基因工程原理与技术-植物基因工程.ppt
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1、植物基因工程 1983年,首次获得转基因植物转基因烟草 现在,已获得200多种植物的转基因植株。,第一节 农杆菌及其转化体系 一、根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciences)的生物学特征 1、形态 细胞呈杆状,大小为 0.8 um 1.53.0um,14根周生鞭毛,菌落无色、光滑。 2、生长条件 最适温度:2530,28培养;最适pH:6.09.0 3、宿主植物 双子叶植物、裸子植物 4、侵染宿主的症状及原因 冠瘿瘤,Ti质粒(tumor inducing plasmid)的T-DNA。 T-DNA是指农杆菌质粒上一段能转移并整合到植物染色体上的DNA片段。,二、Ti质
2、粒的结构和功能 1、Ti质粒的类型与分区 环状双链 DNA分子, 140235 kb。 根据其诱导植物细胞产生冠瘿碱的种类,分为章鱼碱型、胭脂碱型、农杆碱型、农杆菌素碱型(琥珀碱型)。,章鱼碱型,2、T-DNA的结构与功能 边界序列:25bp,TGACACGATATATTGGCGGGTAAAC 右边界序列是完全保守的,对T-DNA转移是必须的。,3、Vir区的结构与功能 3040 kb,有virAvirM等操纵子。 virA操纵子:组成型,长约为2.8kb,virA基因。VirA蛋白(92kD)是内膜受体蛋白,感应并结合酚类化合物(乙酰丁香酮,AS),是一种自激酶并使VirG蛋白磷酸化而被激活
3、。 virG操纵子:组成型,1.0kb,virG基因。VirG蛋白(30kD)为转录激活因子,诱导其他vir基因的表达。 virB操纵子:诱导型,virB1virB11基因。VirB蛋白构成跨膜复合体(T-链复合体运输器)供T-DNA越膜转移。 virC操纵子:诱导型,virC1、virC2基因。VirC1蛋白与超驱动序列(离右边界外侧17bp处的一个24bp的保守序列)结合,促进T-DNA加工。,virD操纵子:诱导型,virD1virD4基因。 VirD1(16kD)、VirD2(47kD)蛋白参与T-DNA加工形成T-链:首先VirD1与25bp边界序列亲和结合,使其松弛,然后使VirD
4、2在特异位点剪切。VirD2与T-链的5端共价结合,并核定位信号,将T-链复合体导向细胞核。 virE操纵子:诱导型,virE1、virE2基因。VirE2蛋白(60.5kD)是ssDNA结合蛋白,与T-链结合,参与T-链复合体形成,还具有核定位信号,引导T-链复合体进入植物细胞核。 virF操纵子:诱导型,virF基因。 VirF蛋白(23kD)参与T-链复合体的运输。 virH操纵子:诱导型,virH1、virH2基因。VirH蛋白功能是降解植物伤口细胞产生的杀菌物质。,三、T-DNA转移至植物细胞的机理(农杆菌介导转化的机理) 植物创伤反应与农杆菌对植物细胞的识别和附着; 信号分子的释放
5、积累与VirA蛋白的感应; VirG蛋白激活与vir基因的诱导表达; T-链复合体的形成; T-链是指vir基因被诱导表达后加工T-DNA而产生的单链T-DNA。 T-链复合体是指结合了VirD2、VirE2蛋白的T-链。 T-链复合体的跨膜转运; 通过T-链复合体运输器和T菌毛进入植物细胞。 T-DNA整合到植物染色体上。,四、Ti质粒的改造与转化载体系统的构建 野生型Ti质粒不能直接作为植物转化载体: Ti质粒分子过大,没有单一的限制性内切酶位点,基因操作困难,不能直接将外源基因插入其T-DNA中; T-DNA区的onc基因产物将干扰受体植物内源激素的平衡,导致冠瘿瘤的产生,阻碍细胞的分化
6、和植株的再生; 现已通过中间载体途径构建许多植物转化载体系统,主要有共整合载体系统、双元载体系统、隔端载体系统。 1、共整合载体系统(cointegrate vector system) 由卸甲Ti质粒载体、中间表达载体组成。 例如:pGV3850、 pLGVneo1103,Ampr,2、双元载体系统(binary vector system) 由微型质粒、辅助 Ti质粒组成。 例如:Bin19、pAL4404,双元载体系统比共整合载体系统更优越:插入外源基因的操作较简单; 转化效率较高。,3、隔端载体系统 与共整合载体系统一样,由卸甲Ti质粒载体和中间表达载体通过同源重组共整合成转化载体,但
7、与基因转移相关的T-DNA左右边界序列分别位于两个载体上。,共整合载体系统和隔端载体系统统称为一元载体系统或顺式载体系统。 双元载体系统也称为反式载体系统。,五、Ri质粒载体系统 发根农杆菌(Agrobacterium rhiizogenes) Ri质粒分为农杆碱型、甘露碱型、黄瓜碱型 Ri质粒的Vir区与Ti质粒的高度同源,T-DNA区的边界序列与Ti质粒的高度同源,只含有编码与生长素合成有关的酶(iaaM和iaaH)和与冠瘿碱合成有关的酶,不具细胞分裂素合成相关的基因。,第二节 目的基因的导入植物 一、植物转化受体系统及其考虑因素 建立一个高效再生体系是植物遗传转化的关键。 1、植物转化受
8、体系统 植物转化受体系统是指用于植物遗传转化的再生体系或繁殖体系。,2、建立植物转化受体系统的主要考虑因素 具有稳定的外植体来源; 具有高效稳定的再生能力; 具有较好的遗传稳定性; 对选择性抗生素敏感。 二、植物基因转移的方法 1、农杆菌介导法 一般程序:制备工程农杆菌侵染液 农杆菌侵染外植体 共培养 筛选与分化培养 获得抗性植株 分子检测 转基因植株,1、工程农杆菌的制备 把构建好的中间载体导入到农杆菌的方法: 三亲交配法 含有中间载体质粒的大肠杆菌、含有迁移质粒的大肠杆菌、含有Ti质粒的农杆菌 直接转化法 如电击法、液氮冷冻法。效率低,但简单、快速。 2、农杆菌转化植物的操作方法 整株感染
9、法 创伤整株感染法、非创伤整株感染法 优点:免去了组织培养过程,操作简单。 外植体转化法 如:叶盘转化法、子叶柄转化法、原生质体转化法,叶盘转化法,2、基因枪法 (微弹轰击法、粒子轰击法) 原理 利用火药爆炸、高压放电或高压气体作驱动力,将载有外源DNA的金粉(钨粉)等金属微粒加速射入受体细胞,从而将外源DNA分子导入细胞并实现转化。,基因枪的类型 火药爆炸基因枪(1987年 Sanfrod等):污染、可控性低 高压气体基因枪(杜邦公司的PDS-1000HE型):无污染、可控性较高 高压放电基因枪:无污染,可控性最高,操作步骤 a、受体细胞或组织的预处理; 高渗(甘露醇、山梨醇)培养 b、DN
10、A微弹的制备; 钨粉微粒的直径一般为0.71um,金粉微粒的直径一般为11.6um。金粉对细胞的伤害、毒性小,但较贵。 c、受体材料的轰击; 根据基因枪操作说明选择适当大小外植体、装配DNA微弹等。无菌操作 d、过渡培养与筛选培养 过渡培养:无选择、高渗培养,12周,3、花粉管通道法 花粉管通道法是利用植物受精过程中形成的花粉管通道将外源DNA导入植物的技术。 1983年周光宇等提出并建立。 原理 授粉一定时间后,将外源DNA加在柱头上,外源DNA能沿着花粉管通道渗入,经过珠心进入胚囊,转化尚不具备正常细胞壁的卵、合子或早期胚胎细胞。 操作方法 a、柱头切除法;b、柱头涂抹法;c、花粉粒携带法
11、。 优点 操作简单、无需组织培养、避免了组培中无性变异带来的优良农艺性状丧失。但受植物花器、花期的限制。,4、聚乙二醇法(PEG法) 原理 PEG可通过改变细胞膜表面的电荷,引起细胞膜透性变化,并促进DNA与膜接触、粘连,同时Ca2+离子与DNA结合成DNA-磷酸钙复合物而沉积于原生质体的膜表面,从而促进外源大分子进入原生质体。 优点 a、实验成本低廉,不需要特殊的仪器设备; b、受体植物不受种类的限制; c、嵌合体很少; d、结果比较稳定,重复性也较好; e、转化效率较高,可达10-3。,5、电击法 优点:操作简便、不需制备原生质体、转化效率较高、无受体限制。 6、显微注射法 显微注射法是利
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