HIF-1α及VEGF在大鼠视网膜缺血再灌注损伤中的作用.pdf
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1、江西医学院学报2 0 0 9 年第4 9 卷第1 0 期 A c t aA c a d e m i a eM e d i c i n a ed i a n g x i2 0 0 9 。V o l4 9 N o1 0 H I F - l a 及V E G F 在大鼠视网膜 缺血再灌注损伤中的作用 张小年。游志鹏。汪昌运 ( 南昌大学第二附属医院眼科,南昌3 3 0 0 0 6 ) 1 9 摘要:目的探讨缺氧诱导因子一l a ( H I F 一1 a ) 及血管内皮牛长网子( V E G F ) 在大鼠视网膜缺m 再灌注损伤中的作 用。方法建讧大鼠视网膜缺m f l f 灌注模型。7 0 只S D
2、 大鼠随机分为缺m 阿灌注组和对照组每组3 5 只。缺血 再灌注组大鼠结扎左侧颈总动脉。对照组大鼠左侧颈总动脉不结扎。每组按再灌注后小同时间段f l f 分为1 、6 、1 2 、 2 4 、4 8 、7 2 、1 4 4h 组每组5 只人鼠。以免疫组织化学法榆测视 I ) 9 膜I | IH I F 一1 口和V E G F 的表达。结果缺吼阿灌 注组在阿灌注后6h 开始榆测到H I F V 一1 n 和V E G F 有表达。2 4h 表达最强。对照组未检测到H I F l a 和V E G F 的 表达。结论H I F - I a 在视网膜缺I 缸 l 灌注损伤中发挥霞要作t t l ,
3、V E G F 在视网膜缺m f l 灌注损伤中的表达I | 能受 H I 卜1 a 的诱导而发挥作用。 关键词:缺氧诱导因子l a ;血管内皮生长因子;缺血再灌注损伤;视网膜疾病;动物。实验;大鼠 中图分类号:R 一3 3 2 文献标识码:A 文章编号:l o o o 一2 2 9 4 ( 2 0 0 9 ) 1 0 - - 0 0 1 9 - - 0 3 T h eE x p r e s s i o no fH I F 一1 伍a n dV E G F i nR a t SR e t i n aI n ju r e db yI s c h e m i a r e p e r f u s i
4、 o n Z H A N GX i a o - n i a n ,Y O UZ h i p e n g 。W A N GC h a n g - y u n ( D e p a r t m e n to O p h t h a l m o l o g y ,t h eS e c o n dA i l i a t e dH o s p i t a l o fN a n c h a n gU n i v e r s i t y ,N a n c 。h a n g3 3 0 0 0 6 ,C h i n a ) A B S T R A C T :O b i e c t i v e T oi n v e
5、 s t i g a t et h ee x p r e s s i o no fh y p o x i ai n d u c i b l ef a c t o r la l p h a ( H I F l a ) a n dv a s c u l a re n d o t h e l i a lg r o w t hf a c t o r ( V E G F ) i nr a t Sr e t i n ai n j u r e db yi s c h e m i a r e p e r f u s i o n M e t h o d s T h em o d e lo fr e t i n
6、a li s c h e m i a r e p e r f u s i o nw a ss e tu pi n7 0S Dr a t s ,w h i c h w e r ed i v i d e di n t ot w og r o u p sw i t h3 5r a t si ne a c h :i s c h e m i a r e p e r f u s i o ng r o u pa n dc o n t r o lg r o u p T h ec o m m o nc a r o t i da r t e r yo fe a c hr a tw a sl i g a t e d
7、 ,a n dt h er i g h ts i d ew a st h ec o n t r 0 1 E v e r yg r o u p w a ss u b d i v i d e di n t og r o u p1 ,6 ,1 2 ,2 4 ,4 8 ,7 2a n d1 4 4h o u r sa f t e ri s c h e m i a r e p e r f u s i o ni n j u r y ,a n d w i t h5r a t si ne a c hg r o u p P r o t e i n so fH I F l ea n dV E G Fw e r e
8、m e a s u r e db yI m m u n o h i s t o c h e m i s t r y ( I H C ) m e t h o di nr a t Sr e t i n a R e s u l t s I ni s c h e m i a r e p e r f u s i o ng r o u p ,e x p r e s s i o no fH I F 一1 a a n dV E G Fw a sd e t e c t e da tt h e6h o u ra f t e ri s c h e m i a r e p e r f u s i o n 。r e a
9、 c h e dt h eh i g h e s tl e v e la tt h e 2 4h o u r ,a n dw e a k e n e dg r a d u a l l yl a t e r N oe x p r e s s i o n so fH I F l aa n dV E G Fw e r ef o u n di nt h e c o n t r o lg r o u p C o n c l u s i o nH I F 一1 aa n dV E G Fm a yp l a ya ni m p o r t a n tr o l ei nr e t i n a li s c
10、 h e m i a r e p e r f u s i o ni n j u r y ,a n dt h et w of a c t o r sm a yr e l a t i v et ot h er e t i n a li s c h e m i a r e p e r f u s i o ni n j u r y K E YW O R D S :h y p o x i ai n d u c i b l ef a c t o r - l a l p h a ;v a s c u l a re n d o t h e l i a lg r o w t hf a c t o r ; r e
11、 p e r f u s i o ni n ju r y ;r e t i n a ld i s e a s e ;a n i m a l s ,l a b o r a t o r y ;r a t s 视网膜缺血再灌注损伤的机制,目前大多数学者认为其是一个多因素综合作用的结果,它包括氧 收稿日期:2 0 0 9 - - 0 6 2 2 作者简介:张小年( 1 9 8 3 一) 。女,硕士。住院医师,主要从事青光眼的临床诊疗研究。 通信作者:游志鹏,博士主任医师。教授。E m a i l :y z p 7 4 s i n a c o r n 。 万方数据 2 0 江西医学院学报2 0 0 9
12、年第4 9 卷第1 0 期 A c t aA c a d e m i a eM e d i c i n a eJ i a n g x i2 0 0 9 ,V o l4 9 。N o1 0 自由基的作用、微血管损伤和白细胞的作用以及细 胞内钙的超载现象等。缺氧诱导因子一1 a ( h y p o x i a i n d u c i b l e a c t o r la l p h a ,H I F - 1 a ) 是缺氧条件下 广泛存在于哺乳动物和人体内的一种转录因子,能激 活许多缺氧反应性基因的表达,是哺乳动物和人在缺 氧条件下维持氧稳态的关键性物质心 。H I F - l a 是缺 血缺氧诱
13、导细胞产生的核转录因子,能诱导下游血管 内皮生长因子( v a s c u l a re n d o t h e l i a lg r o w t hf a c t o r , V E G F ) 基因的表达 3 。本研究以免疫组织化学法 检测H I F l a 及V E G F 在大鼠视网膜缺血再灌注损 伤中的表达,探讨H I F - l a 及其诱导的V E G F 在视 网膜缺血再灌注损伤的作用。 1 材料和方法 1 1实验动物及分组 健康S D 大鼠7 0 只( 由南昌大学医学院动物科 学部提供) ,体质量2 0 0 2 5 0g ,鼠龄8 1 0 周,雌雄 不限。随机分为缺血再灌注组
14、和对照组,每组3 5 只。每组按缺血再灌注后不同时间段再分为1 、6 、 1 2 、2 4 、4 8 、7 2 、1 4 4h 组,每小组5 只大鼠。 1 2 主要试剂 小鼠抗大鼠H I F l a 单克隆抗体购自美阁N e o - m a r k e r s 公司,小鼠抗大鼠V E G F 单克降抗体购自 美国s a n t ac r u z 公司。兔抗鼠S P 一9 0 0 0 试剂盒、 D A B ( Z L I 一9 0 3 2 ) 显色试剂盒均购自北京中杉金桥生 物技术有限公司。 1 3 视网膜缺血再灌注模型的建立 结扎大鼠左侧颈总动脉建立视网膜缺血再灌注 模型。将戊巴比妥按3 0m
15、 g k g 的剂量对大鼠进行 腹腔内注射。酒精消毒颈部皮肤,沿颈正中剪开皮 肤、皮下组织、肌肉层,分离出气管前筋膜,剪开气管 前筋膜,找出其左侧颈总动脉,以丝线结扎。以0 5 的托品卡胺充分散瞳,直接检眼镜观察眼底,以视网 膜颜色苍白为缺血形成的标志。右侧作为自身对照 眼。结扎1h 后,松开丝线。对照组除左侧颈总动 脉分离后不结扎外,其它方法同前。分别在缺血再 灌注后1 、6 、1 2 、2 4 、4 8 、7 2 、1 4 4h 行断颈处死大鼠, 迅速取出眼球,4 多聚甲醛固定,石蜡包埋,切片。 1 4 免疫组织化学实验法 采用链霉菌抗生物素蛋白一过氧化物酶连接法 ( S P 法) 进行检
16、测,依照试剂说明书:石蜡切片置烤 箱5 5 6 0 约l 2h 以防脱片,常规脱蜡,双蒸水 漂洗5m i n 3 次;切片放入p H6 0 的柠檬酸盐缓 冲液,置高压锅中水浴加热至沸腾,保持喷气2r a i n 后,再室温自然冷却约3 0m i n ,P B S 漂洗5r a i n 3 次;加3 双氧水灭活内源性过氧化物酶,置室温 5 1 0m i n ,蒸馏水漂洗5m i n 3 次;滴加正常山羊 血清封闭液,室温孵育2 0m i n ;滴加1 :1 0 0 稀释的 小鼠抗大鼠H I F - l a ,1 :2 0 0 小鼠抗大鼠V E G F , 4 过夜,P B S 漂洗5m i n
17、X3 次;滴加生物素标记 的山羊抗兔I g G ,置搴温2 0m i n ,P B S 漂洗5r a i n 3 次;滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液,3 7 孵育 1 0 1 5m i n 。P B S 漂洗5m i n 4 次;滴加D A B 显 色剂,镜下控制显色,自来水充分漂洗;苏木精复染 约2 5S ,1 盐酸酒精分化约5 0S ,氨水返蓝,自来水 充分漂洗;苏木精轻度复染,脱水、透明、封片,光学 显微镜观察拍照。阴性对照:根据双盲法原则,以 P B S 液代一抗,其余步骤同上。 采用I m a g e P r oP l u s5 0 图像分析系统进行图 像分析,H I F - l a
18、 与V E G F 免疫组化染色切片,阳性 染色为棕黄色,每个标本各取一张,在同一放大倍率 下随机选择5 个不同视野,测最窗口区域内的累计 光密度( I O I ) 值) ,取平均值。 1 5 统计学方法 实验数据以S P S S1 3 0 统计软件包处理,采用 单因素方差分析,实验数据以i 5 表示,P 0 0 5 判定差异有显著性。 2结果 2 1 视网膜中H l F - l n 蛋白的表达 缺血再灌注组视网膜中H I F - l a 在再灌注后6h 开始表达,在2 4h 表达最强,可见H I F l a 主要在视 网膜神经节细胞层表达,内核状层亦可见少量表达。 对照组在缺血再灌注后未能检
19、测到H I F - l a 的表 达。2 组视网膜缺血再灌注各时段H I F l a 蛋白平 均光密度( I O D ) 的变化见表1 。 表12 组视网膜缺血再灌注各时段H I F - l a 蛋白平均I O D 值的变化( i 士s ) 与对照组比较,* P = 0 0 0 0 I 与2 4h 比较G P = 0 0 0 0 万方数据 2 2 视网膜中V E G F 蛋白的表达 缺血再灌注组视网膜中V E G F 在再灌注后6h 开始表达,在2 4h 表达最强,可见V E G F 主要在视 网膜神经节细胞层,内核状层亦可见表达。对照组 2 l 在缺血再灌注后未能检测到V E G F 的表达
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- HIF VEGF 大鼠 视网膜 缺血 灌注 损伤 中的 作用
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