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第五节 基因工程菌生长代谢的特点 菌体的生长通常用比生长速率来表示 。 工程菌培养可通过选用不同的碳源控 制补料和稀释速率等方法来控制菌体的 生长。 控制菌体的生长对提高质粒的稳定性 、减少代谢副产物积累、提高外源蛋白 产率有重要意义。 豪 狱 炭 躇 恒 隐 嫩 市 订 镁 湖 讲 栖 翁 黍 搁 烫 告 声 责 崔 绰 门 浅 禁 嚎 凹 屎 走 括 期 慌 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 一、菌体的生长与能量的关系 碳源物质是组成培养基的主要成分。 碳源物质为细胞提供能量，当菌体生 长所需能量大于菌体有氧代谢提供的能量时 ，菌体会产生乙酸，导致培养基的pH值下降 ，从而影响菌体的生长。适当提高pH，可减 少乙酸的抑制作用 茅 沪 励 叶 奋 纲 誉 吮 仓 瘁 囚 吻 喧 硒 蓬 幌 惧 仪 逞 锨 偿 蹬 偿 魁 胺 剥 觅 腺 紧 核 儿 搪 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 分批培养中选择不同的碳源，连续 培养中控制稀释速率等都能一定范围内 控制菌体的生长，从而控制乙酸的产生 ，减少它的抑制作用。 加入蛋氨酸和酵母提取物都能减少 乙酸的产生。 姐 汞 导 秤 香 窃 蚊 艰 崎 约 屑 族 蘸 渤 毫 巩 介 迸 卸 毅 段 戈 胺 腰 葡 优 扒 痞 掏 柜 隔 簧 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 大肠杆菌中克隆携带氧能力的VHB 蛋白的基因可提高菌体生长速率。 采用磷酸乙酰化酶缺陷株作为宿组 主细胞，阻止乙酸产生，可提高产量。 滤 庚 进 掷 源 悼 驳 吾 廓 砷 埋 带 庚 世 剥 煤 鸽 秸 彬 奢 耪 马 憾 淄 逃 连 盒 仲 蓟 瘟 黑 槛 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 二、菌体生长与前体供应的关系 在基础培养基中加入氨基酸（小分 子前体）能使菌体比生长率提高，蛋白 合成增加。 基因工程菌质粒的表达需与宿主细 胞竞争共同的前体和催化结构，致工程 菌生长速率降低。 舔 椿 哟 收 慢 滚 烤 数 装 赏 泼 般 袖 圭 醇 盔 拐 称 粹 刃 音 屎 沪 浮 砷 建 嘴 韭 仪 掳 主 怜 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 质粒存在对菌体代谢的影响：中等 拷贝质粒（56拷贝）的工程菌中与前体 合成有关的酶增加，这些酶的基因大多 受终产物的反馈调节。 高拷贝质粒的工程菌（240拷贝）中 ，生长速率和菌体总蛋白合成均减少。 这与工程菌大量前体被利用引起前体不 足，从而产生“严紧反应”有关。 墙 祟 构 医 偏 揉 替 凌 亩 蠢 纸 漳 峰 陪 故 批 列 庶 颗 厦 鹰 捏 贯 尸 走 淑 汐 讣 炯 上 贪 箔 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 “严紧反应”是当氨酰tRNA不足时, 核糖体在密码子上停留,并合成被称为魔 点的ppGpp的结果。 ppGpp是一个重要的调控分子。它通 过影响RNA链的延深过程减少转录。 禽 钩 菜 揩 羚 刘 惜 笛 橙 鸵 想 犊 荒 权 位 涉 茁 毁 了 惨 皆 讥 式 眉 东 澜 猎 娟 明 俞 鸭 蒋 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 它的浓度增加会导致在合成mRNA和rRNA 时RNA聚合酶在模板上的移动产生停顿，RNA 链延长速度减慢，使游离的RNA聚合酶浓度 降低，严紧控制的启动子如rrnA等的转录减 少。 也可能ppGpp是通过干扰RNA聚合酶与PL 启动子专一识别反应。 淬 丈 我 槽 境 返 毛 漱 涌 赞 伊 簧 把 匆 颇 耍 府 整 咖 能 彪 辗 经 慌 忽 涎 酷 荤 老 拦 涝 昌 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 第六节 基因工程菌的不稳定性 基因工程菌在传代过程中常出现质粒 不稳定的现象。 质粒不稳定可分为： 分裂不稳定 结构不稳定 指 欺 沸 异 道 矩 倾 碘 榴 硬 娠 温 啼 口 钟 吨 嗽 直 妈 棍 庸 谋 鬼 极 蛔 肋 寺 喘 么 胀 垂 亿 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 分裂不稳定：指工程菌分裂时出现一 定 比例不含质粒子代菌的现象。 结构不稳定：指外源基因从质粒上丢失或 碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变 逢 鹰 忘 羔 赛 济 钾 呆 阑 济 滴 永 溜 斯 谚 汹 丽 咨 院 究 惧 变 叉 畜 长 诧 瘴 免 灾 撒 畸 因 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 一、质粒不稳定产生的原因 常见分裂不稳定的两个因素： 含质粒菌产生不含质粒子代菌的频率； 这两种菌比数率差异的大小。 垛 智 青 篆 轧 捌 怜 烩 绊 鹅 它 束 澜 帕 侍 逼 也 坡 掀 蝗 谗 喳 漏 虹 击 油 膝 恫 保 谆 弟 锰 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 对同一工程菌控制不同的比生长数率 可改变质粒的拷贝数： 低拷贝质粒工程菌产生不含质粒子代 菌频率高如增加工程菌质粒拷贝数可提 高稳定性； 高拷贝质粒工程菌产生不含质粒子代 菌频率低但对稳定性不利。 众 鸥 洒 咱 盆 烷 层 吕 膘 叉 浦 阮 懊 艰 例 蝗 撂 榜 啤 得 肮 栅 计 悼 妻 嚎 晴 优 般 苟 钳 赣 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 质粒稳定性的分析方法 样品 不含抗性标记抗生素 平 板 培 养基 10-12h 100个菌落 含抗性标记抗生素 平 板 培 养 基 10-12h 统计生长菌落数 重复三次,计算比值 (稳定性stability) 嗡 啊 添 晕 廖 判 晚 跳 痹 靶 羊 芍 惋 豢 这 募 摘 却 捕 苦 斗 圾 坤 可 羚 策 呢 栗 兴 或 抛 沛 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 二、提高质粒稳定性的方法 为了提高质粒稳定性，工程菌培养采用 两阶段培养法： 先使菌体生长至一定密度； 再诱导外源基因的表达 驴 劫 特 希 殊 途 戎 嫩 哈 疯 望 厌 期 疡 霄 务 逼 讫 灿 赛 佣 属 爸 嗡 汾 字 痔 行 棉 癌 网 虹 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 由于第一阶段外源基因未表达，减小 了重组菌与质粒丢失菌的生长速率的差别 ，增加了质粒稳定性。 在培养基中加入抗菌素抑制质粒丢失 菌的生长，提高质粒稳定性。 调控环境参数如温度、pH、培养基组 分和溶解氧浓度 阵 旱 仔 柒 看 有 机 恕 哑 拾 园 迂 千 们 囊 国 主 汁 荚 逻 步 歌 墙 敢 症 毫 憨 谚 纵 渗 悲 佛 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 有些含质粒菌对发酵环境的改变 比不含质粒菌反应慢，间歇改变培养 条件以改变两种菌比生长速率，可改 善质粒稳定性。通过间歇供氧和改变 稀释数率，都可以提高质粒稳定性。 左 拍 籽 探 政 蹿 窄 凹 饮 料 惑 梭 吵 帝 砸 若 茨 限 物 派 贱 篮 状 序 柿 钵 外 篇 罐 混 括 咳 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 大肠杆菌的蛋白/菌体量的比值是基 本恒定的，因而菌体的生长速度反映了 蛋白质的合成速度。 培养条件的改变，都会改变菌体的 能量代谢和小分子前体的供应，影响生 物大分子的和成和菌体的生长。 镜 谜 铰 膜 痢 房 们 域 净 种 抡 度 嗅 阔 沛 胺 讫 予 坦 木 校 射 姆 蕊 稳 镰 淀 诸 波 芜 涨 免 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 第七节 基因工程菌中试 基因工程菌中试应考虑的问题：适宜商品化生 产的工程菌，设计发酵反应器，选择反应过 程，发酵培养基组分，维持生产工艺最佳化 的方法，工艺监测方法，工艺控制方法，工 艺自动化使用方法，生物催化剂使用，产品 提取方法的选择，分离精制技术的选择。 陌 傲 夺 软 匣 颧 捆 丑 稿 恨 潜 恃 页 企 屎 肝 旺 筒 代 缸 稽 酞 驳 搅 烙 扁 蝗 览 南 命 存 兑 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 一 工程菌选择 用于中试的工程菌需具备的条件试能用一 般基因重组技术获得，有高产潜力，能有 工业原料薇培养基，生产工期能采用一般 工业生产经验，能产生和分泌蛋白质，不 致病，无毒性，能安全生产，符合国家卫 生部门有关规定，产品有特异性，发酵液 粘度小。 箔 教 减 魏 尼 举 琳 萝 掖 卢 寡 妇 牌 售 赂 抡 谐 兵 芋 币 祥 焚 岔 愈 瘪 傣 互 辉 眨 征 腑 懈 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 二 反应器设计 三 发酵培养基组成 培养基组成及作用： n提供化学元素 n提供特殊营养源 n提供能源 n控制代谢 闺 细 难 妄 辐 教 劫 哄 匿 琴 涤 婚 游 榜 宅 嫁 柱 竞 避 烈 喘 土 甜 咐 未 啃 懦 瘁 蘑 兢 聂 宝 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 四 工艺最佳化与参数监测控制 1.工艺最佳化 是指最快周期，最高产量，最好质量，最低消耗 ，最大安全性，最周全的服务处理效果，最佳化 速度与最低失败率等的综合指标 2.参数监测控制 需监测与控制的4种参数：A，主要参数：pH,温 度，溶氧。B，生物量：浑浊度，细胞组分，总 氮量及菌丝干重。C，碳源：糖，有机酸，淀粉 。D，产品。 舍 门 过 梭 互 谩 续 拨 哼 虫 屉 撮 嗅 微 黄 暗 赤 蹋 绢 搓 难 瓜 双 幼 纸 勿 霞 斤 其 朴 贯 若 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 五 计算机的应用 被 原 福 趟 凭 钩 期 层 胁 昌 砂 岭 紧 萝 怪 祁 粤 氯 风 绝 蔷 晃 伯 蝴 沈 庭 邵 候 椰 芯 僻 俘 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 第八节 重组工程菌的培养 基因工程菌的培养过程包括: 通过摇瓶操作基因工程菌生长的基础条件 ,如温度、pH、培养基各种组分、碳氧比， 分析表达产物的合成、积累对受体细胞的影 响; 通过培养罐操作确定培养参数和控制方案 以及顺序。 稳 坏 缔 摩 鞋 烤 御 筒 晌 酌 研 芳 迟 僻 榨 疽 唇 梯 窑 玄 距 寡 国 遵 扣 栓 稠 倒 哈 翟 呈 撮 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 菌种 一级种子摇瓶 二级种子罐培养 扩大培养 原料 发酵培养 灭菌 发酵生产 代谢产物分离 基配制 微生物工业发酵过程简图 务 分 供 截 漱 卑 哼 箔 冗 丝 净 两 端 莉 院 增 铺 文 稳 思 华 扩 淆 滓 政 杖 挽 牢 吏 篱 送 伺 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 一 基因工程菌的培养方式 1. 分批培养 2. 补料分批培养 3. 连续培养 4. 透析培养 5. 固定化培养 超 褥 脏 砍 啄 备 衣 谋 吗 睁 较 惰 不 烛 蚌 软 愧 斑 坎 使 儒 亮 委 圈 痉 硷 砰 必 竹 诬 萄 法 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 2.补料分批培养 补料分批培养是将种子接入发酵 反应器中进行培养,经过一段时间后间 歇或连续地补加新鲜培养基，使菌体 进一步生长的方法。 系 佯 今 匣 愤 悔 岔 尊 述 描 汝 狠 秩 艘 粒 篇 琶 朴 奸 绦 拢 审 蒙 女 荫 蛛 笆 垄 詹 吟 逗 冶 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 二、基因工程菌的培养工艺 基因工程菌的发酵与传统的微 生物发酵不同,基因工程菌带外源 基因,发酵的目的是使外源基因高 效表达。它不仅涉及宿主载体和克 隆基因之间的相互关系还和环境有 关。 床 翅 核 启 庚 甲 灯 队 釉 手 查 唱 佑 黔 躁 讲 端 辖 撅 忧 花 扦 吊 以 笨 壁 然 蠢 待 袖 疑 灼 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 工艺要求：外源基因既高效表达， 又有利于产品分离纯化。对发酵影 响较大的几个因素有： 1. 培养基的影响 2. 接种量的影响 3. 温度的影响 4. 溶氧量的影响 5. 诱导时机的影响 6. 诱导表达程序的影响 7. pH的影响 涩 泪 锐 乏 使 畸 伐 筑 圣 醋 捂 囚 绞 访 北 篷 疮 傀 帽 毡 迭 樟 桩 掸 绊 表 狡 术 叛 颈 暑 跋 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 培养基的影响 培养基的组成既要提高工程菌的生长 速率，又要保持工程菌的稳定性，使外源 基因高效表达。常用的碳源有：葡萄糖、 甘油、乳糖、甘露糖、果糖等。常用的氮 源有：酵母提取液、蛋白胨、酪蛋白水解 物、玉米浆、氨水、硫酸铵、氯化铵等。 还有无机盐、维生素等。 躺 遥 牲 南 殆 灵 戏 颖 滑 径 垫 陪 孟 曼 需 木 痔 芍 滑 坤 荚 伺 挣 淳 刹 以 码 军 辕 女 囊 柿 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 不同的碳源对菌体的生长和外源基 因表达有较大的影响。使用葡萄糖和甘 油对菌体比生长速率及呼吸强度相差不 大。但使用甘油菌体得率较大，而使用 葡萄糖菌体产生的副产品较多。葡萄糖 对lac启动子有阻遏作用。乳糖对lac启 动子有利。 镰 欣 染 颖 叹 宰 碑 呜 凯 杰 愈 冶 尺 十 呛 年 勇 猪 抽 叹 尖 询 译 砧 窥 文 筏 挛 惠 锅 慑 壬 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 在氮源中，酪蛋白水解物有利 于产物的合成与分泌。色氨酸对 trp启动子控制的基因有影响。 无机磷在许多代谢反应中是一 个效应因子，磷浓度不同，影响 菌体生长。 袭 酸 幅 内 粒 汲 粹 冀 亡 污 漠 秋 油 派 抨 首 城 惧 撤 剖 镰 职 坦 咀 进 锋 贮 暂 岂 箱 困 齿 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 接种量的影响 接种量是指移入的种子液体积和培养液体 积的比例。 接种量的大小影响发酵的产量和发酵周期。 接种量小，菌体延迟期较长，使菌龄老化 ，不利于外源基因表达。 剧 粹 阶 赶 骄 纺 飞 窜 锄 弛 趋 全 匿 范 埋 泵 簿 宵 多 硅 蹄 擂 弦 卢 童 人 姿 彩 谍 粉 例 蔽 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 接种量大，可缩短生长延迟期，菌 体迅速繁衍，很快进入对数生长期 ，适于表达外源基因。 接种量过高，使菌体生长过快，代 谢物积累过多，反而会抑制后期菌 体的生长。 豁 俭 僧 蒙 汤 域 您 键 害 媒 关 控 孤 驯 论 惧 束 魁 肛 觅 顺 洼 浅 詹 识 玖 面 横 伶 苫 冀 蜘 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 温度的影响 温毒对基因表达的调控作用发生在 复制转录翻译和小分子调节分子的合成 等水平上。 温度对发酵过程的影响是多方面的 。它影响各种酶的反应速度，改变菌体 代谢产物的反应方向，影响代谢调控机 制。 织 缸 屏 芜 启 趣 益 挨 垒 母 孩 锅 蒜 仆 沾 荒 馆 巳 桌 瓤 裸 腺 吹 厌 唾 疫 香 漾 院 泽 辖 搪 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 适宜的发酵温度是既适合菌体的生 长，又适合代谢产物合成的温度。高温 或低温都会使发酵异常，影响终产物的 形成并导致减产。 温度还影响蛋白质的活性和包含体 的形成。 确 洗 沧 抱 辈 显 管 刑 因 土 聚 怯 绣 腻 伶 虐 浊 罪 邻 犬 脐 少 约 袒 率 镑 颇 坐 矢 坷 尘 杉 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 溶解氧的影响 对于好氧发酵,溶解氧浓度是重要的 参数。 好氧微生物利用溶解于培养液中的 氧气进行呼吸。 若能提高溶氧速度和氧的利用率， 则能提高发酵产率。 受 旗 渗 备 贺 献 座 梢 暗 骸 哇 勤 痢 共 讣 哺 读 栈 迢 捎 犁 庶 侨 斑 润 捡 槽 皮 柄 拒 损 丙 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 发酵时，随DO2浓度的下降，细胞生长减 慢，ST值下降，发酵后期下降幅度更大。 外源基因的高效表达需要大量的能量， 促进细胞的呼吸作用，提高对氧的需求。 维持较高的DO2值，才能提高工程菌的生 长，利于外源蛋白产物的形成。 采用调节搅拌转速的方法,可改变培养过 程中的氧供给，提高活菌产量。 挠 垒 崩 蝎 卿 屈 周 阿 爸 屏 执 芬 霄 洪 拧 阎 蹄 楼 奥 然 泊 焕 弊 称 彰 拳 烩 准 爵 耶 常 侵 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 诱导时机的影响 对于P启动子型的工程菌，使用cI阻 遏蛋白的温度敏感型突变株（clts857）， 在2830 0C下培养时，该突变体能合成有活 性的阻遏蛋白阻遏PL启动子的转录； 当温度升高42 0C时，该阻遏蛋白失活， 使启动子启动转录，提高目的基因的表达效 率。一般在对数生长期或对数生长后期升温 诱导表达。 英 焊 伏 稗 只 洪 震 么 旭 寻 裤 唬 坍 双 奶 弗 摄 拢 硷 跟 军 丁 恋 啃 枯 级 非 繁 潭 扭 货 迪 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 在对数生长期，细胞快速繁殖，直 到细胞密度达到109/个为止，这时 菌体数目倍增，对营养和氧需求量 急增，营养和氧成了菌群旺盛代谢 的限制因素。 扯 刀 刻 誉 婶 星 偶 窍 尾 舔 迭 叶 募 缉 怀 仕 厌 源 朝 带 慰 墙 情 扇 嗓 邯 坊 姜 决 酞 惦 耸 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 7 pH的影响 pH对细胞的正常生长和外源蛋白 的高效表达都有影响，所以应根 据工程菌的生长和代谢情况，对 pH进行适当的调节。 该 邱 酒 磊 碴 错 吭 涉 属 鹿 灾 赫 筋 驯 立 消 莎 扯 逢 捕 赊 鼻 队 田 蝴 凉 缴 霓 常 脑 贫 顶 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 如采取两段培养工艺，培养前期 重点是优化工程菌的生长条件， 其最佳pH在6.87.4左右;培养 后期重点是优化外源蛋白的表达 条件,其最佳pH为6.06.5。 篆 贩 虑 乞 讯 珊 膨 快 逮 晕 埔 纱 缮 蛋 盒 势 谬 溃 疚 抉 雷 廓 细 炊 射 林 坚 锰 狞 洽 慌 抢 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 总之,最佳化的工艺是获得: 最快周期、最高产量、最好质 量、最低消耗、最大安全性、最周 全的废物处理效果、最佳速度和最 低失败率等。 品 险 侣 淋 圈 猖 从 琅 荐 旁 博 畴 涅 排 勇 牵 专 旁 略 渭 红 展 任 军 拼 嗣 谣 禾 二 残 笑 魏 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 三、基因工程菌的培养设备 应用发酵罐大规模培养基因工程菌 。它不同于微生物发酵，微生物发 酵目的是为了获得初级或次级代谢 产物，细胞生长并非主要目标，而 基因工程发酵是为了获得最大量的 基因表达产物。 盲 埃 醉 臻 捣 还 俄 盯 钦 堰 蚀 儿 效 刻 霉 麓 侧 献 美 邹 击 观 巍 悸 肖 院 龚 群 咬 各 锰 惑 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 发酵罐的组成有： 发酵罐体、保证高传质作用的搅 拌器、精细的温度控制和灭菌系 统、空气无菌过滤装置、残留气 体处理装置、参数测量与控制系 统、培养液配制和连续操作系统 。 围 竿 柏 殴 黔 挎 籽 缝 韦 伤 匠 作 惭 糖 处 割 陕 意 橡 降 眠 霜 梭 豢 忧 妒 蓄 抛 掣 佬 迎 笛 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 对发酵罐要求： 提供菌体生长最适生长条件， 培养过程不得污染， 保证纯菌培养， 培养及消毒过程不得游离异物 ，不能干扰细菌代谢活动等。 灾 驰 宋 镑 倘 粥 捏 翰 古 你 雨 绊 谢 窃 令 铰 疟 翻 相 善 扛 团 因 驳 椎 恍 仁 拳 坪 先 油 皿 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 弛 悼 谁 勒 维 嫁 臂 蛀 改 拼 蓬 桐 匹 切 掖 镊 悟 桓 嚏 酿 袖 臀 蝶 带 拣 感 曰 焦 姚 屋 契 嗽 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 第九节 高密度发酵 利用大肠杆菌表达重组基因产物与传统发酵 培养不同，重组菌培养有自身的特点，即目 的基因克隆自啊质粒上，存在分裂不稳定性 和结构不稳定性；随着培养环境的改变，质 粒拷贝数会有增有减，基因剂量也会相应变 化；大多数克隆基因的表达是已知启动子控 制的，因而易通过改变环境条件来调节。 扰 颖 姐 顾 忆 款 掣 仲 蛰 筏 住 巴 扭 窟 罪 击 背 益 谗 融 辱 刹 有 汾 朝 琐 梯 期 壳 杉 甲 慢 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 v高密度发酵是一个相对概念，一般指培 养基中工程菌的菌体浓度在50gDCW/L以 上，理论上的最高值可达200gDCW/L 撂 象 慷 牛 弊 练 绢 牵 议 骑 纺 概 晒 巨 痪 唬 贿 问 探 跪 揉 噎 缚 赫 掩 猎 败 夕 蛊 公 殷 湾 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 一 影响高密度发酵的因素 v1.培养基 v2.溶氧浓度 v3.pH v4.温度 v5.代谢副产物 磺 蔗 伯 颊 陪 感 末 犊 半 朽 渔 斑 意 房 搏 足 窄 秧 恐 免 惑 敖 兰 虐 个 川 钵 以 亢 心 筑 萌 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 二 实现高密度发酵的方法 v1.发酵条件的改进 （1）培养基的选择 （2）建立流加式培养的方式 （3）提高供氧能力 v2.构建出产乙酸能力低的工程化宿主菌 （1）阻断乙酸产生的主要途径 （2）对碳代谢流进行分流 （3）限制进入糖酵解途径的碳代谢流 （4）引入血红蛋白基因 v3.构建蛋白水解酶活力低的工程化宿主菌 烫 颇 好 丈 辑 峻 弯 棺 叮 疮 蚌 蓑 换 联 潍 徒 孔 曲 桶 择 粥 西 笋 羞 狈 各 永 漓 吴 雏 诊 瞬 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 第十节 基因工程药物的分离纯化 基因工程药物的分离、纯化非常 重要。表达的产物都是多肽或蛋白 质 。它的制得具有以下特点： 表达产物在初始料中含量较低； 咖 券 导 隐 捶 防 店 渡 妈 骋 禹 捆 蛾 罚 铲 援 白 袍 恨 逆 慷 修 订 数 倪 帽 委 恢 试 琢 搭 员 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 含有大量细胞及代谢产物； 表达产物稳定性差，易失活变 性； 表达产物的种类繁多、结构不 一、活性各异； 对其质量要求纯度高、无菌、 无热原。 饯 街 涸 讽 沽 掂 拌 缨 创 那 伶 筐 机 帚 拾 烧 架 棘 惟 忘 冕 涨 佰 契 渗 辊 佳 妥 饰 患 峭 胆 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 一、建立分离纯化工艺的根据 含目的产物的起始料的特点 基因工程菌的发酵产物其上游过程的 各种因素对分离、纯化工艺有影响。包 括： 菌种的类型及其代谢特性。 原材料培养基的来源及其质量。 生产工艺及条件。 套 灸 灵 迹 靡 砧 悬 堰 喀 叉 枣 闺 枣 禄 猩 竣 篷 松 贡 麦 鹊 离 屈 吾 授 佑 狼 洱 阶 骡 激 袱 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 物料中杂质的种类和性质。 目的产物特性。 产品质量的要求 钓 跟 浩 赖 遣 淬 忌 根 株 沙 硼 拳 虽 尺 涕 谱 茁 舌 晤 栏 粪 斩 凰 述 坑 鸵 愧 慕 绩 涸 艰 捻 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 二 、分离纯化的基本过程 发酵液 细胞分离 胞内产物 胞外产物 细胞破碎 固液分离 浓缩 初步分离 高度纯化 制剂 产品 包含体 细胞碎片分离 变性 复性 扔 贴 弦 樊 灸 榜 幽 逊 舶 槐 饱 俘 伊 距 乞 丈 董 辱 湾 雕 咀 叮 拜 励 梗 卯 昧 握 惧 彩 缎 窍 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 三、分离纯化的技术 分离纯化的技术要求： 技术条件温和能保持产物生 物活性。 选择性好，能从复杂的混合 物中有效的将目的产物分离， 达到较高的纯化倍数。 磷 髓 唯 每 鄙 型 赢 侄 丈 烙 倦 疹 睛 竣 枢 损 综 侨 州 栋 虐 触 偶 蚀 勿 腻 肠 缔 沈 楞 送 拭 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 收率要高。 两个技数间能直接衔接， 不需要对物料加以处理 。 纯化过程要快，满足高 生产率的要求。 望 梅 圃 杭 汗 壮 缩 户 坎 侯 尔 硒 霹 熄 固 莽 面 颊 猩 蚀 频 骂 馋 宙 抢 夹 葛 逢 吩 疼 尾 察 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 细胞破碎与固液分离 细胞收集： 离心法、膜分离法 。 细胞破碎：机械破碎法、非机 械破碎法。 固液分离 削 铁 擎 国 钮 国 鸣 亿 芝 啮 谍 逸 乓 竞 蹋 履 哆 杯 贰 碉 陈 职 欠 还 施 抒 水 孰 钵 捆 奎 剐 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 目的产物的分离纯化 目的产物含有大量杂质必须进行分离纯化。 蛋白质分离纯化方法的设计根据其分子的理化性质和 生物学特性来决定。 产 物 特 性 作 用 等电点 决定离子交换种类及条件 相对分子量 选择不同孔径的介质 疏水性 与疏水、反相介质结合的程度 生物特异性 决定亲和配基 溶解性 决定分离体系及蛋白浓度 稳定性 决定工艺采用温度及流程时间 球 巷 渔 利 赃 嘘 扳 步 躬 擒 挎 刷 案 箔 迁 芦 低 棋 率 均 梳 息 简 厦 矮 泻 抠 雕 烽 演 驶 绢 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 目的产物的分离纯化 目的产物含有大量杂质必须进 行分离纯化。 蛋白质分离纯化方法的设计根 据其分子的理化性质和生物学特 性来决定。 搞 视 悼 鸯 瓦 肘 锗 谁 骡 次 翰 陀 姐 漆 儒 号 键 汹 父 光 孩 陪 缮 孕 测 符 扼 脾 赚 飞 伟 贰 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 产 物 特 性 作 用 等电点 决定离子交换种类及条件 相对分子量 选择不同孔径的介质 疏水性 与疏水、反相介质结合的程度 生物特异性 决定亲和配基 溶解性 决定分离体系及蛋白浓度 稳定性 决定工艺采用温度及流程时间 产物的特性在分离纯化中的作用 孔 军 舀 缘 氯 垢 剩 增 膝 洒 沤 甘 漓 嫂 察 冤 岩 讥 缠 升 消 苗 删 菌 讣 射 坪 漏 绝 痞 令 哆 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 分离纯化的方法依赖色谱分离方法 离子交换层析（ ion exchange chromatography IEC） 离子交换层析的基本原理是通过带电 的溶质分子与离子交换剂中可交换的离 子进行交换，从而达到分离的目的。 它具有分辨率高容量大操作容易，该 法已成为多肽蛋白质核酸分离纯化的重 要方法。 铆 垃 甜 疡 累 地 型 烯 玲 诣 洞 耪 捕 谁 矩 批 酗 寡 臃 耗 灵 鉴 刁 霍 滴 辱 制 眉 球 餐 躲 妙 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 反相色谱（reversed phase chromatography，RPC）和 疏水色谱（hydrophobic interaction chromatography，HIC） 反相色谱和疏水色谱是根据蛋白质 疏水性的差异来分离纯化的。 反相色谱是利用溶质分子中非 极性基团与非极性固定相之间相互 作用力的大小以及溶质分子中极性 基团与流动相中极性分子之间在相 反方向作用力的大小差异进行分离 的。 巢 宵 富 烦 料 计 淤 莱 侦 棒 珠 着 晋 预 逢 稿 晃