的杂质 本试验的提取液由乙腈与质量分数为2% 的三氯乙酸按体积比 1 3 混合而配得，蛋白质在酸性条件下变性，离心出沉淀除掉杂质，而提取液中加入乙腈也与流动相中乙腈比例吻合，出峰较好比较其他相关研究，仲锋在鸡组织中检测氟喹诺酮类药物残留量的回收率为 70% 107%，变异系数小于 10%;陈红等在鸡排泄物中检测氟喹诺酮类药物的回收率为 75% 以上，批内变异系数在2. 2% 10% 之间，批间变异系数在 6. 2% 13. 0%之间;而本试验测得的回收率为 84. 71% 99. 66%，批内变异系数为 0. 20% 4. 42%，批间变异系数为0. 33% 2. 68% 相较而言，本试验的回收率有了明显稳定的提高，精密度和准确度也相应改善了，定量限能满足日常采集样品的检测范围，而且检测的效率大大增加，节省了柱子的成本，减少了处理的时间，非常适用于样本量较大时的残留检测3 2 检测方法的稳定性将新鲜配制的混合标准工作液 50 μg·kg 1于 4 冰箱中避光保存 1、3、5、7 d 后上机检测，结果表明，被测药物保留时间基本不变，但浓度明显降低，可见标液在保存过程中不稳定，因此在测定过程中应该做到现用现配，处理完后的样品也应及时上机3 3 结论本试验在农业部 1025 号公告-14-2008 所采用方法的基础上，对样品的前处理过程进行了优化，使样品处理快捷便利，灵敏度高，重现性好，明显降低批量样品的检测成本，可有效应用于鸡肉食品品质的日常监控参考文献:1 李俊锁，邱月明，王超 兽药残留分析M 上海:上海科学技术出版社，2002: 365-3902 WINTE W，KELLY J X，SMILKSTEIN M J Antima-larial quinolones: Synthesis，potency，and mechanisticstudiesJ Exp Parasitol，2008，118(4) :487-4973 朱蓓蕾 动物性食品药物残留M 上海: 上海科学技术出版社，1994: 115