12基因工程的基本操作程序.ppt
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1、1.2 基因工程的基本操作程序,步骤一:目的基因的获取,目的基因主要是指编码蛋白质的结构基因。是人们所需要转移或改造的基因。,如苏云金芽孢杆菌的抗虫基因,植物的抗逆性相关的基因,以及人的胰岛素基因、干扰素基因等。,从已有的物种中分离 人工方法合成,从基因文库获得,1、从基因文库中获取目的基因,基因文库: 将含有某种生物不同基因的许多DNA片段,导入受体菌的群体中储存,各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因,称为基因文库(gene library)。 基因组文库: 基因文库中包含了一种生物所有的基因,这种基因文库叫做基因组文库。 部分基因文库: 基因文库中包含了一种生物的一部分基因,这种基因文库
2、叫做部分基因文库。,某生物体内全部DNA,许多DNA片段,受体菌群体,基因组文库,某种生物某个时期的mRNA,cDNA,受体菌群体,部分基因文库 (cDNA文库),外显子,内含子,原核生物基因,真核生物基因,内含子,外显子,真核生物cDNA文库与的区别基因组文库,小,大,无,有,无,有,某种生物部分基因,某种生物全部基因,可以,部分基因可以,2、利用PCR技术扩增目的基因,聚合酶链式反应,在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。可以获得大量的目的基因。,循环(重复),使目的基因短时间内成百万倍地扩增,PCR技术的原理:DNA复制(体外),过程:变性 退火 延伸,(解链为单链) (冷却) (
3、子链合成),条件: 引物(2种); 模板:DNA的两条链; 四种脱氧核苷酸; 热稳定DNA聚合酶(Taq酶)。,多次重复,PCR技术与DNA体内复制的区别:,需要,需要,常温条件、解旋酶、ATP,高温条件(9095),DNA解旋酶、DNA聚合酶、,耐高温的Taq酶,体内(细胞内),体外,练习有关PCR技术的说法,不正确的是( ) APCR是一项在生物体外复制特定的DNA片段的核酸合成技术 BPCR技术的原理是DNA双链复制 C利用PCR技术获取目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列 DPCR扩增中必须有解旋酶才能解开双链DNA,(1)催化过程的酶是_ 。 (2)过程也称为DNA的变性
4、,此过程在温度高达9095时才能完成,说明DNA分子具有_性。 (3)由图中信息分析可知,催化过程的酶都是_,两者在作用特性上的区别是_ 。 (4)如果RNA单链中有碱基100个,其中A占25%,U占15%,则通过该过程合成的一个双链DNA片段中有胞嘧啶_个。,反转录酶(或逆转录酶),练习:1970年,特明和巴尔的摩证实了RNA病毒能依赖RNA合成DNA的过程,并发现了催化此过程的酶。下面为形成cDNA的过程和PCR扩增过程示意图。请根据图解回答下列问题:,稳定,DNA聚合酶,催化过程的酶耐高温,60,蛋白质的氨基酸序列,mRNA的核苷酸序列,结构基因的核苷酸序列,推测,推测,目的基因,化学合
5、成,3. 通过DNA合成仪化学方法直接人工合成,(基因比较小、核苷酸序列又已知),步骤二:基因表达载体的构建(核心内容),(1)用一定的限制酶切割质粒,使其出现一个切口,露出黏性末端。 (2)用同一种限制酶切割目的基因,使其产生相同的黏性末端。 (3)将切下的目的基因片段插入质粒的切口处,再加入适量DNA连接酶,形成了一个重组DNA分子(重组质粒)。,目的基因与运载体结合的过程实际上是不同来源的基因重组的过程。,步骤二:基因表达载体的构建(核心内容),获取目的基因,DNA连接酶,重组DNA,1. 表达载体的构建过程,质粒,目的基因与运载体结合的过程实际上是不同来源的基因重组的过程。,步骤二:基
6、因表达载体的构建(核心内容),2. 表达载体的组成,启动子:,+,目的基因:,+,终止子:,标记基因:,+,是 的结合位点, 驱动 过程。,RNA聚合酶,转录,终止 过程。,转录,有目的基因的受体细胞。,鉴定和筛选,编码人类所需的蛋白质, 使生物表达相应性状.,复制原点:,启动复制,质粒,DNA分子,限制酶处理,两个切口 获得目的基因,DNA连接酶,重组DNA分子(重组质粒),同一种,一个切口 两个黏性末端,基因表达载体的组成 复制原点+启动子+目的基因+终止子+标记基因,思考:,1. 上述表达载体的启动子、目的基因、终止子、标记基因的化学成分相同吗?,都是DNA,2. 终止子和终止密码的化学
7、成分是否一致?,终止子DNA, 终止转录; 终止密码RNA上,终止翻译.,3. 图为某种质粒表达载体简图,小箭头所指分别为限制性内切酶EcoRI、BamHI的酶切位点,ampR为青霉素抗性基因,tctR 为四环素抗性基因,P启动子,T为终止子,ori为复制原点。已知目的基因的两端分别有包括EcoRI、BamHI在内的多种酶的酶切位点。,据图回答: (1)将含有目的基因的DNA与质粒该表达载体分别 用EcoRI酶切,酶切产物用连接酶进行连接后,其中由 两个DNA片段之间连接形成的产物有 、 、 三种 。若要从这些连接产物中分离出重组质粒,需要对这些连接产物进 行 . (2)用上述3种连接产物与无
8、任何抗药性的原核宿主细胞进行转化实验。之后将这些宿主细胞接种到含青霉素的培养基中,能生长的原核宿主细胞所含有的连接产物是 ;,目的基因运载体连接物,运载体运载体连接物,目的基因目的基因连接物,分离纯化,目的基因运载体连接物,运载体运载体连接物,练习. 图为某种质粒表达载体简图,小箭头所指分别为限制性内切酶EcoRI、BamHI的酶切位点,ampR为青霉素抗性基因,tctR 为四环素抗性基因,P启动子,T为终止子,ori为复制原点。已知目的基因的两端分别有包括EcoRI、BamHI在内的多种酶的酶切位点。,(3)目的基因表达时,RNA聚合酶识别和结合的位点是 ,其合成的产物是 。 (4)在上述实
9、验中,为了防止目的基因和质粒表达载体在酶切后产生的末端发生任意连接,酶切时应选用的酶 是 。,EcoRI和BamHI,启动子,mRNA,常用的受体细胞:,有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。,将目的基因导入受体细胞的原理,借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。,步骤三:目的基因导入受体细胞,转化: 指目的基因进入受体细胞内,并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。,1.将目的基因导入植物细胞,(1)农杆菌转化法:感染双子叶植物和裸子植物,对大多单子叶植物没有感染力; (2)基因枪法:常用于单子叶植物; (3)花粉管通道法:转基因抗虫棉。,(2)基因枪法:常用于单子叶植物;,花的结构示
10、意图,1,2,3,4,5,6,7,8,9,花柄,花托,子房,花萼,花瓣,花柱,柱头,花药,花丝,雄蕊,雌蕊,(花冠),(3)花粉管通道法:转基因抗虫棉。,2.将目的基因导入动物细胞,显微注射技术: 利用微量注射器在显微镜下直接把目的基因注入宿主细胞。,3.将目的基因导入微生物细胞,导入大肠杆菌的方法: 首先用Ca2+ 处理细胞,以增大细菌细胞壁的通透性,使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态感受态细胞。 第二步是将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合,在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子,完成转化过程。,显微注射技术,提纯基因表达载体,采用氯化钙来改变其通透性是
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