常见的生化与分子生物学技术PPT课件.ppt
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1、趋 倾 肯 氯 残 充 突 坏 写 鄂 菠 廉 散 忱 鸣 斟 桅 浅 惫 耀 盎 膳 坍 劈 垣 吟 逞 冈 檬 撑 垃 斋 常 见 的 生 化 与 分 子 生 物 学 技 术 P P T 课 件 常 见 的 生 化 与 分 子 生 物 学 技 术 P P T 课 件 常见的生化与分子生物学技术常见的生化与分子生物学技术 饵 皱 阂 幻 酸 崔 史 匈 只 蔼 淆 袱 骂 涕 鞠 鼠 仕 侠 舵 哲 碟 尸 超 牟 壶 拓 荒 撇 硒 菏 幸 俺 常 见 的 生 化 与 分 子 生 物 学 技 术 P P T 课 件 常 见 的 生 化 与 分 子 生 物 学 技 术 P P T 课 件 生
2、物大分子的提取和纯化 电泳技术 PCR技术核酸序列的测定蛋白质相互作用 Agrose PAGE 双向电泳 杂交技术 酶联免疫技术 层析技术、超滤技术、膜技术 检测和纯化 敷 对 烟 侯 手 峙 惹 辣 堑 轿 模 锑 仲 舞 契 砷 赋 煤 恳 淡 泻 磋 眠 仪 唬 纬 擒 弹 锻 嵌 诵 洪 常 见 的 生 化 与 分 子 生 物 学 技 术 P P T 课 件 常 见 的 生 化 与 分 子 生 物 学 技 术 P P T 课 件 分离 生命现象 生化组分 分析 1、结构与性质 2、功能 3、代谢及其细胞调控 改造利 用 生物化学研究技术方法 v经典的研究步骤: 分离生化组分(细胞器和生
3、物 分子); 分析生化组分的结构; 分析生化组分的功能和代谢( 合成与分解)及其相互作用。 *3 粘 度 援 惜 炒 硕 喳 芳 吐 乱 瞪 纷 崩 戴 怎 两 袄 屑 盟 铆 光 疵 主 钩 唤 睦 辨 尚 字 孔 瘪 当 常 见 的 生 化 与 分 子 生 物 学 技 术 P P T 课 件 常 见 的 生 化 与 分 子 生 物 学 技 术 P P T 课 件 生物化学研究技术方法 l生物化学研究技术: 分离技术:沉淀、吸附、膜分离(过滤、透析等)、离心 、层析、电泳等; 分析检测技术:电泳、层析、光谱、质谱、电化学技术、 分子标记等。 分子生物学研究技术:基因重组、分子杂交、PCR与反
4、 转录、核酸测序、免疫技术、生物芯片等等。 *4 文 缸 掉 谢 依 簧 碱 痊 戴 哨 揩 汉 司 霍 谗 磁 迄 蓉 剔 财 牡 骡 碌 繁 追 陋 挂 限 殆 语 泅 根 常 见 的 生 化 与 分 子 生 物 学 技 术 P P T 课 件 常 见 的 生 化 与 分 子 生 物 学 技 术 P P T 课 件 生物大分子分离纯化的一般步骤和原则 层析法 电泳法 超离心法 透析和超滤 盐析(硫酸铵盐析) 等点电沉淀 有机溶剂沉淀 离心 前处理 粗分级 细分级 材料选择与处理 细胞破碎(机械破 碎、溶账和自溶、 酶解、化学处理) 生物组织 提取液 粗产品结晶 分子大小 溶解度 电荷性质
5、吸附性质 生物亲和力 依据原理 刽 遗 福 浪 曳 幢 烧 型 惮 皂 痢 叮 耳 描 蔚 胸 耙 弥 届 蛀 癣 哈 蕾 霸 等 掏 捌 牡 甜 腹 胚 宿 常 见 的 生 化 与 分 子 生 物 学 技 术 P P T 课 件 常 见 的 生 化 与 分 子 生 物 学 技 术 P P T 课 件 要了解的生物大分子的物理、化学性质主要有: p 在水和各种有机溶剂中的溶解性。 p 在不同温度、pH值和各种缓冲液中生物大分子 的稳定性。 p固态时对温度、含水量和冻干时的稳定性。 p各种物理性质:如分子的大小、穿膜的能力、带 电的情况、在电场中的行为、离心沉降的表现、 在各种凝胶、树脂等填料中
6、的分配系数。 p其他化学性质:如对各种蛋白酶、水解酶的稳定 性和对各种化学试剂的稳定性。 p对其他生物分子的特殊亲和力。 烈 丢 撤 纯 耳 浊 媳 戎 狰 衫 睦 勤 备 严 氢 腊 甲 启 厉 迈 寄 鸡 困 猎 罐 节 甭 氮 罩 筹 扣 吞 常 见 的 生 化 与 分 子 生 物 学 技 术 P P T 课 件 常 见 的 生 化 与 分 子 生 物 学 技 术 P P T 课 件 分离纯化的一般程序 1、材料的选择和预处理 2、破碎细胞及提取(有时还需要进行细胞器 的分离) 3、分离纯化:包括粗分级分离和细分级分离 其中前两个阶段为生物大分子分离纯化的前 处理。 彭 闯 儒 耽 缅
7、杯 币 氟 薪 瑚 眷 蝶 撂 振 眼 泥 娠 馁 址 招 木 到 舰 踩 楷 癌 绢 冲 睡 委 匣 恶 常 见 的 生 化 与 分 子 生 物 学 技 术 P P T 课 件 常 见 的 生 化 与 分 子 生 物 学 技 术 P P T 课 件 生物大分子的浓缩 p沉淀法:在提取液中加入适量的中性盐或有机溶剂 ,使有效的成分变为沉淀,经过离心或过滤收集的 沉淀物,加少量缓冲液溶解后,在经离心出去不溶 物,获得的上清液通过透析或凝胶过滤脱盐。 p盐析法:有机溶剂沉淀法;等电点沉淀法;非离子 多聚体沉淀法;生成盐复合物沉淀法;热变性沉淀 法;酸碱变性沉淀法等 。 p 吸附法:将干葡聚糖凝胶加
8、入提取液中,由于凝胶 吸水,提取液的体积可缩小三倍左右。 嘎 贸 柏 子 捐 昆 孙 扇 垦 娩 热 柬 碗 枕 码 潭 岛 滁 捏 离 邓 唾 昆 别 牧 魏 纤 红 编 碌 什 持 常 见 的 生 化 与 分 子 生 物 学 技 术 P P T 课 件 常 见 的 生 化 与 分 子 生 物 学 技 术 P P T 课 件 p 超过滤法:把提取液装入过滤装置, 在空气或氮气的压力下,使小分子物 质通过半透膜,大分子物质留在膜内 。 p 透析浓缩法 p 减压蒸馏浓缩法:将提取液装入减压 蒸馏装置中,在减压真空状态下进行 蒸馏。 p 冰冻干燥法 北 郧 无 匝 粹 钱 虽 棱 通 滑 笔 玲
9、昂 诊 莱 爹 景 贫 递 瞅 粮 丢 要 淳 鸿 伦 狱 刨 偷 课 抬 初 常 见 的 生 化 与 分 子 生 物 学 技 术 P P T 课 件 常 见 的 生 化 与 分 子 生 物 学 技 术 P P T 课 件 纯度鉴定 l生物大分子经过分离提纯,最后还要鉴定制品的纯 度。 l蛋白质和酶制品纯度鉴定通常采用的方法有:SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳法、等电聚焦电泳法、超速离 心沉降分析法等。 l纯的蛋白质在一定条件下进行电泳,将以单一的速 度移动,它的电泳图谱只出现一条带。同样纯的蛋 白质在离心场中,应以单一的沉降速度移动。 l选用任何单独一种鉴定方法都不能最后确定蛋白质 的纯度,必须
10、同时采用2-3种不同的方法才能确定 。 戚 弦 侗 篇 灼 岁 豪 仰 盾 七 驮 迸 鳃 明 嘿 的 逗 诺 钾 旦 该 峭 昏 角 客 僵 萌 叮 瞧 源 塑 雅 常 见 的 生 化 与 分 子 生 物 学 技 术 P P T 课 件 常 见 的 生 化 与 分 子 生 物 学 技 术 P P T 课 件 蛋白质、核酸的定性定量检测 1、蛋白质的测定 凯氏定氮法(含N量 6. 25) 双缩脲法、Folin-酚法 紫外光度法(max=280nm) 离心法、电泳法、层析法 2、酶活力的测定 终点法、动力学法 3、氨基酸的测定 茚三酮法 Sangerf法、Edmam法、DNS法 4、核酸的测定
11、紫外光度法(max=260nm) 分子杂交法 离心法、电泳法 杭 取 汹 侵 猛 旅 肿 绸 颧 烹 户 渝 承 撒 所 恐 某 服 悼 汝 诣 龋 朱 并 讥 芹 触 创 吏 约 纵 釉 常 见 的 生 化 与 分 子 生 物 学 技 术 P P T 课 件 常 见 的 生 化 与 分 子 生 物 学 技 术 P P T 课 件 l核酸的纯度鉴定一般采用琼脂糖凝胶和聚丙烯酰 胺凝胶电泳,沉降分析和紫外吸收法(A260/A280 )等方法。 v同蛋白质一样,核酸纯度鉴定也必须采用2-3种方 法才能确定。 臭 谚 咯 碳 骆 匝 埋 渭 临 溶 鹃 峦 除 歉 谰 喜 姚 乍 纸 傻 交 睹 地
12、 驼 蹿 雅 彻 肪 撩 似 耐 耶 常 见 的 生 化 与 分 子 生 物 学 技 术 P P T 课 件 常 见 的 生 化 与 分 子 生 物 学 技 术 P P T 课 件 电泳基本原理 l电泳是不同的物质颗粒在一定的电场强度下,由于 所带电荷及颗粒大小形状等不同,因此向相反电极 泳动速度不同进而达到分离目的一种方法。 l在一定pH条件下,每一种分子都具有特定的电荷( 种类和数量)、大小和形状,在一定时间内它们在 相同电场中泳动速度不同,各自集中到特定的位置 上而形成紧密的泳动带。这就是带电粒子可以用电 泳技术进行分离、分析和鉴定的基本原理。 斟 善 遭 疆 峙 户 泉 较 耿 奠 虑
13、 篡 逸 少 确 恬 溃 榔 至 嗜 汇 棱 肢 汤 安 断 涧 艘 龋 藕 插 腻 常 见 的 生 化 与 分 子 生 物 学 技 术 P P T 课 件 常 见 的 生 化 与 分 子 生 物 学 技 术 P P T 课 件 电泳 带电粒子或分子的大小、形状、所带的净电荷多 少等都会影响它们的电泳速度。待分离样品中各 种分子带电性质以及分子本身大小、形状等存在 的差异,使得带电分子的“泳动”速度不同,因 而可以利用电泳技术对生物分子进行分离、鉴定 或纯化。 电泳技术有多种方式,但一般根据有无支持物将 其分为无支持物的自由电泳和有支持物的区带电 泳两大类。区带电泳包括以滤纸作为支持物的纸 电
14、泳、以醋酸纤维素等薄膜为支持物的薄层电泳 ,以及与凝胶(例如琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶) 为支持物的凝胶电泳。 等电聚焦凝胶电泳、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、 二维电泳、脉冲场凝胶电泳。 氏 盛 顺 剪 枣 尝 锨 突 注 诵 牛 什 衷 迢 瘪 罩 泌 绢 詹 虐 栽 鳞 凉 坍 耐 虫 缓 篡 淹 箔 们 咬 常 见 的 生 化 与 分 子 生 物 学 技 术 P P T 课 件 常 见 的 生 化 与 分 子 生 物 学 技 术 P P T 课 件 l影响泳动度的因素: 1. 电场强度: l电场强度是指每厘米的电位降,也称电位梯度(电势梯度)。 电场强度越高,则带电颗粒泳动越快。 2. 溶液
15、pH l为使电泳时pH值恒定,必须采用缓冲液作为电极液,溶液 的pH值决定带电颗粒的解离程度,亦即决定其所带电荷的 多少。 3.离子强度(I) 溶液的I 越高,质点的泳动速度越慢,但区带分离度却较清 晰。 耸 首 戍 鹏 俱 蔫 扒 疏 站 剖 车 牧 紧 哮 信 菊 丰 把 颅 狮 珊 递 坯 糯 鹃 芥 定 侍 战 龟 囤 滁 常 见 的 生 化 与 分 子 生 物 学 技 术 P P T 课 件 常 见 的 生 化 与 分 子 生 物 学 技 术 P P T 课 件 4. 电渗 l电泳缓冲液相对于固体支持物的移动称电渗。如纸电 泳时,滤纸吸附OH-离子带负电荷,与纸接触的缓冲液 带正电荷
16、向负极移动,会对颗粒的移动造成不良影响 ,故电泳时,电渗小些为好 5. 温度 电泳时会产生焦耳热,使介质粘度下降,分子运动加快,迁移率 增加,同时温度过高会使样品中的生物大分子变性失活,因此电 泳时,要控制电压或电流,也可安装冷却散热装置。 6.支持物 |现代电泳多在固体支持物上进行,使样品中的不同组分形成不同 的区带,称区带电泳。电泳结束后,支持物可以方便地进行染色 等后续处理。 晋 蔷 凯 检 氏 享 瞅 猩 局 匹 槽 廓 闭 钱 芋 裕 矾 回 酱 卸 乱 尺 火 睛 撵 镭 玻 凿 仆 伙 虐 躁 常 见 的 生 化 与 分 子 生 物 学 技 术 P P T 课 件 常 见 的 生
17、 化 与 分 子 生 物 学 技 术 P P T 课 件 电泳技术分类 |按电泳的原理来分,可分为四种: 区带电泳:电泳过程中,不同的离子成分在均一的缓冲液体系 中分离成独立的区带,这是当前应用最广泛的电泳技术。 移界电泳:是Tiselius最早建立的电泳,它是在U 形管中进行的 ,由于分离效果较差,已为其他电泳技术所取代。 等速电泳:需专用电泳仪,当电泳达到平衡后,各组分的区带 相随并形成清晰的界面,并以等速移动。 等电聚焦:具有不同等电点的两性电解质载体在电场中自动形 成pH梯度,使被分离物移动至各自等电点pH处聚集成很窄的区 带,且分辨率较高。(表面看与区带电泳相似,但原理不同) 情 腮
18、 拼 朝 慰 且 沛 胁 芬 嫂 驴 庄 棺 瘪 札 私 染 逞 干 眉 坦 彦 疗 讽 诗 散 念 几 咸 听 斗 龟 常 见 的 生 化 与 分 子 生 物 学 技 术 P P T 课 件 常 见 的 生 化 与 分 子 生 物 学 技 术 P P T 课 件 DNA的琼脂糖凝胶电泳: l琼脂糖凝胶电泳对核酸的分离作用主要依据它们的相对分子 质量及分子构型,同时与凝胶的浓度也有密切关系。 l核酸分子大小与琼脂糖浓度的关系 lDNA分子的大小: l在凝胶中,DNA片段迁移距离(迁移率)与碱基对的对数成反 比,因此通过已知大小的标准物移动的距离与未知片段的 移动距离进行比较,便可测出未知片段的
19、大小。 l但是当DNA分子大小超过20kb时,普通琼脂糖凝胶就很难 将它们分开。此时电泳的迁移率不再依赖于分子大小,因 此,应用琼脂糖凝胶电泳分离DNA时,分子大小不宜超过 此值。 l琼脂糖的浓度:不同大小的DNA需要用不同浓度的琼脂糖 凝胶进行电泳分离。 杉 远 式 骤 绷 砍 酶 皖 赖 胳 竭 响 纂 惕 绦 赐 宝 钞 您 堵 扼 装 连 卧 汪 曲 鄙 笼 莫 诡 浅 庇 常 见 的 生 化 与 分 子 生 物 学 技 术 P P T 课 件 常 见 的 生 化 与 分 子 生 物 学 技 术 P P T 课 件 2. 琼脂糖凝胶电泳 l核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系 F不同构型
20、DNA的移动速度次序为: 共价闭环DNA(cccDNA)直线DNA开环的双 链环状DNA F当琼脂糖浓度太高时,环状DNA(一般为球形)不 能进入胶中,相对迁移率为0(Rf = 0),而同等大 小的直线双链DNA(刚性棒状)则可以长轴方向前进 (Rf0), 由此可见,这3种构型的相对迁移率主要取决于凝 胶浓度,但同时,也受到电流强度、缓冲液离子强 度等的影响。 滚 渡 蹲 妓 拆 侍 粟 掘 脖 鳖 园 临 泉 善 塘 嘻 阉 沼 挚 刊 骗 硬 吸 减 兔 吻 兜 圈 抡 效 征 弯 常 见 的 生 化 与 分 子 生 物 学 技 术 P P T 课 件 常 见 的 生 化 与 分 子 生
21、物 学 技 术 P P T 课 件 聚丙烯酰胺凝胶电泳 l聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(简 称Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺 (简称Bis)在加速剂和催化剂的作用下 聚合并联成三维网状结构的凝胶,以此 凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝 胶电泳(简称PAGE)。 斥 榷 薯 枣 畜 宏 焊 演 湘 柿 敲 雄 阳 财 木 篙 勘 川 鲸 锅 垄 然 诛 隙 捅 捍 号 典 印 块 脱 瓜 常 见 的 生 化 与 分 子 生 物 学 技 术 P P T 课 件 常 见 的 生 化 与 分 子 生 物 学 技 术 P P T 课 件 l聚丙烯酰胺凝胶有下列优点: 在一定浓度时,凝胶透明,
22、有弹性,机械性能好。 化学性能稳定,与被分离物不发生化学反应。 对pH和温度变化较稳定。 几乎无电渗作用,只要Acr纯度高,操作条件一致,则样 品分离重复性好。 样品不易扩散,且用量少,其灵敏度可达10-6g。 凝胶孔径可通过选择单体及交联剂的浓度调节。 分辨率高,尤其在不连续凝胶电泳中,集浓缩、分子筛和 电荷效应为一体,因而较醋酸 纤维薄膜电泳、琼脂糖电 泳等有更高的分辨率。 授 咯 电 讳 娩 又 窝 省 答 世 薄 俊 迸 仿 颂 幅 汐 嚷 菱 除 诱 陶 谜 帜 脚 术 音 罗 古 辩 气 保 常 见 的 生 化 与 分 子 生 物 学 技 术 P P T 课 件 常 见 的 生 化
23、 与 分 子 生 物 学 技 术 P P T 课 件 l聚丙烯酰胺凝胶于琼脂糖凝胶的不同之处: p 分离范围不同 琼脂糖凝胶电泳分离分子量比较大的物质,尤其是核酸;聚丙烯酰 胺凝胶分离分子量较小的物质,如蛋白质,氨基酸等。 p 凝胶配置程序不同 l琼脂糖凝胶在缓冲液中加热融化,在凝固前到入槽中即可;聚 丙烯酰胺凝胶在配置时还要加多种成分,并且对聚合温度也有 一定的要求,否则会影响凝胶孔径的大小。 p 凝胶的厚度不同 l琼脂糖凝胶最薄只能达到;聚丙烯酰胺凝胶可以制成. ,分辨率高。 p 成本不同。 琼脂糖价格便宜;聚丙烯酰胺凝胶价格较高 p 安全性不同。 琼脂糖没有毒性;聚丙烯酰胺凝胶有毒性 批
24、 限 咏 魄 梧 镣 活 南 另 敖 匣 初 甥 触 闪 聋 培 霸 谓 盲 泄 当 笼 厩 诱 肩 藻 垢 音 傍 费 稳 常 见 的 生 化 与 分 子 生 物 学 技 术 P P T 课 件 常 见 的 生 化 与 分 子 生 物 学 技 术 P P T 课 件 l凝胶聚合的原理及有关特性 催化系统常用有两种: l过硫酸氨TEMED化学催化聚合系统 此系统中,四甲基乙二胺(TEMED)称为加速剂,它能 以自由基的形式存在。微量的TEMED的加入,可使过硫 酸氨(APS,引发剂)形成自由基。这些自由基的产生 可以引发丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的交联反应,形成具 有一定孔径的聚丙烯酰胺凝胶。
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