细菌脂多糖、脂蛋白和DNA对小鼠肺泡巨噬细胞体外激活的协同作用.pdf
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1、基金项目: 国家重点基础研究专项经费资助项目 (G1999054203) ; 国家杰出青年科学基金资助项目 (30325040) 作者单位: 400042 重庆, 第三军医大学大坪医院野战外科研究所第四研究室 全军交通医学研究所 创伤、 烧伤 与复合伤国家重点实验室 通讯作者: 蒋建新, Email:jiangjx cta. cq. cn 论著 细菌脂多糖、 脂蛋白和 DNA 对小鼠肺泡 巨噬细胞体外激活的协同作用 黄宏 蒋建新 朱佩芳 王正国 张道杰 杨程 【摘要】 目的 通过体外实验, 从受体水平观察细菌脂多糖 (LPS) 、 细菌脂蛋白 (BLP) 和细菌 DNA 对肺泡巨噬细胞的协同刺
2、激效应及其可能机制。方法 分离培养小鼠肺泡巨噬细胞, 随机将细 胞分为 7 组, 分别为 LPS 组、 CpG-ODN 组、 BLP 组、 LPS + CpG-ODN 组、 LPS + BLP 组、 LPS + CpG- ODN + BLP 组和培养基对照组。刺激6 h 后, 收集上清和细胞, 上清用于 TNF- 检测, 细胞用于提取 总 RNA, 通过 RT-PCR 检测主要模式识别受体 (PRRs) CD14、 SR、 TLR2、 TLR4、 TLR9 的表达。结果 LPS、 BLP 和 CpG-ODN 不仅体外能协同增加肺泡巨噬细胞释放 TNF- 等细胞因子, 而且具有协同增 强效应细胞
3、表面模式识别受体的表达, 以三者同时存在时, 协同作用最强。结论 细菌内毒素、 细菌 脂蛋白和细菌 DNA 在体外不仅能上调相互的模式识别受体, 而且具有协同增强其他细菌结构成分对 相应受体的刺激作用。 【关键词】 脓毒症; 脂多糖类; 模式识别; 肿瘤坏死因子 The synergistic effects of lipopolysaccharide,bacterial lipoprotein and bacterial DNA on mouse alveolar macrophage activation HUANG Hong,JIANG Jian-xin,ZHU Pei-fang,WAN
4、G Zheng-guo, ZHANG Dao-jie,YANG Cheng. State Key Laboratory of Trauma,Burns and Combined Injury,Research Institute for Traffic Medicine,Department Four,Institute of Field Surgery Research,Daping Hospital,Third Military Medical University,Chongqing 400042,China Corresponding authors:JIANG Jian-xin,Em
5、ail:jiangjxS cta. cq. cn 【Abstract】 Objective To investigate the synergistic effects of lipopolysaccharide(LPS) ,bacterial lipoprotein(BLP) ,and bacterial DNA on the expression of pattern recognition receptors (PRRs)on the cell surface of mouse alveolar macrophages and cellular activation at the lev
6、el of receptor and its possible mechanism Methods Mouse alveolar macrophages were isolated,cultivated and randomly divided into 7 groups:control group,LPS group,CpG oligonucleoetide(CpG-ODN)group,BLP group,LPS + BLP group,LPS + CpG-ODN group,and LPS + BLP + CpG-ODN group. Six hours later the superna
7、tants were collected to detect the level of tumor growth factor (TNF)by ELISA. RT-PCR was used to detect the expression of the main PRRs:CD14,SR,TLR2,TLR4,and TLR9. Results The TNFlevels in the supernatant were 234 pg/ ml 30 pg/ ml in the LPS group,274 pg/ ml 30 pg/ ml in the BLP group,and 308 pg/ m
8、l 28 pg/ ml in the CpG-ODN group,all significantly higher than that in the control group(92 pg/ ml 27 pg/ ml,P 0. 05) but significantly increased the up-regulation by LPS(P 0. 05) ,LPS + BLP significantly regulated the expression of TLR4 mRNA than the groups of any factor alone (all P 0. 05)and did
9、not coordinate the upregulation by LPS,however,in comparison with any combinations of the 3 factors,the combination of LPS,BLP,and ODN up-regulated the expression of TLR9 mRNA the most strongly(all P 0. 05) , 但能显著增强 LPS 的上调作用 (P 0. 05)(表 2) 。LPS + BLP 联合刺激能明显上 调 TLR4 表达, 分别明显高于单因素刺激组 (P 0. 05) , BLP
10、 虽无 协同增强 LPS 的上调作用, 但 LPS、 BLP 和 ODN 三 者联合刺激时细胞内 TLR9 mRNA 最多, 均明显高 于两两刺激组 (P 0. 05) 。 讨论 随着近年来对脓毒症发病机制研究的日益深 入, 人们不仅逐步阐明了细菌内毒素的致病作用和 机制, 而且也逐步认识到了细菌脂蛋白、 细菌 DNA 等其他细菌成分在细菌感染中的致病作用。特别是 近年来随着 LPS 受体的发现 5-7, 在宿主效应细胞 表面也分别发现了细菌其他成分的作用受体, 如细 菌脂蛋白和细菌 DNA 的受体分别为 TLR2 8和 TLR9 10。Janeway5将这些分布于宿主细胞表面能 特异识别病原
11、菌特有结构的膜分子统称为模式识别 受体 (PRRs) 。研究证实, 这些 PRRs 是宿主感知病 原菌入侵、 以及介导病原菌激活天然免疫系统的首 要环节, 在脓毒症的发生发展过程中发挥极其重要 的调控作用 11, 12。为此, 本研究以肺泡巨噬细胞为 对象, 采用体外实验, 进一步从受体水平观察了细菌 LPS、 BLP 或 CpG-ODN 的协同致病作用。 TNF- 是参与脓毒症发生发展过程中的关键细 胞因子之一 13。本研究结果首先显示, 细菌 LPS、 BLP 和 CpG-ODN 单独刺激均可使肺泡巨噬细胞产 生 TNF- 明显增多, 联合、 特别是三者联合刺激时 细胞释放细胞因子进一步增
12、多。研究结果与体内实 验结果一致。近年有其他研究也显示, BLP 体外刺 激能引起小鼠 B 细胞和巨噬细胞释放 TNF-、 IL- 6 9, 14, 激活人中性粒细胞 (PMN) 和人脐静脉内皮 细胞, 使细胞表面 CD11b/ CD18、 细胞间黏附分子表 达上调, 促进 PMN 呼吸爆发 15, 同时也具有协同增 强 LPS 的生物学作用 8。此外, 有研究显示, 细菌 DNA 能直接活化小鼠巨噬细胞, 诱导小鼠巨噬细胞 释放 TNF-、 IL-12、 NO 等细胞因子增加 16, 17, 协同 LPS 激活 RAW264. 7 巨噬细胞 17。上述结果进一 步证实, 细菌 LPS、 脂蛋
13、白和细菌 DNA 不仅自身均 具有免疫活性, 而且相互间具有明显的协同增强 效应。 为了揭示细菌 LPS、 BLP 和细菌 DNA 的协同效 应及其可能机制, 本研究首次观察了这三种细菌结 构成分对效应细胞表面多种相关 PRRs 表达的影 响。CD14、 TLR4 和 SR 均是 LPS 作用相关受体, 前 两者与 LPS 激活细胞有关 18, 19, 后者是介导细胞清 除 LPS 的重要防御受体 20, 21。研究结果显示, 不仅 LPS 能上调肺泡巨噬细胞内 CD14 、 SR mRNA 表达, BLP 和 CpG-ODN 刺激也可明显上调 CD14、 SR 表达 (P 0. 05) 。在
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