GBT 12391-1990.pdf
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1、123911990 中华人民共和国国家标准 中华人民共和国国家标准 食物中核黄素的测定方法 食物中核黄素的测定方法 Method for determination of riboflavin in foods Method for determination of riboflavin in foods GB/T 123911990 GB/T 123911990 1 主题内容与适用范围 1 主题内容与适用范围 本标准规定了用微生物法和荧光法测定食物中核黄素含量。 本标准规定了用微生物法和荧光法测定食物中核黄素含量。 本标准适用于各类食物中核黄的测定。 本标准适用于各类食物中核黄的测定。 第一
2、篇 微生物法 第一篇 微生物法 2 原理 2 原理 某一种微生物的生长(繁殖)必需某些维生素。例如干酪乳酸杆菌 (Lactobacillus casei,简称 L.C. )的生长需要核黄素;培养基中若缺乏这 种维生素该细菌;便不能生长。在一定条件下,该细菌生长情况。以及它的代谢 物乳酸的浓度与培养基中该维生素含量成正比, 因此可以用酸度及混浊度的测定 法来测定样品中核黄素的含量。 某一种微生物的生长(繁殖)必需某些维生素。例如干酪乳酸杆菌 (Lactobacillus casei,简称 L.C. )的生长需要核黄素;培养基中若缺乏这 种维生素该细菌;便不能生长。在一定条件下,该细菌生长情况。以
3、及它的代谢 物乳酸的浓度与培养基中该维生素含量成正比, 因此可以用酸度及混浊度的测定 法来测定样品中核黄素的含量。 3 试剂 3 试剂 本实验用水均需蒸馏水。试剂纯度均为分析纯。 本实验用水均需蒸馏水。试剂纯度均为分析纯。 31 冰乙酸。 31 冰乙酸。 32 甲苯。 32 甲苯。 33 无水乙酸钠。 33 无水乙酸钠。 34 乙酸铅。 34 乙酸铅。 35 氢氧化铵。 35 氢氧化铵。 36 干酪乳酸杆菌(Lactobacillus casei ATCC 7489) 。 36 干酪乳酸杆菌(Lactobacillus casei ATCC 7489) 。 37 盐酸:0.1 mol/L。 3
4、7 盐酸:0.1 mol/L。 38 氢氧化钠:1 mol/L 和 0.1 mol/L。 38 氢氧化钠:1 mol/L 和 0.1 mol/L。 39 0.9%氯化钠溶液(生理盐水) :使用前应进行灭菌处理。 39 0.9%氯化钠溶液(生理盐水) :使用前应进行灭菌处理。 310 核黄素标准储备液(25 ug/mL) :将标准品核黄素粉状结晶置于真空干燥 器或盛有硫酸的干燥器中。经过 24 h 后。准确称取 50 mg,置于 2 L 容量瓶中, 加入 2.4 mL 冰乙酸和 1.5 L 水。将容量瓶置于温水中摇动,待其溶解,冷至室 温,稀释至 2 L,移至棕色瓶内,加少许甲苯盖于溶液表面,于
5、冰箱中保存。 310 核黄素标准储备液(25 ug/mL) :将标准品核黄素粉状结晶置于真空干燥 器或盛有硫酸的干燥器中。经过 24 h 后。准确称取 50 mg,置于 2 L 容量瓶中, 加入 2.4 mL 冰乙酸和 1.5 L 水。将容量瓶置于温水中摇动,待其溶解,冷至室 温,稀释至 2 L,移至棕色瓶内,加少许甲苯盖于溶液表面,于冰箱中保存。 311 核黄素标准中间液(10 ug/mL),准确吸取 20 mL 核黄素标准储备液,加 水稀释至 50 mL。 311 核黄素标准中间液(10 ug/mL),准确吸取 20 mL 核黄素标准储备液,加 水稀释至 50 mL。 312 核黄素标准中
6、间液(0.1 ug/mL) ,准确吸取 1.0 mL 中间液于 100 mL 容 量瓶中,加水稀释至刻度,摇匀。每次分析要配制新标准使用液。 312 核黄素标准中间液(0.1 ug/mL) ,准确吸取 1.0 mL 中间液于 100 mL 容 量瓶中,加水稀释至刻度,摇匀。每次分析要配制新标准使用液。 313 碱处理蛋白胨:分别称取 40 g 蛋白胨和 20 g 氢氧化钠于 250 mL 水中。 混合后,放于 370.5恒温箱内,2448 h 后取出,用冰乙酸调节 pH 至 6.8, 加 14 g 无水乙酸钠(或 23.28 含有 3 分子结晶水的乙酸钠) ,稀释至 800 mL, 加少许甲苯
7、盛于溶液表面,于冰箱中保存。 313 碱处理蛋白胨:分别称取 40 g 蛋白胨和 20 g 氢氧化钠于 250 mL 水中。 混合后,放于 370.5恒温箱内,2448 h 后取出,用冰乙酸调节 pH 至 6.8, 加 14 g 无水乙酸钠(或 23.28 含有 3 分子结晶水的乙酸钠) ,稀释至 800 mL, 加少许甲苯盛于溶液表面,于冰箱中保存。 314 0.1%胱氨酸溶液:称取 1 gL胱氨酸于小烧杯中。加 20 mL 水,缓慢加 入经约 510 mL 盐酸,直至其完全溶解,加水稀释至 1 L,加少许甲苯盖于溶 314 0.1%胱氨酸溶液:称取 1 gL胱氨酸于小烧杯中。加 20 mL
8、 水,缓慢加 入经约 510 mL 盐酸,直至其完全溶解,加水稀释至 1 L,加少许甲苯盖于溶 中华人民共和国卫生部 19900319 批准 19901201 实施 中华人民共和国卫生部 19900319 批准 19901201 实施 123911990 液表面。 液表面。 315 酵母补充液:称取 100 g 酵母提取物干粉于 500 mL 水中、称取 150 g 乙酸铅于 500 mL 水中。将两溶液混合,以氢氧化铵调节 pH 至酚酞量红色(取少 许溶液检验) 。离心或用布氏漏斗过滤,滤液用冰乙酸调节 pH 至 5.5。通入硫化 氢直至不生沉淀。过滤,通空气于滤液中,以排除多余的硫化氢。加
9、少许甲苯盖 于溶液表面,于冰箱中保存。 315 酵母补充液:称取 100 g 酵母提取物干粉于 500 mL 水中、称取 150 g 乙酸铅于 500 mL 水中。将两溶液混合,以氢氧化铵调节 pH 至酚酞量红色(取少 许溶液检验) 。离心或用布氏漏斗过滤,滤液用冰乙酸调节 pH 至 5.5。通入硫化 氢直至不生沉淀。过滤,通空气于滤液中,以排除多余的硫化氢。加少许甲苯盖 于溶液表面,于冰箱中保存。 316 甲盐溶液:称取 25 g 磷酸氢二钾和 25 g 磷酸二氢钾,加水溶解,并稀 释至 500 mL。加放少许甲苯以保存之。 316 甲盐溶液:称取 25 g 磷酸氢二钾和 25 g 磷酸二氢
10、钾,加水溶解,并稀 释至 500 mL。加放少许甲苯以保存之。 3 17 乙盐溶液: 称取 10 g 硫酸镁 (MgSO3 17 乙盐溶液: 称取 10 g 硫酸镁 (MgSO4 4 7H 7H2 2) , 0.5 g 硫酸亚铁 (FeSO) , 0.5 g 硫酸亚铁 (FeSO4 47H7H2 2O) 和 0.5 g 硫酸锰(MnSO O) 和 0.5 g 硫酸锰(MnSO4 44H4H2O) ,加水溶解,并稀释至 500 mL,加少许甲苯以保 存之。 318 基本培养储备液:将下列试剂混合于 500 mL 烧杯中,加水至 450 mL, 用 1 mol/L 氢氧化钠溶液调节 pH 至 6.
11、8,用水稀释至 500 mL。 碱处理蛋白胨 100 mL 0.1%胱氨酸溶液 100 mL 酵母补充液 20 mL 甲盐溶液 10 mL 乙盐溶液 10 mL 无水葡萄糖 10 g 319 琼脂培养基:将下列试剂混合于 250 mL 三角瓶中,加水至 100 mL,于 水浴上煮至琼脂完全溶化,用 1 mol/L 盐酸趁热调节 pH 至 6.8。尽快倒入试管 中,每管 35 mL,塞上棉塞,于高压锅内在 5.910 4Pa(10 lb/in2)压力下灭 菌 15 min,取出后直立试管,冷至室温,于冰箱中保存。 无水葡萄糖 1 g 乙酸钠(NaAc3H2O) 1.7 g 蛋白胨 0.8 g 酵
12、母提取物干粉 0.2 g 甲盐溶液 0.2 mL 乙盐溶液 0.2 mL 琼脂 1.2 g 320 0.04%溴甲酚绿指示剂:称取 0.1 g 溴甲酚绿于小研钵中,加 1.4 mL 0.1 mol/L 氢氧化钠溶液研磨,加少许水,继续研钵磨。用水稀释至 250 mL。 321 0.04%溴麝香草酚蓝指示剂:称取 0.1 g 溴麝香草酚蓝于小研钵中,加 1.6 mL 和 0.1 mol/L 氢氧化钠溶液研磨。加少许水,继续研磨,直至完全溶解, 用水稀释至 250 mL。 4 仪器与设备 41 实验室常用设备。 42 电热恒温培养箱。 43 离心沉淀机。 44 液体快速混合器。 45 离压消毒锅。
13、 5 菌种的制备与保存 2O) ,加水溶解,并稀释至 500 mL,加少许甲苯以保 存之。 318 基本培养储备液:将下列试剂混合于 500 mL 烧杯中,加水至 450 mL, 用 1 mol/L 氢氧化钠溶液调节 pH 至 6.8,用水稀释至 500 mL。 碱处理蛋白胨 100 mL 0.1%胱氨酸溶液 100 mL 酵母补充液 20 mL 甲盐溶液 10 mL 乙盐溶液 10 mL 无水葡萄糖 10 g 319 琼脂培养基:将下列试剂混合于 250 mL 三角瓶中,加水至 100 mL,于 水浴上煮至琼脂完全溶化,用 1 mol/L 盐酸趁热调节 pH 至 6.8。尽快倒入试管 中,每
14、管 35 mL,塞上棉塞,于高压锅内在 5.910 4Pa(10 lb/in2)压力下灭 菌 15 min,取出后直立试管,冷至室温,于冰箱中保存。 无水葡萄糖 1 g 乙酸钠(NaAc3H2O) 1.7 g 蛋白胨 0.8 g 酵母提取物干粉 0.2 g 甲盐溶液 0.2 mL 乙盐溶液 0.2 mL 琼脂 1.2 g 320 0.04%溴甲酚绿指示剂:称取 0.1 g 溴甲酚绿于小研钵中,加 1.4 mL 0.1 mol/L 氢氧化钠溶液研磨,加少许水,继续研钵磨。用水稀释至 250 mL。 321 0.04%溴麝香草酚蓝指示剂:称取 0.1 g 溴麝香草酚蓝于小研钵中,加 1.6 mL
15、和 0.1 mol/L 氢氧化钠溶液研磨。加少许水,继续研磨,直至完全溶解, 用水稀释至 250 mL。 4 仪器与设备 41 实验室常用设备。 42 电热恒温培养箱。 43 离心沉淀机。 44 液体快速混合器。 45 离压消毒锅。 5 菌种的制备与保存 中华人民共和国卫生部 19900319 批准 19901201 实施 123911990 51 储备菌种的制备:以 LC纯菌种接入 2 个或多个琼脂培养基管中。在 370.5恒温培养箱中保温 1624 h。贮于冰箱内,至多不超过 2 周,最好每 周移种一次。保存数周以上的储备菌种,不能立即用于制备接种液,一定要在使 用前每天移种一次,连续 2
16、3 d 方可使用,否则生长不好。 51 储备菌种的制备:以 LC纯菌种接入 2 个或多个琼脂培养基管中。在 370.5恒温培养箱中保温 1624 h。贮于冰箱内,至多不超过 2 周,最好每 周移种一次。保存数周以上的储备菌种,不能立即用于制备接种液,一定要在使 用前每天移种一次,连续 23 d 方可使用,否则生长不好。 52 种子培养液的制备:取 5 mL 核黄素标准使用液和 5 mL 基本培养储备液于 15 mL 离心管混匀,塞上棉塞,于高压锅内在 6.910 52 种子培养液的制备:取 5 mL 核黄素标准使用液和 5 mL 基本培养储备液于 15 mL 离心管混匀,塞上棉塞,于高压锅内在
17、 6.910 4 4Pa(10 lb/in Pa(10 lb/in 2)压力下灭 菌 15 min。每次可制备 24 管。 6 操作步骤 因核黄素易被日光和紫外线破坏,故一切操作要在暗室内进行。 61 接种液的制备:使用前一天,将菌种由储备菌种管中移入已消毒的种子培 养液中,同时制作二管。在 370.5保温 1624 h。取出后离心 10 min(3000 rpm) , 以无菌操作方法倾去上部液体, 用已消毒的生理盐水淋洗二次, 再加 10 mL 消毒生理盐水,在液体快速混合器上振摇试管,使菌种成混悬体。将此液倾入已 消毒的注射器内,立即使用。 62 样品的制备 621 将样品用磨粉机、研钵磨
18、成粉末或用打碎机打成匀浆。 622 称取约含 510 ug 的核黄素样品(谷类约 10 g,干豆类约 4 g,肉类 约 5 g) ,加入 50 mL0.1 mol/L 盐酸溶液,混匀。置于高压锅内,在 10.310 4Pa (15 lb/in 2)压力下水解 30 min。 623 冷至室温,用 1 mol/L 氢氧化钠溶液调节至 4.6(取少许水解液,用溴 甲酚绿检验,溶液呈草绿色即可)。 624 加入淀粉酶或木瓜蛋白酶,每克样品加入 20 mg 酶。在 40恒温箱中 过夜,大约 16 h。 625 冷至室温,加水稀释到 100 mL:过滤。对于脂肪量高的食物,可用乙 醚提取,以除去脂肪。
19、63 标准管的制备 两组试管中管各加核黄素标准使用液 0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL,每管加水至 5 mL,再每管加 5 mL 基本培养储备液混匀。 64 样品 的制备 641 吸取样品溶液 510 mL,置于 25 mL 具塞试管中,用 0.1 mol/L 氢氧 化钠调节 pH 至 6.8(取少许溶液,用溴麝香草酚蓝检验) ,加水稀释至刻度。 642 取两组试管,各加(6.4.1)样品稀释液 1、2、3、4 mL,每管加水至 5 mL,每管再加 5 mL 基本培养储备液混匀。 6 5 灭菌: 将以上样品管和标准管全部塞上棉塞, 置于高压锅内, 在 6.910 4
20、Pa (10 lb/in 2)压力下灭菌 15 min。 66 接种和培养 661 待试管冷至室温,在无菌操作条件下接种,每管加一滴接种液(6.1) , 接种时注射器针头不要碰试客壁,要使接种液直接滴在培养液内。 662 置于 370.5恒温箱中培养约 72 h,培养时每管必须在同一温度。 培养时间可延长 18 h 或减少 12 h。必要时可在冰箱内保存一夜再滴定。若用混 浊度测定法:以培养 1824 h 为宜。 67 滴定 将试管中培养液倒入 50 mL 三角瓶中,加 0.001%溴麝香草酚蓝溶液 5 mL, 2)压力下灭 菌 15 min。每次可制备 24 管。 6 操作步骤 因核黄素易被
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