基因工程生物化学.ppt
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1、,2 nm,大沟 (2.2 nm),小沟 (1.2 nm),3.4 nm,DNA 双螺旋结构要点 (Watson 和 Crick, 1953) 1. DNA 由两条反相平行的脱氧核苷酸链 组成,脱氧核糖-磷酸骨架位于双链的 外侧,碱基位于内侧,双链的碱基之 间以氢键相结合。 碱基互补配对形式:A T; G C) 2. DNA 是右手螺旋结构,螺旋直径为 2 nm,螺距为 3.4 nm。碱基平面垂直螺 旋轴,相邻碱基平面距离为 0.34 nm, 螺旋一圈包含 10 对碱基。 3. 氢键维持 DNA 双链横向稳定性,碱基 堆积力维持双链纵向稳定性。,DNA双螺旋解开成为单链,用于合成新的互补链.,
2、子代DNA双链中一股单链是从亲代完整地接受过来 另一股单链按碱基配对原则完全重新合成,半 保 留 复 制,DNA复制的酶及蛋白因子,1.底物 dNTP(dATP,dGTP,dCTP,dTTP) 2.聚合酶 DNA聚合酶 (DNA依赖的DNA 聚合酶) DNA-pol 3.模板 单链的DNA母链 4.引物 寡核苷酸引物(RNA) 5.其他酶和蛋白质因子 拓扑异构酶、单链DNA结合蛋白,连接酶 解旋酶、引物酶 多种蛋白因子,DNA聚合酶 (DNA polymerase,DNA-pol) 以DNA为模板,催化3,5 -磷酸二酯键的形成,DNA连接酶,基因工程 (Genetic engineering
3、),(Central dogma), 基因 (Gene) 能编码一条多肽链并具有一定长度的 DNA 分子。 基因组 (Genome) 一种生物全部染色体的遗传物质的总和,以全长 DNA 的碱基对 (bp) 数目表示。,细菌基因组 大肠杆菌: 4 x 106 bp,人类基因组:3 x 109 bp, 克隆 (Clone) 指用无性繁殖方法产生一组遗传上相同的细胞和生物群 体过程。这些细胞或个体均来自无性繁殖单一原形细胞。 分子克隆 (Molecular cloning) 利用 DNA 重组技术可使一个基因或 DNA 片段产生出许多 相同的拷贝。 DNA 重组技术 (Recombinant DNA
4、 techniques) 利用限制性内切酶、连接酶等在体外将不同生物体的 DNA 片段进行重新组合的技术。重新组合在一起 DNA片段称作 重组 DNA 分子。,基因组 DNA,克隆载体,限制性内切酶消化,限制性内切酶消化、电泳分离、纯化,DNA 连接酶,重组载体,转化或转导,大肠杆菌宿主细胞,细胞增殖,分 子 克 隆 的 基 本 过 程,重组载体在大肠杆菌宿主细胞中复制以产生许多相同的分子拷贝,基因组 DNA,载体 (环状 DNA),可被克隆的 DNA 片段,线状 DNA 载体,筛选含目的基因的重组子,限制性内切酶,限制性内切酶,转化或转导大肠杆菌,重组 DNA 分子,组 织,mRNA,cDN
5、A,部分或全部酶切的 DNA,加衔接物分子,DNA 连接酶,反转录, 工具酶 载体 目的基因 基因组 DNA 文库筛选 PCR 产物 cDNA文库筛选 RT-PCR 产物 化学合成 宿主细胞 导入重组 DNA 分子到宿主细胞 筛选携带目的基因的宿主细胞,分子克隆的所需的条件,工具酶 1.限制性内切酶和修饰酶 (Restriction endonucleases and modifying enzymes),一类存在于细菌中的核酸内切酶,它们识别双链 DNA 分子上特异的核苷酸序列,并对 DNA 分子进行剪切。 “限制性” 只降解外源 DNA 而不降解宿主 DNA; 细菌存在甲基化酶,对限制性内
6、切酶识别序列中腺苷酸和胞苷酸进行甲基化而不被限制性内切酶所剪切。这就构成了细菌的 “限制-修饰系统” 的分子基础。 “内切酶”是指酶切位点在 DNA 分子内,而不是两端。,限制性内切酶 (Restriction endonucleases),限制性内切酶的分类,回文结构 (palindrome) 是双链 DNA 分子中的反向重复 结构,即每条链从 5 3 方向读其核苷酸序列都相同。 5 GGATCC 3 5 GGA TCC 3 3 CCTAGG 5 3 CCT AGG 5 5 AGATCT 3 3 TCTAGA 5 5 CCCGGG 3 3 GGGCCC 5,命名 属名 (genus ) 的第
7、一个字母,用大写表示 种名 (species ) 的前两个字母,用小写表示 细菌株名 (strain), 用大写或小写表示 同一细菌株中不同的限制性内切酶被发现和分离的顺序,用罗马字表示。,类型 II 限制性内切酶,同一细菌株中不同的限制性内切酶被发现和分离的顺序,用罗马字表示,属名 (大写),EcoRI,种名 (小写),细菌株名 (大写),Escherichia 属,coli 种,R株,识别序列,(1) 具有回文结构 BamHI 5 GGATCC 3 3 CCTAGG 5 KpnI 5 GGTACC 3 3 CCATGG 5 (2) 具有间断的回文结构 HinfI (XmnI) 5 GANT
8、C 3 3 CTNAG 5 (3) 具有简并性碱基 HincII 5 GT(T/C)(A/G)AC 3 3 CA(A/G)(T/C)TG 5 (4) 无回文结构 MboII 5 GAAGA(N)8 3 3 CTTCT(N)7 5,GAATTC CTTAAG,CTTAA,5 - 3 -,-3 -5,5 - 3 -,-3 -5,G,AATTC,G,5 P- 3 OH -,- OH 3 - P 5,CTGCAG GACGTC,5 - 3 -,-3 -5,CTGCA,5 - 3 -,G,- OH 3 - P 5,ACGTC,5 P- 3 OH-,G,-3 -5,EcoRI,PstI,经限制性内切酶酶切
9、后所产生的末端类型 (1) 粘性末端 (sticky ends, cohesive ends),5 凸端 (5 overhang) 粘性末端,3 凸端 (3 overhang) 粘性末端,CCCGGG GGGCCC,5 - 3 -,-3 -5,5 - 3 -,- OH 3 - P 5,CCC GGG,GGG CCC,5 P - 3 OH-,-3 -5,SmaI,-3 -5,5 - 3 -,5 - 3 -,- OH 3 - P 5,GG CC,5 P - 3 OH-,-3 -5,CC GG,GGCC CCGG,HaeIII,(2) 平端或钝端 (blunt ends),同尾酶(isocaudar
10、ner) 限制性内切酶虽然识别序列不完全相同,但切割DNA后,产生相同黏端,这样的酶彼此互称为同尾酶。这两个相同的黏端称为配伍末端(compatible end)。,Bam H,Bg l,+,+,不同的酶可以产生同样的末端,+,Bam H,+,Bst,+,Xma,+,Sma,能识别同一序列(切割位点可同或不同)但来源不同的两种酶互称同工异源酶(isoschizomer)或同裂酶。,不同的酶可以识别同一个序列,酶活性单位:在 37C (某些限制性内切酶用 25C 或 50C) 条件下,每1小时酶切 1 g DNA 所用的酶量。,类型 II 限制性内切酶的反应条件,常用的酶反应体系为 50 l,即
11、 10X 缓冲液 5 l DNA 2 g ddH2O 42.5 l 限制性内切酶 (10U/l) 0.5 l,T4 DNA 连接酶 (T4 DNA ligase) 碱性磷酸酶 (Alkaline phosphatase) 去除核酸分子末端的磷酸基团 DNA 聚合酶 I 大片段 (Klenow) T4 DNA 聚合酶 (T4 DNA polymerase) 合成DNA T7 DNA 聚合酶 (T7 DNA polymerase) Taq DNA 聚合酶 (Taq DNA polymerase) 逆转录酶 (Reverse transcriptase) 以RNA为模板合成cDNA 末端脱氧多核苷酸
12、转移酶 (Terminal deoxynucleotidyl transferase) 给DNA末端加尾以构成黏性末端 多核苷酸激酶 (Polynucleotide kinase) 5羟基末端磷酸化 DNA 核酸酶 I (DNA nuclease I) S1 核酸酶 (S1 nuclease) 外切核酸酶 III (Exonuclease III) 外切核酸酶 ( Exonuclease),2. 修饰酶 (Modifying enzymes),T4 DNA 连接酶, ATP,TGCTTAA,5 - 3 -,ACG,-OH 3 -P 5,AATTCGT,GCA,- 3 - 5,5 P - 3 O
13、H -,TGCTTAA,5 - 3 -,ACG,AATTCGT,GCA,- 3 - 5,T4 DNA 连接酶 (T4 DNA ligase) 催化 DNA 的 3-OH 和 5-P 之间形成磷酸二酯键,连接带粘性末端的两个 DNA 分子,T4 DNA连接酶, ATP,ACG,5 - 3 -,TGC,-OH 3 -P 5,TAGCCGT,ATCGGCA,- 3 - 5,5 P - 3 OH -,5 - 3 -,TGCTAGCCGT,ACGATCGGCA,- 3 - 5,连接带平端的两个 DNA 分子,粘性末端,平端,E.coli DNA聚合酶 I Klenow片段 Klenow片段是 E.col
14、i DNA 聚合酶 I 的羧基端片段,长度为全酶的 70。 具有 5 3 聚合酶活性及 3 5 外切酶活性。,蛋白酶酶切位点 Klenow 片段,5 GAATTC 3 3 CTTAAG 5 EcoRI 5 G 3 5 AATTC 3 3 CTTAA 5 3 G 5 Klenow, dNTPs 5 GAATT 3 5 AATTC 3 3 CTTAA 5 3 TTAAG 5,5 3 聚合酶活性:补平限制性内切酶酶切所产生的 3 凹端而形成平端,5 GGTACC 3 3 CCATGG 5 KpnI 5 GGTAC 3 5 C 3 3 C 5 3 CATGG 5 Klenow 5 G 3 5 C 3
15、3 C 5 3 G 5,3 5 外切酶活性:去除限制性内切酶酶切所产生的3凸端而形成平端,逆转录酶 (Reverse transcriptase,RT) 逆转录酶为依赖 RNA的 DNA聚合酶,具有 5 3 聚合酶活性外,以 RNA为模板合成 DNA。 逆转录酶还具有核糖核酸酶H (RNase H) 活性,可 从 5 末端或 3 末端降解RNA:DNA杂合链中的 RNA。 依赖 DNA的 DNA聚合酶 逆转录酶无 3 5 外切酶活性。,禽类逆转录酶和鼠类逆转录酶的比较,以 mRNA为模板合成第一条 cDNA链,所用的引物包括 Oligo (dT)12-18 特定序列的寡核苷酸 随机序列的寡核苷
16、酸 构建 cDNA 文库:用 Oligo (dT)12-18 引物 克隆特定的 cDNA:用特定序列的寡核苷酸引物 RT-PCR:用特定序列的寡核苷酸引物 制备 cDNA 探针:用特定序列的寡核苷酸引物或 随机序列的寡核苷酸引物,MMLV RT催化的 cDNA合成,proinsulin cDNA的合成,载体和宿主细胞 (Vectors and Host cells),载体(vector)是为携带感兴趣的外源DNA,实现外源DNA在受体细胞中的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子,按功能分,克隆载体(cloning vector),表达载体(expression vector),按
17、基本元件的来源不同,质粒载体 噬菌体载体 黏粒载体 病毒载体 人工染色体载体等,载体概述,载体 (Vectors) 克隆载体 (Cloning vector) 用于构建基因组文库、cDNA文库以及克隆某一特定基因 或 cDNA 以测定其核苷酸序列。使外源DNA被扩增 (1) 质粒 (plasmid) (2) 噬菌体载体 ( phage) (3) 粘粒 (cosmid) (4) 细菌人工染色体 (Bacterial artificial chromosome, BAC) (5) 酵母人工染色体 (Yeast artificial chromosome, YAC) 表达载体 (Expression
18、 vector) 用于表达某一基因或 cDNA以获得目的蛋白质。表达载体 包括原核表达载体和真核表达载体,表达载体的种类较多,可根据要表达的目的蛋白质的特点来选则载体。,克隆载体 宿主细胞 载体结构 外源插入片段 质粒 大肠杆菌 环状质粒 0.1 - 10 kb 噬菌体载体 大肠杆菌 线状病毒 8 - 25 kb 粘粒 大肠杆菌 环状质粒 35 - 45 kb 细菌人工染色体 大肠杆菌 环状质粒 50 - 300 kb 酵母人工染色体 酵母 线状染色体 100 - 1000 kb,不同类型克隆载体的比较,克隆载体应具备的主要特点,至少有一个复制起点(origin of replication,
19、 ori) 至少有一个选择性标志(selection marker) 有适宜的限制性内切酶的单一切点:称为多克隆位点(multiple cloning sites,MCS) 应有较高的拷贝数。,pBR322质粒图谱, 质粒是存在于细菌染色体 (基因组) 外的 DNA 分子,其 大小在 1 kb - 200 kb 范围内。 质粒是双链、共价闭合的环状 DNA 分子,以超螺旋形式 存在。 质粒具有复制起始点,可在细胞中进行自我复制,并将质 粒 DNA 分配给子细胞。 高拷贝数质粒:10-200个/细胞 低拷贝数质粒:几个/细胞 质粒还含有在特定环境条件下所必需的基因, 如抗生素的 抗性基因。,质粒
20、 (plasmid),克隆质粒 (Cloning plasmid) 低分子量 易于提取且不易断裂 高拷贝数 可大量扩增被克隆的目的基因、DNA 片段或 cDNA。 (3) 含有一个或几个可供选择的标记,抗生素抗性基因、细菌 lacZ 基因片段及 ccdB 致死基因等。 (4) 含多克隆位点 质粒基因内有多个限制性内切酶单一识别位点,并允许外源 DNA 插入。,质粒载体所携带的复制子,基因组 DNA,质粒 DNA,细菌基因组 DNA 和质粒 DNA,超螺旋质粒 DNA,闭环质粒 DNA,细菌,抗生素的作用位点,C,C,O,NH,C,C,C,N,O,S,H,CH3,H,CH3,HOOC,H2N,H
21、,氨苄青霉素,-内酰胺环,-内酰胺酶 作用位点,抗生素的抗性基因产物及其功能,ApR: Ampicillin resistance gene rep (ori): replication origin lacZ: N-terminal -galactosidase MCS: multiple cloning sites,MCS (pUC18 ), 克隆质粒带有E. coli 乳糖操纵子的 lac 启动子及编码 - 半乳糖苷酶氨基端 (-供体片段,146 氨基酸) 的 DNA 片段。 E. coli 宿主细胞 (DH5, JM109, XL1-Blue 菌株)的乳糖 操纵子的 -半乳糖苷酶基为缺
22、陷型,只能编码 -半乳糖 苷酶的羧基端片段 (-受体片段)。 异丙基 -D-硫代半乳糖苷 (IPTG) 诱导质粒上的 -供体 片段和宿主细胞的 -受体片段的表达,两者结合后才有 -半乳糖苷酶活性,使底物5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖 苷 (X-gal) 产生蓝色。 两个无活性片段组合而成为功能完整的 -半乳糖苷酶的过程称为 -互补。,-互补 (-complementation),lacI,P,lacO,CRP site,MCS,lacZ”,P,lacO,CRP site,质粒,lacZ,宿主细胞基因组,无外源 DNA 片段 插入 MCS,-半乳糖苷酶氨基端 (-供体片段),IPTG 诱导
23、,-半乳糖苷酶羧基端 (-受体片段),水解 X-gal (蓝色菌落),-互补,lacI,IPTG 诱导,-供体片段,-受体片段,-半乳糖苷酶活性,X-gal,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,转 化,-半乳糖苷酶氨基端,-半乳糖苷酶氨基端,-半乳糖苷酶羧基端,-半乳糖苷酶,-半乳糖苷酶水解 X-gal,菌落呈蓝色,lacI,P,lacO,CRP site,外源 DNA 片段,外源 DNA 片段破坏 lacZ,外源 DNA 片段 插入 MCS,质粒,宿主细胞基因组,lacZ”,P,lacO,CRP site,-半乳糖苷酶羧基端,lacI,IPTG 诱导,IPTG 诱导,无 -半
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