荧光定量PCR技术讲座理论基础引物及探针设计体系优化实验方案数据分析污染防控ppt课件.ppt
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1、荧光定量荧光定量PCRPCR技术讲座技术讲座 -分子生物学实验技术系列讲座分子生物学实验技术系列讲座 大纲大纲 一、荧光定量一、荧光定量PCRPCR技术的基础理论技术的基础理论 二、引物及二、引物及TaqmanTaqman探针的设计探针的设计 三、内参基因的选择三、内参基因的选择 四、反应体系的优化四、反应体系的优化 五、实验方案的选择五、实验方案的选择 六、误差分析及操作规范六、误差分析及操作规范 七、实验中污染的防控七、实验中污染的防控 八、实验结果的分析八、实验结果的分析 PCR PCR技术技术 (聚合酶链式反应)(聚合酶链式反应) PolymerasePolymerase chainc
2、hain ReactionReaction 以目的基因或以目的基因或DNADNA片段为模板片段为模板 ,在引物介导及,在引物介导及 DNADNA聚合酶聚合酶 催化下,在体外用核苷酸(催化下,在体外用核苷酸( dNTPdNTP)大量合成目的基因或)大量合成目的基因或 DNADNA片段。片段。 它能快速、专一地扩增所希它能快速、专一地扩增所希 望得到的目的基因或望得到的目的基因或DNADNA片段片段 。 一、荧光定量一、荧光定量PCRPCR技术的基础理论技术的基础理论 1 1、荧光定量、荧光定量PCRPCR技术概论技术概论 荧光定量荧光定量PCRPCR技术产生并成熟于上世纪技术产生并成熟于上世纪9
3、090年代,由于该技年代,由于该技 术实现了术实现了PCRPCR从定性到定量的飞跃,能够对从定性到定量的飞跃,能够对PCRPCR反应的全过程反应的全过程 进进 行实时监控,并且自动化程度高,所以该技术从产生到现在短行实时监控,并且自动化程度高,所以该技术从产生到现在短 短的十几年时间,在科研及检验领域获得了广泛的应用短的十几年时间,在科研及检验领域获得了广泛的应用,成为成为 分子生物学领域不可或缺的一项重要技术。分子生物学领域不可或缺的一项重要技术。 一、荧光定量一、荧光定量PCRPCR技术的基础理论技术的基础理论 1 1、荧光定量、荧光定量PCRPCR技术概论技术概论 荧光定量荧光定量PCR
4、PCR技术是在技术是在PCRPCR反应体系中加入荧光基团,利用反应体系中加入荧光基团,利用 荧光信号随着荧光信号随着PCRPCR反应的积累来实时监控反应的积累来实时监控PCRPCR反应的进程,并反应的进程,并 通通 过分析软件对过分析软件对PCRPCR的反应进行检测分析的技术。的反应进行检测分析的技术。 系统组成:定量系统组成:定量PCRPCR仪、电脑、分析软件、试剂及耗材。仪、电脑、分析软件、试剂及耗材。 一、荧光定量一、荧光定量PCRPCR技术的基础理论技术的基础理论 2 2、荧光定量、荧光定量PCRPCR常用的三个概念常用的三个概念 扩增曲线、阈值、扩增曲线、阈值、CTCT值值 (1 1
5、)、扩增曲线及扩增曲线的两种形式)、扩增曲线及扩增曲线的两种形式 左图反映的是随着左图反映的是随着PCRPCR反应的进行相应的荧光信号的变化,比较直观,但是指反应的进行相应的荧光信号的变化,比较直观,但是指 数期很短;右图反映的是荧光信号数期很短;右图反映的是荧光信号的的变化量的对数与变化量的对数与PCRPCR反应循环数的关系,从反应循环数的关系,从 右图可知,指数期很明显,在确定阈值线时具有简单明了的特点,所以很多软件右图可知,指数期很明显,在确定阈值线时具有简单明了的特点,所以很多软件 都采用右图的形式,当然了,这两种实时扩增曲线可以根据实验的需要相互转换都采用右图的形式,当然了,这两种实
6、时扩增曲线可以根据实验的需要相互转换 。 一、荧光定量一、荧光定量PCRPCR技术的基础理论技术的基础理论 2 2、荧光定量、荧光定量PCRPCR常用的三个概念常用的三个概念 (2 2)、阈值线)、阈值线 在荧光定量在荧光定量PCRPCR扩增的指数期,画一条线,在此直线上,扩增的指数期,画一条线,在此直线上, 所有样品的荧光强度与其本底荧光强度的差值全部相同。所有样品的荧光强度与其本底荧光强度的差值全部相同。 一、荧光定量一、荧光定量PCRPCR技术的基础理论技术的基础理论 2 2、荧光定量、荧光定量PCRPCR常用的三个概念常用的三个概念 (3 3)、)、CTCT值值 PCRPCR过程中,各
7、样品扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时,所经过的过程中,各样品扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时,所经过的 扩增循环数。扩增循环数。 一、荧光定量一、荧光定量PCRPCR技术的基础理论技术的基础理论 3 3、荧光定量、荧光定量PCRPCR的化学基础的化学基础 荧光定量荧光定量PCRPCR是随着是随着PCRPCR循环的进行,以荧光信号强度的积循环的进行,以荧光信号强度的积 累来实时反映累来实时反映PCRPCR反应进程的。理想的荧光物质需具备以下特反应进程的。理想的荧光物质需具备以下特 点:点: (1 1)、本底低)、本底低 (2 2)、荧光强度高)、荧光强度高 (3 3)、每轮)、每轮PCRPC
8、R反应完成后都有荧光强度的增高,而且这种荧反应完成后都有荧光强度的增高,而且这种荧 光强度的增高和每轮循环后光强度的增高和每轮循环后PCRPCR产物的量成线性关系产物的量成线性关系 (4 4)、没有)、没有PCRPCR产物时,没有荧光产物时,没有荧光 (5 5)、该荧光物质的受激发后其发射光的波长范围窄,各种)、该荧光物质的受激发后其发射光的波长范围窄,各种 荧光不会产生荧光的交叉干扰荧光不会产生荧光的交叉干扰 一、荧光定量一、荧光定量PCRPCR技术的基础理论技术的基础理论 3 3、荧光定量、荧光定量PCRPCR的化学基础的化学基础 目前常用的几种荧光物质目前常用的几种荧光物质 (1 1)、
9、)、TaqmanTaqman探针类探针类 5 5 端标记荧光基团,端标记荧光基团,3 3 端标记淬灭基团,探针完整时,没有端标记淬灭基团,探针完整时,没有 荧光,探针断裂后,在激发光的作用下,荧光基团产生荧光荧光,探针断裂后,在激发光的作用下,荧光基团产生荧光 ; 探针本身序列与目的基因序列互补,特异性高,退火后探针探针本身序列与目的基因序列互补,特异性高,退火后探针 与目的基因互补序列结合,随着与目的基因互补序列结合,随着PCRPCR反应的进行,在反应的进行,在TaqTaq酶酶5 5 -3-3 外切酶的作用下,探针水解断裂,荧光产生。外切酶的作用下,探针水解断裂,荧光产生。 一、荧光定量一、
10、荧光定量PCRPCR技术的基础理论技术的基础理论 3 3、荧光定量、荧光定量PCRPCR的化学基础的化学基础 TaqmanTaqman常用的荧光基团和淬灭基团常用的荧光基团和淬灭基团 荧光基团:荧光基团:5 5 端常用荧光基团端常用荧光基团FAMFAM标记,最佳激发光波长:标记,最佳激发光波长:494-495nm494-495nm,最,最 大大 发射光波长:发射光波长:518-520nm518-520nm。 淬灭基团:淬灭基团:TAMRATAMRA、BHQBHQ、ECLIPSEECLIPSE等。等。 TAMRATAMRA本身也是一种荧光基团,激发光波长范围较宽,本身也是一种荧光基团,激发光波长
11、范围较宽,500500 560nm 560nm,最佳激发光波长在,最佳激发光波长在560nm560nm附近,对附近,对FAMFAM基团产生的发射光基团产生的发射光 具有较好的吸收作用;其发射光波长较宽,具有较好的吸收作用;其发射光波长较宽,560560650nm650nm,当做,当做 多重荧光时,容易产生荧光交叉干扰,并且本底较高,故现已多重荧光时,容易产生荧光交叉干扰,并且本底较高,故现已 不常用。不常用。 BHQBHQ和和ECLIPSEECLIPSE为非荧光物质,只是一种荧光淬灭剂,本身不会为非荧光物质,只是一种荧光淬灭剂,本身不会 产生荧光,光吸收范围较宽,因此本底较低,作为淬灭基团较产
12、生荧光,光吸收范围较宽,因此本底较低,作为淬灭基团较 为常用,尤其在多重荧光定量为常用,尤其在多重荧光定量PCRPCR时常常被采用。时常常被采用。 一、荧光定量一、荧光定量PCRPCR技术的基础理论技术的基础理论 3 3、荧光定量、荧光定量PCRPCR的化学基础的化学基础 TaqmanTaqman探针的特点及应用探针的特点及应用 (1 1)、特异性强、准确性高)、特异性强、准确性高 本身具有序列特异性,保证了所检测目的基因的特异本身具有序列特异性,保证了所检测目的基因的特异 性;其结构特点保证了其所产生的荧光强度与性;其结构特点保证了其所产生的荧光强度与PCRPCR产物产物 的量成正比关系,因
13、此准确性极高。的量成正比关系,因此准确性极高。 (2 2)、对引物及试剂要求不高,配套的普通引物就可以使)、对引物及试剂要求不高,配套的普通引物就可以使 用,普通的用,普通的TaqTaq酶就能满足实验的要求。酶就能满足实验的要求。 (3 3)、常被用作基因含量的精确检测)、常被用作基因含量的精确检测( (精确度可达几十个拷贝精确度可达几十个拷贝) ) 及基因表达变化的精确分析(精确度可达及基因表达变化的精确分析(精确度可达0.10.1倍的变倍的变 化)。化)。 (4 4)、目前价格也不是太贵,)、目前价格也不是太贵,2OD 1000.002OD 1000.00左右左右 一、荧光定量一、荧光定量
14、PCRPCR技术的基础理论技术的基础理论 3 3、荧光定量、荧光定量PCRPCR的化学基础的化学基础 (2 2)、荧光染料类)、荧光染料类 目前常用的荧光染料为目前常用的荧光染料为SYBR GreenSYBR Green、SYBR GreenSYBR Green、 SYTO9SYTO9、HRMHRM等。其共同性质为:等。其共同性质为: (a a)、结合于双链核酸的小沟处)、结合于双链核酸的小沟处 (b b)、与双链)、与双链DNADNA结合后受激产生荧光结合后受激产生荧光 (c c)、在变性条件下双链分开,荧光消失)、在变性条件下双链分开,荧光消失 一、荧光定量一、荧光定量PCRPCR技术的基
15、础理论技术的基础理论 3 3、荧光定量、荧光定量PCRPCR的化学基础的化学基础 荧光染料的特点及应用荧光染料的特点及应用 (1 1)、能够与所有的核酸双链结合,受激后产生荧光,其荧光的强度与)、能够与所有的核酸双链结合,受激后产生荧光,其荧光的强度与 双链核酸的含量及长度成正比,因此本底较高;双链核酸的含量及长度成正比,因此本底较高; (2 2)、可做双链核酸的熔解曲线分析;)、可做双链核酸的熔解曲线分析; (3 3)、)、SYBR GreenSYBR Green染料本身价格便宜,但是做荧光定量染料本身价格便宜,但是做荧光定量PCRPCR时对引物设时对引物设 计的要求很高;对计的要求很高;对
16、TaqTaq酶要求较高,最好是酶要求较高,最好是HotStarHotStar TaqTaq酶,或者操酶,或者操 作时需要严格的冷启动,冰上操作,否则引物二聚体及非特异性扩作时需要严格的冷启动,冰上操作,否则引物二聚体及非特异性扩 增会严重干扰结果的准确性,尤其是模板含量较低时;增会严重干扰结果的准确性,尤其是模板含量较低时; (4 4)、适合于基因含量及基因表达变化的粗略分析或初筛;)、适合于基因含量及基因表达变化的粗略分析或初筛; (5 5)、在分析的基因种类很多,但是样品量很少时,尤其适用。)、在分析的基因种类很多,但是样品量很少时,尤其适用。 (6 6)、对)、对PCRPCR反应的毒性,
17、能抑制反应的毒性,能抑制PCRPCR反应,降低反应,降低PCRPCR反应的效率。反应的效率。 一、荧光定量一、荧光定量PCRPCR技术的基础理论技术的基础理论 4 4、荧光定量、荧光定量PCRPCR的数学原理的数学原理 对于普通的对于普通的PCRPCR反应来说反应来说 n n X Xn n =X=X 0 0 (1 1E E) 上式中,上式中, X Xn n 为为n n轮轮PCRPCR循环后,目的基因循环后,目的基因PCRPCR产物的量;产物的量;n n为为 PCRPCR循环数;循环数;X X0 0 为目的基因的初始模板量,为目的基因的初始模板量,E E为为PCRPCR的反应效的反应效 率,率,
18、0E10E1。 一、荧光定量一、荧光定量PCRPCR技术的基础理论技术的基础理论 4 4、荧光定量、荧光定量PCRPCR的数学原理的数学原理 由于由于PCRPCR反应体系中荧光物质的荧光强度与反应体系中荧光物质的荧光强度与PCRPCR产物的量成正比,所以产物的量成正比,所以 用荧光强度来代替用荧光强度来代替PCRPCR产物的量,我们可以得到:产物的量,我们可以得到: R R n n = R= R B B + X+ X 0 0 (1+ E) (1+ E) R R s s n n 总荧光信号强度总荧光信号强度= =本底信号本底信号+ +分子数量分子数量 单位信号强度单位信号强度 R Rn n :第
19、第n n个循环时的总信号个循环时的总信号 R RB B :本底本底 R RS S :单位信号强度单位信号强度 X X0 0 :起始起始DNADNA数目数目 E E: PCRPCR效率效率 一、荧光定量一、荧光定量PCRPCR技术的基础理论技术的基础理论 4 4、荧光定量、荧光定量PCRPCR的数学原理的数学原理 当循环数当循环数n n等于等于CTCT值时,所有样品荧光信号强度变化量的值时,所有样品荧光信号强度变化量的 对数全部一致,都达到了阈值。对数全部一致,都达到了阈值。 R R T T = R= R B B + X+ X 0 0 (1+ E) (1+ E) RsRs lg(Rlg(R T
20、T -R -R B B ) = lgX) = lgX 0 0 + CT lg(1+ E) + + CT lg(1+ E) + lglg RsRs CT lg(1+ E) = -lgX CT lg(1+ E) = -lgX 0 0 + + lg(Rlg(R T T -R -R B B ) ) lglg RsRs 此时,此时,PCRPCR反应处于指数期阶段,所有样品的反应效率反应处于指数期阶段,所有样品的反应效率E E稳定且近似相稳定且近似相 等;等; lg(Rlg(R T T -R -R B B ) )、RsRs也都相同,只有也都相同,只有CTCT值和值和-lgX-lgX 0 0 为变量,且这两
21、个变为变量,且这两个变 量之间成一次性方程。量之间成一次性方程。 也就是说,也就是说, 所有样品的所有样品的lgXlgX 0 0 与到达阈值时的循环数与到达阈值时的循环数n n(CtCt值)呈线性值)呈线性 关系,根据样品扩增达到域值的循环数即关系,根据样品扩增达到域值的循环数即CtCt值就可计算出样品中所含的模值就可计算出样品中所含的模 板量板量 CT 一、荧光定量一、荧光定量PCRPCR技术的基础理论技术的基础理论 5 5、荧光定量、荧光定量PCRPCR线性关系成立的条件分析线性关系成立的条件分析 CT lg(1+ E) = -lgXCT lg(1+ E) = -lgX 0 0 + + l
22、g(Rlg(R T T -R -R B B ) ) lglg RsRs (1 1)、)、PCRPCR效率相等,在效率相等,在PCRPCR扩增的指数期,扩增的指数期,E E稳定且为常数;稳定且为常数; (2 2)、)、 R RT T R RB B 要要相等;也就是说到达阈值时样品的荧光强度与样品的荧相等;也就是说到达阈值时样品的荧光强度与样品的荧 光本底之差要相等;光本底之差要相等; (3 3)、样品的单位信号强度)、样品的单位信号强度RsRs要相等,用荧光染料做荧光基团时,要相等,用荧光染料做荧光基团时,RsRs 就就 是每条是每条PCRPCR产物结合荧光染料后所发出的荧光强度,此荧光强度和产
23、物结合荧光染料后所发出的荧光强度,此荧光强度和 PCRPCR产物的长短有关,产物的长短有关,PCRPCR产物越长,结合的荧光染料越多,产物越长,结合的荧光染料越多, RsRs 值值 越大;用探针做荧光基团时,越大;用探针做荧光基团时,RsRs 就等于就等于PCRPCR反应时,反应时,TaqTaq酶水解掉酶水解掉 探针,探针的发光基团所发出的荧光强度,和探针,探针的发光基团所发出的荧光强度,和PCRPCR产物的长度没有产物的长度没有 直接关系。直接关系。 一、荧光定量一、荧光定量PCRPCR技术的基础理论技术的基础理论 5 5、荧光定量、荧光定量PCRPCR线性关系成立的条件分析线性关系成立的条
24、件分析 左图横坐标是左图横坐标是PCRPCR循环次数,纵坐标是总的荧光强度循环次数,纵坐标是总的荧光强度RnRn,改图反映的是各个样品随,改图反映的是各个样品随 着每轮着每轮PCRPCR反应,其总的荧光量的实时变化;右图横坐标也是反应,其总的荧光量的实时变化;右图横坐标也是PCRPCR循环次数,纵坐标循环次数,纵坐标 是总的荧光强度与荧光本底的差值是总的荧光强度与荧光本底的差值RT RT RBRB即即RnRn的对数,在右图中确定阈值线,该的对数,在右图中确定阈值线,该 直线上所有样品的直线上所有样品的RT RT RBRB的对数都相同,荧光定量的对数都相同,荧光定量PCRPCR的线性关系才会成立
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