器官移植排斥反应检测新进展.pdf
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1、文章编号: 1 001 一 0 8 7 ( 2 仪 拓) 05习 5 474 ) 4中图分类号二 R 4 4 6 . 62文献标识码: A 器官移植排斥反应检测新进展 李向东 ( 山东大学齐鲁医院检验科, 山东 济南250012) 关键词: 指标检测; 排斥反应; 器官移植 器官和组织移植是20 世纪最重要的医学成就之一, 目 前移植术已成为组织、 器官功能衰竭终末阶段最有效 的治疗措施。移植术可分为自 体移植、 同种同基因移植、 同种异基因移植和异种移植, 同种异基因移植是临床最 常见的移植类型, 无论何种移植, 只要移植物表达与受者 不同的蛋白质或其他分子, 移植物就会排斥。如何早期 诊断
2、排斥反应, 是临床医生面临的重要问题。目前诊断 急性排斥反应主要依靠创伤性的穿刺移植器官, 例如心 脏移植后进行心肌、 心内膜穿刺活检。当前研究的热点 是与排斥反应有关的非创伤性检测指标, 现将近年的进 展综述如下。 一、 细胞因子的检测 器官移植排斥的发生和多种细胞因子的参与有关, 由于供受者之间组织相容性抗原不同, 器官植人后异种 抗原刺激活化受者循环中的T 细胞, 活化的c DS+ T细胞 直接攻击移植物, 而C D4+ T 细胞通过释放多种细胞因子 直接或间接损伤靶细胞, 在以上过程中, 细胞因子与细胞 因子受体结合并刺激T细胞克隆增殖是急性排斥反应的 关键步骤和中心环节, 因此细胞因
3、子检测在器官移植排 斥反应中极为重要。 器官移植发生排斥反应时, 多种细胞因子水平会增 高; 一是移植器官局部细胞因子水平, 二是血清细胞因 子, 二者往往是同步的。肝脏移植后, 发生移植排斥时, 移植肝脏单核一 巨噬细胞内表达肿瘤坏死因子( T N F ) 一 a 增加 。 肠移植后, 发生 早期排斥反应时, 移植肠勃液素 M U CZ、 M U C4表达增高, 于 扰素( IF N ) 一 丫 和T N F 一 a 表达也 增高圈。 而 移植肾 脏纤维生长因子( F G F 一 1)和纤维生长 因 子受体( F G F R ) 增高提示慢性排斥反应 。心脏移植 后撤掉免疫抑制剂发生实验性排
4、斥反应时, 心肌C D4十 细 胞、 C D S + 细胞、 白细胞介素( I L ) 一、 I L 一受体和T N F 一 日 m R N A 水平升高, 与传统的辅助性 T ( T h)细胞、 细胞毒性 T ( T c ) 细胞介导的免疫反应是一致的。但在发生临床排 斥的心脏移植患者, IL 一和IL 一受体m R N A没有明显变 化川。 肾 脏 移 植患 者, 发生 急 性排斥反应时, 移 植肾 脏显 示IL 一 2 受体表达增加。 细胞因子与移植排斥的关系不仅表现为细胞因子表 达量的变化, 其基因多态性与患者急性排斥反应的发生 及程度有一定的相关性。I L 一 10基因在一 1 0
5、8 2 位置上的多 态性, 已被确定为急性肝移植排斥反应的遗传危险因素。 肝移植患者携带I L 一 1 0 一 l o 82A等位基因发生排斥的比例 较小, T N F 、 IL 一和转化生长因子( T G F)的基因多态性没 有 发 现 和 急 性肝 移 植排斥反应有联系 5。 I L 一 2 和IF N 一 , 水平是与急性排斥反应移植血管疾病( G V D ) 密切联系 的, IL 一基因启动子区T 一 30G和I FN一 丫 基因第1 内含子 重复C A多态性影响这些细胞因子的产物水平。心脏移 植后, 分析患者IL 一和IF N 一 , 的基因多态性, 没有发现同 急性排斥反应移 植血
6、管疾病有密切联系6。由于血清细 胞因子容易受细菌、 病毒感染等因素影响, 器官移植受者 感染发生时, 某些细胞因子水平也升高, 因此血清细胞因 子水平不宜单独作为判断排斥的依据, 而局部直接测定 细胞因子基因表达的变化, 可证实和弥补不足。 细胞因子的 检测在临床排斥反应的诊断中有重要作 用。目 前检测的种类主要有 儿一、 IL 石和TNF等, 检测方 法有免疫学检测法【 如免疫斑点法、 酶联免疫吸附试验 ( E Ll s A ) 、 放射免疫法( RIA ) 和免疫印迹法等 、 生物学测 定法、 分子生物学测定法等。 二、 淋巴细胞检测 移植排斥反应主要由受者 T细胞所介导。受者体内 存在大
7、量的反应性 T 细胞, 他们能识别移植物中过客白 细胞表面的异型抗原, 因此淋巴细胞特别是 T细胞的检 测在器官移植中起到重要的作用。急性排斥反应时, 外 周血T 淋巴细胞 C D4/ C D S比值升高, 可比临床诊断早3 一 s d 。抗排斥治疗有效后, 该比值下降。感染时, C D4/ C D S 比 值会倒置。检测肾移植患儿尿中移植渗透淋巴细 胞和Tc细胞产物可用来诊断急性排斥反应川。 现在已 从基因表达水平观察各种分子的表达, 大鼠小肠移植后, 移植小肠 c 以S R O基因表达可做为检测移植排斥的指 标 8 。 用基因 芯片 技术分析超过120 。 。 个基因, 在胰岛 移植耐受小
8、鼠中发现57 个基因的表达水平较高。在发 生胰岛移植排斥小鼠中发现5 24个基因的表达水平较高, 在这5 24 个基因中, 较多数量的是T 细胞表面标记分子和 细胞毒性相关的基因, 还有一些是细胞因子、 趋化因子及 作者简介: 李向东, 男, 1 9 71 年生, 硕士, 主治医师, 主要从事肿瘤标志物的研究。 万方数据 5 4 8检验医学2 0 0 6 年第2 1 卷第5 期1 成 11 o rato ryM e d i c i n e Z (X 拓, V o l Z I . N o s . 其受体 基因 9 。 检 测方法 一 般为 流 式细胞 术。 三、 补体和粘附分子检测 当移植物抗原
9、与受者抗体结合后, 可使补体活化。 补体激活同急性排斥反应有关。细胞粘附分子可通过抗 原呈递、 介导白细胞在内皮粘附及外渗、 以及介导效应细 胞和靶细胞识别参与排斥反应发生。 移植排斥反应时发生变化的补体主要是补体降解产 物C4d , 粘附分子主要是细胞间粘附分子一 1 ( IC A M 一 1)和 血管细胞粘附分子一 l(V C A M 一 1 ) 。抗体介导的移植排斥 反应在肾移植患者中比较重要, 主要包括针对人白细胞 抗原( H LA ) 的抗体和抗体反应。抗体反应主要表现在补 体激活产物C 4d 升高, 用 E LI S A检测支气管肺泡灌洗液 ( B A L F ) 中补体激活产物C
10、 4 d , C4d 浓度升高可预测抗体 介导的肺移植排斥反应, 但需排除由于感染导致的C4d 浓度升高 “ 。 心脏移植后, 心肌膜活检后补体降解产物 c4d 免疫组化染色显示含量增加 ” 二 。 用E Ll s A测定尿可 溶性粘附分子( sl C A M 一 1 、 sVC A M 一 1)和补体降解产物 C4d , 发生排斥反应的肾移植患者尿中C4d 水平较正常对照明 显升高。在急性类固醇耐受移植排斥组, S v c A M 一 1 和5 1 - C A M 一 1 浓度明显升高, 肾移植功能稳定组 sI C A M 一 1 浓度 明显降低 ” 。肾 脏移植患者伴随着T 细胞和巨噬细胞
11、的 浸润, 肾 小管和上皮级织相容性复合物( M H C)抗原H LA- D R , 粘附分子 ICA M 一 1 、 V C A M 一 1 、 极晚期抗原礴( V L A 4) 和 淋巴细胞功能相关抗原一 1 ( LFA 一 1)盯日表达增加。用放 射性示踪剂锢一 1 1 1 一 抗一 ICA M 一 1 单克隆抗体来显示大鼠移 植肺中的ICA M 一 1 , 当发生轻微和中度肺移植排斥反应时, I C A M 一 1 含量增加 ” 。 相对于补体, 粘附分子特别是 ICA M 一 1目前在临床中 应用较多。检测肾移植后肾组织或血液中的IC A M 一 1 可 用来诊断急性排斥反应, 但在
12、其他大器官如肺、 心脏、 肝 脏等排斥反应诊断中ICA M 一 1 的应用较少。 四、 蛋白质和酶类检测 用于检测器官移植排斥的蛋白质和酶较多, 其中应 用较广的是 C 一 反应蛋白( C R P ) 。C R P是第 1 次被认识的 急性时相反应蛋白, 作为急性时相反应的一个极灵敏指 标, 可用来监测移植后的排斥反应, 目前临床主要是应用 免疫比浊法来测定 C R P 。用蛋白质谱分析的方法分析急 性肾移植排斥患者的尿标本, 可以发现 3个明显的蛋白 峰, 而急性肾小管坏死、 肾小球病、 轻微的输尿管炎症和 巨细胞病毒感染则没有发现相对应的3个明显的蛋白 峰, 鉴别这些蛋白成分可作为肾移植排
13、斥的无损伤检测 指 标 4 。 c R P 不 仅同 炎症反应有 关, 而且同移植排斥也 有关。小肠或肝移植患者, 血清人骨髓相关蛋白复合体 ( M R PS/ 1 4 ) 浓度有明显增高, 1 一 7 d 后, c R P 也增高 ” 了 。 在心脏移植患者心肌活检证实发生排斥反应时, 用E LI s A 检测显示患者血清中热休克蛋白、 。 p 一 晶状体球蛋白、 原 肌 球 蛋白 水 平明 显升高 。 急 性肾 小管损伤 患者尿p H 值降低, 在p H值 6 条件下, 患者尿中天门冬氨酸蛋白酶 和日 2 一 微球蛋白 升高, p Z 一 微球蛋白可以作为提示肾小管 损伤而用于 检测肾 移
14、植排斥的 指标 7 。 用组织化学的 方 法检测大鼠移植物壁三磷酸腺昔酶( A T Pase) 、 碱性磷酸 酶( A L p ) 、 乙酚胆碱酷酶( A c h E ) 、 一氧化氮合酶( N O S ) 、 单胺氧化酶( M A O ) , 在只进行小肠移植( SBT ) 的大鼠以 上酶的活性消失, 而进行肝/ 小肠移植( LSB T)大鼠在术后 以上多种酶的活性仍然保持, L S B T 大鼠可预防或延迟肠 移植排斥反应, 提示 A T p a s e 、 A LP、 A c h E 、 N O S 、 M A O的活 性变化均可作为诊断移植物排斥的指标。另外血 a 一 谷胧 甘肤5 一
15、 转移酶免疫测定也可诊断肝脏移植后的移植排 斥 8 。 五、 M H C 分子 现已确定, 器官移植排斥反应所识别的靶抗原主要 是表达于移植物细胞表面的 M H C分子。M H C分子可通 过直接途径和间接途径被受者 T细胞识别, 它在器官移 植排斥反应中有重要的作用。 M H C分子在体内广泛分布, 人体中 M H C有 2种形 式: 一是以膜抗原形式存在于几乎所有组织细胞表面, 二 是以可溶形式存在于血清、 尿液、 精液、 乳汁、 唾液等多种 体液与分泌液中。血清可溶性 M H C分子检测比较方便, 用E LI s A检测血清可溶性H LA一 1 抗原水平, 可提示排斥 反应! ” 。 犬
16、心脏移植后用放射性同 位素标记单克隆抗体 的方法检测血循环中M H C 一 n 水平, 心肌活检证实排斥反 应发生时, M H C 一 11 水平增高到 基础水平的2 倍z0 ; 。 但是 血清可溶性 M H C分子不稳定, M H C分子的增多, 可能是 排斥反应时产生增多, 也可能是 M H C分子与细胞膜结合 不牢固脱落较多之故。 相对于血清可溶性M H C 分子, 外周血单个核细胞表 面M H C 分子受到外界影响较小。外周血单个核细胞在 移植术后发生排斥时, 表面表达 M H C分子水平增高, 目 前 研 究的 主 要是M H C 一 11 分子。 n a v e n p o rt
17、等 2 , 研究同 种 异基因大鼠肝移植术后, 未用免疫抑制剂的存活大鼠T 淋巴细胞 M H C 一 11表达从( 34士 0 . 4 ) %( 2 / 3d ) 增加到 ( 4 . 9 士 1 . 1)%( 7 d ) , 并证实肝移植存活大鼠 经过一段时 期的排斥后, M H C 一 n表达也确实增加。环抱霉素 A ( c s A ) ( s m g k g 一 d 一 ) 口 服1 7 d 后停服, 诱导排斥耐 受, 在2 / 3 、 7 、 1 7 、 3 0 、 4 0 和1 0 0d 时测定T细胞 M H C 一 11 分 子, T细胞 M H C 一 fl 表达降低 ( 2 .
18、3 士 0 . 4 ) %, 7d 。停服 CsA后表达增高 ( 8 . 2 士 0 . 7)%, l oo d , 而同种同基因 大鼠 肝 移 植后, 没 有这种变 化。 K no oP等 2 , 研究临 床稳 定的心肺移植、 双肺和单肺移植患者, 术后均用免疫抑制 剂csA或F K506等药物治疗, 检测的血样平均浓度为 c s A : 2 3 6 。 群 m l , r 肠 0 6 : l i n g/ m l , 患 者 外 周 血 单 个核细 胞 体外用抗c D3 单抗刺激, 流式细胞术检测患者组单核细 胞表达的H LA一 D R显著降低, 平均荧光强度从对照组的 9 9 9 士 1
19、 0 5 降低到2 2 7 士 1 3 7 。分析单核细胞M H C 一 11 表达 降低可能一方面由免疫抑制药物尤其是皮质类固醇的直 接作用, 另一方面也可能是 I L 一 10 的作用, 患者组外周血 万方数据 单个核细胞分泌较高水平的I L 一 10, I L 一 10下调单核细胞表 面的M H C 一 n 表达。 目 前血清可溶性 M H C分子检测在国内应用较多。 细胞表面M H C 分子的检测还不成熟, 流式细胞术是应用 较早的方法, 最近分子生物学方法特别是荧光实时定量 聚合酶链反应( P C R ) 的应用使细胞表面 M H C分子的检 测应用日 渐广泛。 六、 其他 一氧化氮
20、( N o)有多种生理功能, 在细胞毒性宿主防 御机制及免疫调节上起重要作用, 并能抑制活化 T细胞 的增殖, 抑制免疫细胞浸润。大鼠胰腺移植后, 发生急性 移植排斥反应时, 胰腺腺泡细胞表达较高水平的诱导N O 合酶( i N o s ) 2 , 口 。 肝移植患者经肝穿刺活检证实发生早期排斥反应 时, 血清胆汁酸浓度是不发生排斥时的3 倍, 经药物治疗 排斥反应消失后, 血清胆汁酸浓度降至正常水平。感染 不会导致血清胆汁酸浓度升高, 而血清胆红素和转氨酶 与排斥反应没有明显联系24 。 女性肾移植患者接受男性供体肾脏后, 用实时定量 P C R 从肾移植患者尿液细胞中检测出了Y染色体特殊序
21、 列的基因片段。在发生排斥反应时, 这些因移植获得的 序列量值升高, 说明移植患者尿液细胞 D N A检测可作为 肾移植排斥的 指标 川。 综上所述, 目前已进行了大量有关排斥反应与测定 指标的相关性研究, 且在检测的种类和方法上有了很大 进展。由于器官移植排斥反应涉及范围广泛, 情况复杂, 现仍未找到公认的、 无创伤性的、 敏感性和特异性均足以 应用于临床监测的指标。探索、 建立敏感特异的检查方 法和客观指标, 对于诊断和预测排斥反应及其转归, 制定 个体化免疫抑制方案均具有重要意义, 因此如何有效监 测排斥反应仍是一个重要的研究课题。 参 考 文 献 t l 2 3 4 5 Tera m
22、o t o K , T a n a k a Y , K u s a n o F , e t 滋 . E x p re s s i o n o f t u m o r n e c ro s i s fact o r 一 a l p h ag e n ed u ri n gal l o g r a l一 reje c t i o nfo l l o w i n g rat l i v e r t ra n s p l a n t at i o n J Li v e r , 1 9 9 9 , 1 9 : 1 9 一 2 4 . W a s s e rb e 嗯N ,S al g ar S K ,Y
23、 a n dD ,e ta l .E x p re s s i o nof M U C Za n dM U C4 p ro te i n s and c y t o k i n e s : e a rl y m a rk e rsofi n - t e s t i n al盯 a ll reje c t i o n J . ,r r a n s p l an t atio n , 2 0()3 , 7 5 : 1 2 4 9 - 1 2 5 5. K e th y J D , V e rran D J , L u o K L , e t a l . I m m u n o l oc欲 i z
24、at io nof F G F 一 la n drece P t o rs i ngl o m e ru l ar I e s i o n sa s s oci a t e dwi th c h ro n i c h u m a n re n a l al l o g 飞 币reje c t i o n J . ,r r a n s p l a n t at i o n , 1 9 9 6 , 6 2 : 1 9 0 一 2 (X). N o rma n n SJ, Pec k A B , S ta p l e s E D , e t al . E x p e ri m e nt ala n
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