人树突状细胞与肝癌细胞系HLE融合细胞的构建.pdf
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1、基金项目: 卫生部部属 (管) 医疗机构临床学科重点资助项目 (2001) 作者单位: 北京大学人民医院肝胆外科中心 通讯作者: 冷希圣, E-mail: L 基础研究 人树突状细胞与肝癌细胞系 HLE 融合 细胞的构建 关心彭吉润冷希圣 【摘要】 目的构建人源树突状细胞 (DC) 与肝癌细胞系 HLE 的融合细胞。方法含 15%FCS 的 RPMI 1640 培养 HLE 细胞,用 GM-CSF 和 IL-4 培养成人外周血单核细胞 7 d,并用 TNF-和 PGE2促 成熟 2 d 后获得成熟 DC;用荧光染料 PKH67-GL (绿色荧光) 和 PKH26-GL (红色荧光) 分别标记
2、DC 和 HLE 细胞, 以 50%聚乙二醇和 10%二甲基亚砜为融合剂, 构建可供流式细胞仪快速筛选的融合细胞。 结果成功构建具有红、 绿双色荧光的人源 DC 与 HLE 的融合细胞,融合率为16.8%。结论利用 PKH67-GL 和 PKH26-GL 为标记, 可获得便于快速识别和筛选的 DC 与肝癌细胞的融合细胞, 为使用融 合 DC 疫苗治疗肝癌奠定了基础。 【主题词】 人树突状细胞; 肝癌细胞系 HLE 细胞; 融合细胞 Establishment of dendritomas by fusion of human dendritic cells with human hepatoc
3、ellular carcinoma cell line HLE cellsGUAN Xin,PENG Ji-run,LENG Xi-sheng. Department of Hepatobiliary Surgery,Peking University Peoples Hospital,Beijing 100044,China Corresponding author:LENG Xi-sheng,E-mail: Lengxs2003Myahoo. Nom 【Abstract】 ObjectiveTo construct dendritomas by fusion of human dendri
4、tic cells with HLE cells, a human hepatocellular carcinoma cell line. MethodsHLE cells were cultured in RPMI 1640 with 15% FCS. Human dendritic cells (DCs)were obtained from peripheral blood monocytes cultured in the presence of GM-CSF and IL-4 for 7 days,matured with TNF-and PGE2for 2 days. The DCs
5、 and HLE cells were labeled with green fluorescence dye PKH67-GL and red fluorescence dye PKH26-GL,respectively,and fused in 50% polyethylene glycol (PEG)+ 10% dimethyl sulfoxide(DMSO)to generate dendritomas for rapid fluorescence-activated cell sorting (FACS) . ResultsDendritomas with dual red-gree
6、n fluorescence were constructed successfully,and FACS analysis showed the effective fusion rate was 16. 8% . ConclusionWith fluorescence dyes PKH67-GL and PKH26-GL as fusion markers,dendritomas for rapid fluorescence-activated cell sorting are constructed,which may throw new light on immunotherapy o
7、f hepatocellular carcinoma. 【Subject words】 Dendritic cell; Hepatocellular carcinoma HLE cells; Dendritoma 树突状细胞 (DC) 作为功能强大的专职抗原呈 递细胞, 在抗肿瘤免疫应答中起着关键作用。1997 年,Gong 等 1 首先用完整的乳腺肿瘤细胞与培养的 DC 融合, 制成融合树突细胞瘤 (dendritoma) , 并证实 这种融合细胞能有效呈递肿瘤抗原, 诱导出特异性 抗肿瘤免疫应答。为了探讨用人源肝癌细胞系 HLE 和DC 构建融合细胞的可行性, 我们以荧光染料 PKH67-
8、GL 和 PKH26-GL 为标记, 用这两种细胞成功 构建了可用于流式细胞仪快速筛选的融合细胞。 材料与方法 1. 材料: 健康成人外周血由北京市血液中心提 供; 人肝癌细胞系 HLE 购自中国科学院上海细胞生 物学研究所。重组人 IL-4 购自美国 Promega 公司; 重组人 GM-CSF 及 TNF-购自美国 R&D 公司; PGE2、 融合剂 (50%PEG + 10%DMSO) 、 细胞膜荧光标记试 剂盒 PKH67-GL 和 PKH26-GL 均购自美国 Sigma 公 司; 灭活标准胎牛血清 (FCS) 购自美国 Hyclone 公 司; RPMI 1640 培养基购自美国
9、GIBCO 公司; 淋巴细 胞分离液 (Ficoll-Hypaque, 1.077) 购自瑞典 Pharmacia 公司; 培养瓶及培养板均为美国 Costar 公司产品; MACS CD14 正选磁珠购自德国 Miltenyi Biotec 公司; FITC-CD80、 PE-CD86、 PE-CD83 和 HLA-DR-APC 等单 抗购自美国 B. D. 公司; 流式细胞仪 (FACS Calibur) 564中华肿瘤杂志 2005 年 8 月第 27 卷第 8 期Chin J Oncol,August 2005,Vol 27,No.8 为美国 B. D. 公司产品; 激光共聚焦显微镜
10、(TCS. NT) 为德国 Leica 公司产品; 倒置荧光显微镜 (IX70) 为日本 Olympus 公司产品。 2. 人肝癌细胞系 HLE 的培养: 取 1 107液氮 冻存的 HLE 细胞, 复苏后, 加入 5 ml 培养液 (含 15% FCS、 2 mmol/L L-谷氨酰胺、 100 U/ml 青霉素和 100 g /ml 链霉素的 RPMI 1640) 洗涤、 离心。细胞沉淀 中加入前述培养液重悬, 细胞密度 1 106/ml, 移入 75 ml 培养瓶, 加足培养液,于 37、 5%CO2的孵箱 中培养, 隔日换液。融合前用 0.25%的胰蛋白酶消 化, 获取 HLE 细胞,
11、 用无血清 RPMI 1640 培养液洗 涤, 使成为单细胞悬液。 3. DC 的制备: 用淋巴细胞分离液, 以密度梯度 离心法, 从健康献血员外周血中获得 1 108个单核 细胞。按 MACS 公司提供的操作流程,用 CD14 正 选磁珠分离出 CD14+细胞约1.2 107。PBS 溶液洗 涤后, 加入 DC 完全培养基 (含 RPMI 1640、 10%FCS、 1000 U/ml GM-CSF、 500 U/ml IL-4 和100g /ml 庆大 霉素) , 调整细胞密度至 5 105/ml, 加入 6 孔培养 板,于 37、 含 5%CO2的孵箱中培养 7 d, 隔日换 液。第 7
12、 天再加入 1000 U/ml TNF-和 1 g/ml PGE2, 继续培养 2 d 促使其成熟。第 10 天收集悬浮 的 DC, 用流式细胞仪检测其 CD80、 CD86、 CD83 和 HLA-DR 分子表达情况, 并用于融合实验。 4. DC 和 HLE 细胞的荧光标记: PKH67-GL 标记 DC, 呈绿色荧光; PKH26-GL 标记 HLE, 为红色荧光。 详细操作步骤按 Sigma 公司提供的说明进行。染色 的效率用倒置荧光显微镜观察评价。 5. DC 和 HLE 细胞的融合:将已经染色的 DC 和 50 Gy 照射过的 HLE 细胞,以 1:1 的比例混合, 1000 r/
13、min 离心 10 min, 去除培养液。用无血清 RPMI 1640 培养液洗涤 2 次, 离心后弃上清, 吸净残 液, 轻敲管底使细胞呈疏松糊状。于 60 s 内滴入 1 ml 融合剂, 轻轻搅拌细胞悬液; 随后于 6 min 内缓 慢加入 10 ml 无血清的 RPMI 1640 培养液; 最后, 补 加 同样的RPMI1640培养液至40 ml, 以1000 r / min 离心 5 min, 弃上清, 然后用无血清 1640 液再洗涤 1 次。用共聚焦显微镜对融合细胞照相。用流式细 胞仪检测红绿双荧光细胞所占的百分率代表细胞融 合率。 结果 流式细胞仪检测显示, 树突状细胞的 CD8
14、3、 CD80、 CD86 和 HLA-DR 表 达 率 分 别 为 62. 0%、 90.4%、 98.5%和 99. 8% (图 1) 。倒置荧光显微镜 下观察, 荧光染料 PKH67 和 PKH26 将 DC 和 HLE 细 胞分别染上红色与绿色荧光, 其染色率均超过 95%。两种细胞融合后形成的融合细胞在共聚焦显 微镜下呈现红绿双色荧光 (图 2) , 融合效率为 16.8% (图 3) 。 图 2 激光共聚焦显微镜下所见的融合细胞 图 1 流式细胞仪检测 DC 表面标志 CD83、 CD86、 CD80 和 HLA-DR 的表达情况 讨论 许多研究表明, 将已知的肿瘤抗原或抗原肽负
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- 关 键 词:
- 树突 细胞 肝癌 细胞系 HLE 融合 构建
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