COX-2蛋白在鼻咽癌中的表达及其临床意义.pdf
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1、 1 主要缩略语英文索引 英文缩写 英文全称 中文对照 COX cyclooxygenase 环氧合酶 NPC nasopharyngeal carcinoma 鼻咽癌 IHC immunohistochemistry 免疫组织化学 WB western bloting 蛋白印迹 SPSS statistical package of social scicece 社会科学统计软件包 HE hemotoxylin and eosin staining 苏木素-伊红染色 S-P streptavidin-peroxdase 链霉菌抗生物素蛋白-过氧 化物酶 DAB diaminobenzidin
2、e 二氨基联苯胺 EDTA ethylene diamine tetra-aceticacid 乙二胺四乙酸 2 COX-2 蛋白在鼻咽癌中的表达及其临床意义 中 文 摘 要 目 的目 的 :研 究 鼻 咽 癌 (nasopharyngeal carcinoma,NPC) 组 织 中 环 氧 合 酶 -2(cyclooxygenase-2,COX-2)蛋白的表达情况,评价 COX-2 蛋白表达水平与 NPC 临床病理参数的关系, 探讨 COX-2 蛋白对于 NPC 发生发展情况的预测价值及其 临床意义。 方法:方法:分别用免疫组织化学方法(immunohistochemistry,IHC)及蛋
3、白印迹方法 (western blot)检测组织中 COX-2 蛋白的表达情况, 并进行分析。 收集鼻咽癌患者 47 例,全部经病理检测证实,其中用于免疫组织化学检测的鼻咽癌蜡块组织 33 例,用于蛋白印迹方法检测的新鲜活检鼻咽癌组织 14 例;另外收集同期鼻咽炎 患者 24 例作为对照组,亦全部经病理检测证实,用于免疫组织化学检测及蛋白 印迹方法检测的各 12 例。 结果:结果:免疫组织化学方法结果显示 COX-2 蛋白在鼻咽癌组织的阳性表达率为 81.8%(27/33) ,在鼻咽炎组织的阳性表达率为 25%(3/12) ,两者表达差异有统 计学意义(P=0.001) 。蛋白印迹方法结果显示
4、,在两种组织中 COX-2 蛋白表达的 相对值分别为 1.2580.034 和 0.4870.076,在鼻咽癌组表达显著增高 (P=0.000) 。 结论:结论:COX-2 蛋白在鼻咽癌组织中高度表达,与鼻咽癌的转移相关,有可能作 为判断鼻咽癌生物学行为、转移潜能的指标。 关键词:关键词:COX-2 蛋白;鼻咽癌;免疫组织化学;蛋白印迹 3 Expression and clinic significance of cox-2 protein in nasopharyngeal carcinoma Abstract Objective:To study the expression of cy
5、clooxygenase-2 protein in nasopharyngeal carcinoma, evaluate the relevance between the level of cyclooxygenase-2 protein expression with the clinic pathology parametric in nasopharyngeal carcinoma. Investigate its predicting value and clinic significance for the development situation on nasopharynge
6、al carcinoma. Methods: The immunohistochemistry method and Western blot method were used to determine the expression of COX-2 protein in all specimens. the consequence analyzed.47 cases of nasopharyngeal carcinoma patients were collected, which confirmed by biopsy. Of the total 33 cases by IHC and 1
7、4 cases by Western Blot. At the same time, 24 nasopharyngitis tissues were detected also rolled in as the control. Among the total 12 cases by IHC and 12 cases by Western Blot. Results:Positive staining rate of COX-2 in specimen of nasopharyngeal carcinoma (81.8%) was significantly higher than that
8、of nasopharyngitis tissues (25%)( P = 0.001). Western Blot assay revealed that relative COX-2 protein level was 1.258 0.034 and 0.487 0.076 respectively in the two tissues,which was significantly higher in nasopharyngeal carcinoma(P=0.000). Conclusions: The expression of COX-2 is enhanced in NPC,whi
9、ch correlated with metastasis of NPC, and it may become a mark of judgement on its biological behaviour and metabasis potentiality. 4 Key words:Cox-2 protein;Nasopharyngeal carcinoma;Immunohistochemistry; Western blot Qiancheng JING(Otorhinolaryngology) Directed by Prof. Zhiqiang LUO 5 前 言 鼻咽癌在世界各大洲
10、均有发现,有明显的种族易感性、地区聚集性和家族倾 向性,与EB病毒(EBV)感染、遗传、饮食习惯及环境因素密切相关 1。其中全 球80%的NPC发生在中国南方和东南亚地区,是我国最常见的头颈部恶性肿瘤之 一,约占头颈部恶性肿瘤的80%,素有“广东瘤”之称,其也是世界上唯一被冠 以地名的恶性肿瘤。 国内鼻咽癌分布以广东肇庆、 佛山及广西梧州等为高发中心, 发病率由南到北逐渐降低。中国南方五省(广东、广西、福建、湖南、江西)年 发病率可达1025/10万,男女之比为23:1,儿童少见,3060岁为发病高峰 期。 由于鼻咽部解剖结构复杂,鼻咽癌发病部位隐蔽,早期缺乏特异性症状,多 数患者难以早发现、
11、早治疗。我国鼻咽癌的组织学类型主要为非角化型,又以低 分化型鳞癌多见,易出现颈部淋巴结及远处转移,在初诊的患者中,、期鼻 咽癌约占总病例的 70%左右。由于非角化癌对放射线敏感,因此放射治疗一直是 其首选的标准治疗方法,但单纯放射治疗鼻咽癌的 5 年生存率仅 70%左右,而晚 期鼻咽癌(、)的 5 年生存率更低,约 10%-25%。不同的鼻咽癌患者在病理 类型、肿瘤分化程度、就诊时病变严重程度、临床表现、体质状况、对放化疗敏 感性方面都存在着不同程度的差异。 近年来,随着诊疗技术的提高,鼻咽癌的诊断和治疗有了很大的进展,五年 生存率明显提高。但对于早期诊断、临床分期、疗效判断和预后预测等方面仍
12、不 够理想,因此,寻找与鼻咽癌早期诊断及预后相关的特异性分子标志物对实现鼻 咽癌的早期诊断、进展监测以及个体化治疗具有重要意义。 环氧合酶(Cyclooxygenase,COX)是花生四烯酸合成前列腺素的一个限速 酶,可将花生四烯酸转变为各种前列腺素产物,维持机体的各种病理生理过程。 目前发现哺乳动物 COX 至少有两种同工酶,即 COX-1 和 COX-2,两者虽有 61 % 的同源性,但它们在表达调控、定位分布和功能上明显不同 2。人 COX-1 编码 的蛋白在大多数组织和细胞中稳定表达, 被称为 “管家基因(home keepinggene)” , 属结构型表达蛋白,有多种生理功能,如保
13、护胃黏膜、维持肾血流、促进血小板 聚集等。而 COX-2 为诱导性表达,静息时并不表达,在大多数正常组织难以发 现,一般只在受刺激时迅速合成,这种刺激因子可为细胞因子、生长因子、促癌 6 剂以及癌基因产物等,被称为“快反应基因” 3。 近年研究表明,诱导型COX-2在多种恶性肿瘤中有较高表达,在肿瘤的发生 及发展等多个环节发挥重要作用。 COX-2可促进细胞增殖 4、 抑制肿瘤细胞凋亡、 促进肿瘤新生血管形成 5 、抑制机体的免疫反应6、增加转移潜能、抑制DNA 修复及可能是联系炎症与癌变的重要因素之一 7-8。在结肠癌、直肠癌、胃癌、 肺癌、食管癌、前列腺癌、喉癌等组织中均检测到COX-2的
14、高表达 ,但有关鼻咽 癌组织中COX-2表达情况的报道甚少,且结果不一。既往研究表明,在鼻咽癌 COX-2及其mRNA的表达上调,表达阳性率为61.67%90%。Peng JP 9等研究发 现鼻咽癌组织中COX-2的阳性表达率显著高于鼻咽部黏膜组织,并发现其在 N1-N3组与N0组差异有显著性(P=0.006) ,与淋巴结转移与否亦有关。 除COX-2在促进鼻咽癌发生发展外, 尚发现选择性COX-2抑制剂不仅对机体 免疫监视、肿瘤血管形成及细胞增殖有影响,它还有在一定氧化压力下表现出抗 诱变效应。另外,COX-2抑制剂可以提高肿瘤组织对放疗的敏感性,可能是由于 其能抑制因放疗而损伤的肿瘤DNA
15、重新修复,这在Raju U等 10的实验中得到了验 证。COX-2抑制剂对鼻咽癌的作用机制尚不十分清楚,众多实验研究表明,抑制 剂竞争性与COX-2结合,抑制其作用于底物,从而减少前列腺素的合成,进一步 抑制肿瘤细胞的分裂,促进细胞凋亡,抑制肿瘤的血管生成,减少自由基分子产 生, 降低突变的可能性, 增强机体的免疫力 11, 从而达到防治肿瘤的目的。 总之, 无论是独立应用还是作为放疗的辅助治疗或与其它抗癌药合用, COX-2抑制剂将 为鼻咽癌的预防和治疗提供新的靶点。 本研究分别用免疫组织化学方法及蛋白印迹方法检测鼻咽癌组织及鼻咽炎 组织中 COX-2 蛋白的表达情况,并进行分析比较,探讨
16、COX-2 在鼻咽癌的发生 发展及预后方面所起的作用及可能的作用机制。 7 一、实 验 材 料 1.1 资料收集 标本取自 2007 年 10 月至 2008 年 9 月就诊于我院并活检的鼻咽癌组织,标 本均经病理学确诊。患者入院前均未接受过非甾体类抗炎药物治疗及放、化疗, 对照组取同期确诊的鼻咽部炎症组织。患者均签署知情同意书。用于免疫组织化 学方法检测的实验组共 33 例,其中男 25 例,女 8 例,2970 岁,平均 49.8 岁; 组织学类型高、中分化鳞癌 2 例,低分化鳞癌 31 例;按 2002UICC 鼻咽癌分级标 准,T1-2 级 15 例,T3-4 级 18 例;根据有无淋
17、巴结转移分为转移组 20 例,未转 移组 13 例。对照组共 12 例,其中男 7 例,女 5 例,2162 岁,平均 45.8 岁。 用于蛋白印迹方法检测的实验组共 14 例,其中男 9 例,女 5 例,年龄 2974 岁,平均 52.0 岁;组织学类型高、中分化鳞癌 2 例,低分化鳞癌 12 例;对照组 共 12 例,其中男 8 例,女 4 例,年龄 2372 岁,平均 47.5 岁。 1.2 受试对象纳入标准 1.2.1 标本均经病理学检查确诊。 1.2.2 患者的相关资料完整,包括姓名,性别,年龄,地址,联系方式,病案 号,主诉,现病史,体格检查,特殊检查、病理分级、T分期等。 1.3
18、 主要实验设备、仪器(见表一) 8 表一、试验所用设备、仪器 设备名称 规格型号 生产厂家 高速冷冻离心机 5417R 德国eppendorf公司 酸度计 PP15 德国 数码摄影显微镜 BX-51 日本奥林巴斯 微量紫外分光光度计 LAMBDA25 美国PE公司 台式高速离心机 5810 德国基因公司 二维电泳系统 EITNDALTSIX 美国安玛西亚公司 Finnpipette 定量可调式移液器 广州雷得生物技术有限公司 制冰机 雪花型70KG 多功能电转移仪 03061800 德国eppendorf公司 超速冷冻离心机 CP100MX 日本日立公司 低温恒温水浴箱 782302 丹麦He
19、to 纯水器 MAIMA 英国Eiga 连续变倍体视显微镜 SMZ-1500 日本尼康公司 冷藏冰箱 TS-92 河南新飞电器有限公司 双蒸水机 SZ-93 上海亚荣生化仪器厂 70冰箱产品 ULTRA-LOW 日本三洋公司 去离子水制备机 德国ELGA公司产品 电子天平 BL-220H 日本Shzmadzu公司 摇床 TS-92 金坛市恒丰仪器厂 烤箱 上海跃进医疗器械厂 1.4 主要实验试剂 1)兔抗人环氧化酶 2 免疫组化单克隆抗体:编号 RMA-0549,购于福州迈新生物 技术有限公司,4避光保存于冰箱中,无需稀释型。 2)辣根酶标记山羊抗兔 IgG(H+L),编号 ZB-2301,购
20、于北京中杉金桥生物技术 有限公司,-20冰箱保存。 3)即用型快速免疫组化 maxvision TM试剂盒:编号 KIT5004,购于福州迈新生物 技术有限公司。 9 4)DAB 显色试剂盒:编号 DAB-0031/1031,购于福州迈新生物技术有限公司。使 用时临时配置,30 分钟内有效。 5) 苏木素体细胞快速染色液: 编号 CTS-1099, 购于福州迈新生物技术有限公司。 6)PBS 缓冲液(PH7.2-7.4) :定容双蒸馏水 1000ml,称量 Nacl8.0g, Kcl0.20g,NaHPO4 3.748g,KHPO40.2g,加入双蒸馏水中充分溶解并混匀。 7)柠檬酸盐缓冲液(
21、PH6.0) :定容双蒸馏水 1000ml,称量柠檬酸三钠 3g,柠檬 酸 0.4g 加入双蒸馏水中充分溶解并混匀。 8)中性树脂:购于北京中杉金桥生物技术有限公司。 9) 兔抗人环氧化酶 2 蛋白印记多克隆抗体,购于 SANTA CRUZ 公司。 10) BCA 法蛋白定量试剂盒:货号 GK5011,上海捷瑞生物工程有限公司。 11)通用蛋白裂解/抽提试剂盒:编号 P0027,碧云天生物技术研究所。 12)SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液(5) :编号 P0015,碧云天生物技术研究所。 13)SDS-PAGE 凝胶配制试剂盒:编号 P0012A,碧云天生物技术研究所。 14)蛋白分子量标准
22、:编号 P0062,碧云天生物技术研究所。 15)5电泳缓冲液:定容去离子水 1000ml,称量 Tris 15.1g,甘氨酸 94g, SDS 5g 依次加入去离子水中并完全溶解,充分混匀。 16)转膜缓冲液:定容去离子水 800ml,依次称量 Tris 5.8g,甘氨酸 2.9g,SDS 0.37g 依次加入去离子水中充分溶解并混匀,加入甲醇 200ml 定容至 1000ml。 17)5TBST 的配制(0.05mol/L) :定容 1000 ml 双蒸水,称量 Tris 12.1g,NaCl 40g 加入双蒸水中充分溶解并混匀,浓盐酸调节 pH 值至 7.6,常温保存。临用前 配成 1T
23、BS1000ml,加入 0.5 ml Tween-20。 18)封闭液:1TBS30ml 中加入脱脂奶粉 1.5g。4冰箱保存可使用一周。超过 一周重新配制。 19) Western 一抗二抗去除液:编号 P0025,碧云天生物技术研究所。 20)Actin 抗体:编号 AA128,碧云天生物技术研究所。 21)PVDF 膜:上海捷瑞生物工程有限公司。 22)BeyoECL Plus(超敏 ECL 化学发光试剂盒):编号 P0018 ,碧云天生物技术 研究所。 23) 显影定影试剂盒:编号 P0019, 碧云天生物技术研究所。 10 二、实验方法及步骤 1、免疫组织化学染色(IHC)步骤: 切
24、片:切片机调制厚度为 4 微米,所切标本贴片于经多聚赖氨酸处理过的玻片 上, 60烤片 20 分钟备用。 脱蜡:二甲苯脱蜡 2 次,每缸 10 分钟。 水化:100%,95%,80%的梯度酒精各一缸,依次进行水化,每缸 5 分钟。 冲洗:自来水冲洗 5 分钟,PBS 缓冲液冲洗 3 次,每次 3 分钟。 抗原修复:用枸橼酸钠缓冲液(pH6.0)行煮沸热修复,持续 10 分钟。 冲洗:PBS 缓冲液冲洗 3 次,每次 3 分钟。 封闭:每张玻片用 3%双氧水 1 滴(约 50 微升)室温封闭 10 分钟。 冲洗:PBS 缓冲液冲洗 3 次,每次 3 分钟。 一抗孵育:每张玻片滴加兔抗人环氧化酶
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- COX 蛋白 鼻咽癌 中的 表达 及其 临床意义
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