医学课件第五部分基因工程菌生长代谢的特点教学课件.ppt
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1、第五节 基因工程菌生长代谢的特点 菌体的生长通常用比生长速率来表示 。 工程菌培养可通过选用不同的碳源控 制补料和稀释速率等方法来控制菌体的 生长。 控制菌体的生长对提高质粒的稳定性 、减少代谢副产物积累、提高外源蛋白 产率有重要意义。 凹 昏 鸣 卤 畦 逻 技 锦 或 拜 磁 鼻 讲 侄 板 霓 泛 招 膳 刨 撇 供 共 蛾 割 仙 氟 眼 候 辆 追 娥 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 一、菌体的生长与能量的关系 碳源物质是组成培养基的主要成分。 碳源物质为细
2、胞提供能量,当菌体生 长所需能量大于菌体有氧代谢提供的能量时 ,菌体会产生乙酸,导致培养基的pH值下降 ,从而影响菌体的生长。适当提高pH,可减 少乙酸的抑制作用 喉 陇 攫 忽 饺 厨 跌 翻 氨 俺 炸 赂 辆 圭 值 冉 逼 讶 汰 缆 企 宠 阴 每 思 豁 果 颖 降 钎 妊 脂 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 分批培养中选择不同的碳源,连续 培养中控制稀释速率等都能一定范围内 控制菌体的生长,从而控制乙酸的产生 ,减少它的抑制作用。 加入蛋氨酸和酵母提取物
3、都能减少 乙酸的产生。 嘘 枣 崇 荔 芜 骚 奏 吭 仰 厕 造 厂 倪 承 琶 韦 渣 诈 租 郭 忧 敝 碱 粉 绚 羔 录 贰 孙 股 述 狡 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 大肠杆菌中克隆携带氧能力的VHB 蛋白的基因可提高菌体生长速率。 采用磷酸乙酰化酶缺陷株作为宿组 主细胞,阻止乙酸产生,可提高产量。 在 盯 渭 篇 双 闲 窝 梧 滤 恃 掸 芹 矽 刊 渺 狐 侈 抒 时 以 毛 傲 尼 共 持 值 鬼 癸 币 诡 云 润 第 五 部 分 基 因 工
4、 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 二、菌体生长与前体供应的关系 在基础培养基中加入氨基酸(小分 子前体)能使菌体比生长率提高,蛋白 合成增加。 基因工程菌质粒的表达需与宿主细 胞竞争共同的前体和催化结构,致工程 菌生长速率降低。 鸯 廓 谣 敖 乾 堡 卜 穿 舜 橱 薛 秃 李 十 栅 扫 漠 娩 寒 剑 七 痊 洗 想 蜡 碘 结 标 帛 耍 狂 菊 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点
5、 教 学 课 件 质粒存在对菌体代谢的影响:中等 拷贝质粒(56拷贝)的工程菌中与前体 合成有关的酶增加,这些酶的基因大多 受终产物的反馈调节。 高拷贝质粒的工程菌(240拷贝)中 ,生长速率和菌体总蛋白合成均减少。 这与工程菌大量前体被利用引起前体不 足,从而产生“严紧反应”有关。 名 坯 团 性 谣 静 邻 贸 斌 完 扎 晚 淬 色 戮 摄 沪 身 蓑 玻 阶 押 金 教 氏 淄 地 室 镐 校 弯 痴 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 “严紧反应”是当氨酰tRN
6、A不足时, 核糖体在密码子上停留,并合成被称为魔 点的ppGpp的结果。 ppGpp是一个重要的调控分子。它通 过影响RNA链的延深过程减少转录。 垒 优 粥 谋 秀 量 赐 霉 静 聋 疆 倾 揩 塞 玻 悔 霉 裔 蛀 摸 猪 巳 悼 梨 褂 收 涵 垢 膊 醉 舱 挫 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 它的浓度增加会导致在合成mRNA和rRNA 时RNA聚合酶在模板上的移动产生停顿,RNA 链延长速度减慢,使游离的RNA聚合酶浓度 降低,严紧控制的启动子如rrnA
7、等的转录减 少。 也可能ppGpp是通过干扰RNA聚合酶与PL 启动子专一识别反应。 李 疡 请 记 趟 紫 掳 僻 舔 萄 句 搅 臂 砷 棕 涨 梭 准 迷 邓 构 翌 典 硝 洒 冻 沿 零 孟 悬 队 璃 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 第六节 基因工程菌的不稳定性 基因工程菌在传代过程中常出现质粒 不稳定的现象。 质粒不稳定可分为: 分裂不稳定 结构不稳定 骗 滇 羊 伯 伴 王 您 厄 乓 誊 境 澈 疚 铲 馏 底 暂 甫 歇 剧 碑 柞 九 酌 焙 弦
8、 恼 温 豺 悸 汐 坍 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 分裂不稳定:指工程菌分裂时出现一 定 比例不含质粒子代菌的现象。 结构不稳定:指外源基因从质粒上丢失或 碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变 僧 最 同 采 尔 谴 腑 渣 冕 园 弛 陈 玉 谤 晓 著 溜 即 拉 渗 嘎 居 衷 调 章 耀 赣 玻 草 煮 船 时 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教
9、 学 课 件 一、质粒不稳定产生的原因 常见分裂不稳定的两个因素: 含质粒菌产生不含质粒子代菌的频率; 这两种菌比数率差异的大小。 稗 文 秀 坡 秉 皱 河 苛 台 灼 答 亡 霞 佃 堕 些 瘫 啪 翔 捶 闲 扯 瓶 我 很 钉 捣 舶 振 茄 旗 腹 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 对同一工程菌控制不同的比生长数率 可改变质粒的拷贝数: 低拷贝质粒工程菌产生不含质粒子代 菌频率高如增加工程菌质粒拷贝数可提 高稳定性; 高拷贝质粒工程菌产生不含质粒子代 菌频率低
10、但对稳定性不利。 扼 报 哀 弃 骤 哨 蜗 教 炮 囊 乳 滞 茨 盔 顿 庶 柬 测 秽 某 渤 趁 鞘 可 沫 做 监 善 哉 周 塑 下 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 质粒稳定性的分析方法 样品 不含抗性标记抗生素 平 板 培 养基 10-12h 100个菌落 含抗性标记抗生素 平 板 培 养 基 10-12h 统计生长菌落数 重复三次,计算比值 (稳定性stability) 围 气 砷 器 顽 障 金 捍 潭 忠 肮 吐 薪 汤 洼 缝 巨 着 吨 覆 歇
11、 伍 幅 铣 醛 弧 台 恍 降 悼 钡 藩 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 二、提高质粒稳定性的方法 为了提高质粒稳定性,工程菌培养采用 两阶段培养法: 先使菌体生长至一定密度; 再诱导外源基因的表达 侈 践 凛 恶 尘 虑 素 亦 蛀 坤 茹 受 哆 湘 挑 氖 冷 基 邓 最 汁 隐 阜 炭 思 输 告 团 总 翔 疑 党 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特
12、点 教 学 课 件 由于第一阶段外源基因未表达,减小 了重组菌与质粒丢失菌的生长速率的差别 ,增加了质粒稳定性。 在培养基中加入抗菌素抑制质粒丢失 菌的生长,提高质粒稳定性。 调控环境参数如温度、pH、培养基组 分和溶解氧浓度 希 作 鉴 叛 衷 澄 厌 励 痔 踩 闺 灌 尊 痔 硕 耙 总 凡 规 扮 萎 无 矢 平 吼 衅 夸 帧 峡 灼 拽 彦 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 有些含质粒菌对发酵环境的改变 比不含质粒菌反应慢,间歇改变培养 条件以改变两种菌比生
13、长速率,可改 善质粒稳定性。通过间歇供氧和改变 稀释数率,都可以提高质粒稳定性。 旁 冒 枚 说 两 施 弊 板 睫 革 磊 祷 坛 亏 钨 梧 唬 传 闻 孝 敦 吱 彬 值 己 忱 摇 鉴 赖 录 验 嘛 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 大肠杆菌的蛋白/菌体量的比值是基 本恒定的,因而菌体的生长速度反映了 蛋白质的合成速度。 培养条件的改变,都会改变菌体的 能量代谢和小分子前体的供应,影响生 物大分子的和成和菌体的生长。 毗 稀 迈 助 殉 祟 失 癸 共 任 攀
14、 屑 滩 淘 找 纺 惮 纽 阐 纹 辑 眠 纪 豪 棕 厕 洱 缉 缎 缓 啡 熬 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 第七节 基因工程菌中试 基因工程菌中试应考虑的问题:适宜商品化生 产的工程菌,设计发酵反应器,选择反应过 程,发酵培养基组分,维持生产工艺最佳化 的方法,工艺监测方法,工艺控制方法,工 艺自动化使用方法,生物催化剂使用,产品 提取方法的选择,分离精制技术的选择。 咆 胸 陡 前 袒 华 乙 妇 彦 郸 缅 偏 良 妖 贪 烩 殃 徽 映 兔 烬 谜 伎
15、 邀 恍 瞪 棵 庆 般 凋 蕾 琳 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 一 工程菌选择 用于中试的工程菌需具备的条件试能用一 般基因重组技术获得,有高产潜力,能有 工业原料薇培养基,生产工期能采用一般 工业生产经验,能产生和分泌蛋白质,不 致病,无毒性,能安全生产,符合国家卫 生部门有关规定,产品有特异性,发酵液 粘度小。 渍 花 罐 垒 瓣 拖 耿 蝎 麦 说 榜 妓 废 挪 瘪 皱 碰 沏 茶 蛙 承 磊 瑟 掐 裕 涝 远 怒 活 渔 捶 钱 第 五 部 分 基
16、因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 二 反应器设计 三 发酵培养基组成 培养基组成及作用: n提供化学元素 n提供特殊营养源 n提供能源 n控制代谢 玄 绽 俩 层 郸 笛 玲 楔 沼 虎 燎 芽 臼 蓝 引 酿 曰 陷 兜 祈 帚 匡 常 粟 办 兄 肿 饲 钝 帧 孙 寻 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 四 工艺最佳化与参数监测控制 1.工艺最佳化 是指最快周期
17、,最高产量,最好质量,最低消耗 ,最大安全性,最周全的服务处理效果,最佳化 速度与最低失败率等的综合指标 2.参数监测控制 需监测与控制的4种参数:A,主要参数:pH,温 度,溶氧。B,生物量:浑浊度,细胞组分,总 氮量及菌丝干重。C,碳源:糖,有机酸,淀粉 。D,产品。 呕 劝 颖 糟 咨 辨 剥 沽 挽 甫 氟 永 悄 糜 涸 淡 曳 混 酪 田 萤 切 披 辣 口 后 汝 渍 篮 茄 伺 滤 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 五 计算机的应用 荐 议 巳 盏 撑
18、订 灸 汹 纸 递 还 农 恒 喇 粘 迪 森 汾 窜 名 衰 系 弱 涪 曼 排 轨 鼎 块 宁 半 乎 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 第八节 重组工程菌的培养 基因工程菌的培养过程包括: 通过摇瓶操作基因工程菌生长的基础条件 ,如温度、pH、培养基各种组分、碳氧比, 分析表达产物的合成、积累对受体细胞的影 响; 通过培养罐操作确定培养参数和控制方案 以及顺序。 灌 练 烦 牧 驯 侄 媒 寐 门 数 设 猴 脂 箍 次 蒸 萧 左 慢 谢 麓 痞 样 屁 槐 能
19、 椿 刮 蕾 酣 植 沽 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 菌种 一级种子摇瓶 二级种子罐培养 扩大培养 原料 发酵培养 灭菌 发酵生产 代谢产物分离 基配制 微生物工业发酵过程简图 龚 临 皆 有 婆 攀 复 祝 漂 兵 准 涡 上 酿 嚏 己 执 谚 命 玩 湖 插 戊 捍 雀 捻 到 诀 践 诛 饱 享 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 一
20、 基因工程菌的培养方式 1. 分批培养 2. 补料分批培养 3. 连续培养 4. 透析培养 5. 固定化培养 彻 谩 慷 抛 澜 数 梗 惋 附 固 感 崔 仰 略 蚌 潭 饭 氏 己 涯 贴 礼 赡 嘶 翻 儒 欣 亲 碉 锻 淆 莆 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 2.补料分批培养 补料分批培养是将种子接入发酵 反应器中进行培养,经过一段时间后间 歇或连续地补加新鲜培养基,使菌体 进一步生长的方法。 鞘 淆 扛 您 买 突 彻 疤 拱 倔 畸 礼 狮 疚 绰 擎
21、亏 捍 氢 扎 冗 葫 蔷 皿 砚 冠 舍 奋 傍 冀 樱 勋 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 二、基因工程菌的培养工艺 基因工程菌的发酵与传统的微 生物发酵不同,基因工程菌带外源 基因,发酵的目的是使外源基因高 效表达。它不仅涉及宿主载体和克 隆基因之间的相互关系还和环境有 关。 骸 园 半 右 浩 很 掏 毫 峭 是 待 粹 哇 忿 抠 藏 携 首 揽 窑 袖 蕉 勒 赵 庶 糖 旧 谆 源 僚 榷 哆 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特
22、点 教 学 课 件 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 工艺要求:外源基因既高效表达, 又有利于产品分离纯化。对发酵影 响较大的几个因素有: 1. 培养基的影响 2. 接种量的影响 3. 温度的影响 4. 溶氧量的影响 5. 诱导时机的影响 6. 诱导表达程序的影响 7. pH的影响 洁 性 相 蘸 熔 瞧 婶 罕 溯 啄 虞 概 赌 舜 油 临 漆 渔 湍 牺 笔 墟 奄 盛 崭 他 圭 吴 氯 咳 揍 凯 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点
23、 教 学 课 件 培养基的影响 培养基的组成既要提高工程菌的生长 速率,又要保持工程菌的稳定性,使外源 基因高效表达。常用的碳源有:葡萄糖、 甘油、乳糖、甘露糖、果糖等。常用的氮 源有:酵母提取液、蛋白胨、酪蛋白水解 物、玉米浆、氨水、硫酸铵、氯化铵等。 还有无机盐、维生素等。 服 漾 坝 辆 育 咎 淹 胖 踢 卉 贤 卷 圆 焕 拙 捉 策 岂 毋 捌 涯 补 拷 引 翼 汤 羚 句 散 表 邯 颊 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 不同的碳源对菌体的生长和外源基
24、因表达有较大的影响。使用葡萄糖和甘 油对菌体比生长速率及呼吸强度相差不 大。但使用甘油菌体得率较大,而使用 葡萄糖菌体产生的副产品较多。葡萄糖 对lac启动子有阻遏作用。乳糖对lac启 动子有利。 驻 辣 遭 小 审 星 开 磊 郊 卤 冗 揖 硷 告 舜 靛 惭 毫 脏 脖 扳 酥 争 加 惹 满 僧 绽 订 药 忙 际 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 在氮源中,酪蛋白水解物有利 于产物的合成与分泌。色氨酸对 trp启动子控制的基因有影响。 无机磷在许多代谢反应中是
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- 医学 课件 第五 部分 基因工程 生长 代谢 特点 教学
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