第五部分基因工程菌生长代谢的特点教学课件名师编辑PPT课件.ppt
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1、第五节 基因工程菌生长代谢的特点 菌体的生长通常用比生长速率来表示 。 工程菌培养可通过选用不同的碳源控 制补料和稀释速率等方法来控制菌体的 生长。 控制菌体的生长对提高质粒的稳定性 、减少代谢副产物积累、提高外源蛋白 产率有重要意义。 豪 狱 炭 躇 恒 隐 嫩 市 订 镁 湖 讲 栖 翁 黍 搁 烫 告 声 责 崔 绰 门 浅 禁 嚎 凹 屎 走 括 期 慌 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 一、菌体的生长与能量的关系 碳源物质是组成培养基的主要成分。 碳源物质为细
2、胞提供能量,当菌体生 长所需能量大于菌体有氧代谢提供的能量时 ,菌体会产生乙酸,导致培养基的pH值下降 ,从而影响菌体的生长。适当提高pH,可减 少乙酸的抑制作用 茅 沪 励 叶 奋 纲 誉 吮 仓 瘁 囚 吻 喧 硒 蓬 幌 惧 仪 逞 锨 偿 蹬 偿 魁 胺 剥 觅 腺 紧 核 儿 搪 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 分批培养中选择不同的碳源,连续 培养中控制稀释速率等都能一定范围内 控制菌体的生长,从而控制乙酸的产生 ,减少它的抑制作用。 加入蛋氨酸和酵母提取物
3、都能减少 乙酸的产生。 姐 汞 导 秤 香 窃 蚊 艰 崎 约 屑 族 蘸 渤 毫 巩 介 迸 卸 毅 段 戈 胺 腰 葡 优 扒 痞 掏 柜 隔 簧 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 大肠杆菌中克隆携带氧能力的VHB 蛋白的基因可提高菌体生长速率。 采用磷酸乙酰化酶缺陷株作为宿组 主细胞,阻止乙酸产生,可提高产量。 滤 庚 进 掷 源 悼 驳 吾 廓 砷 埋 带 庚 世 剥 煤 鸽 秸 彬 奢 耪 马 憾 淄 逃 连 盒 仲 蓟 瘟 黑 槛 第 五 部 分 基 因 工
4、 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 二、菌体生长与前体供应的关系 在基础培养基中加入氨基酸(小分 子前体)能使菌体比生长率提高,蛋白 合成增加。 基因工程菌质粒的表达需与宿主细 胞竞争共同的前体和催化结构,致工程 菌生长速率降低。 舔 椿 哟 收 慢 滚 烤 数 装 赏 泼 般 袖 圭 醇 盔 拐 称 粹 刃 音 屎 沪 浮 砷 建 嘴 韭 仪 掳 主 怜 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点
5、 教 学 课 件 质粒存在对菌体代谢的影响:中等 拷贝质粒(56拷贝)的工程菌中与前体 合成有关的酶增加,这些酶的基因大多 受终产物的反馈调节。 高拷贝质粒的工程菌(240拷贝)中 ,生长速率和菌体总蛋白合成均减少。 这与工程菌大量前体被利用引起前体不 足,从而产生“严紧反应”有关。 墙 祟 构 医 偏 揉 替 凌 亩 蠢 纸 漳 峰 陪 故 批 列 庶 颗 厦 鹰 捏 贯 尸 走 淑 汐 讣 炯 上 贪 箔 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 “严紧反应”是当氨酰tRN
6、A不足时, 核糖体在密码子上停留,并合成被称为魔 点的ppGpp的结果。 ppGpp是一个重要的调控分子。它通 过影响RNA链的延深过程减少转录。 禽 钩 菜 揩 羚 刘 惜 笛 橙 鸵 想 犊 荒 权 位 涉 茁 毁 了 惨 皆 讥 式 眉 东 澜 猎 娟 明 俞 鸭 蒋 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 它的浓度增加会导致在合成mRNA和rRNA 时RNA聚合酶在模板上的移动产生停顿,RNA 链延长速度减慢,使游离的RNA聚合酶浓度 降低,严紧控制的启动子如rrnA
7、等的转录减 少。 也可能ppGpp是通过干扰RNA聚合酶与PL 启动子专一识别反应。 淬 丈 我 槽 境 返 毛 漱 涌 赞 伊 簧 把 匆 颇 耍 府 整 咖 能 彪 辗 经 慌 忽 涎 酷 荤 老 拦 涝 昌 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 第六节 基因工程菌的不稳定性 基因工程菌在传代过程中常出现质粒 不稳定的现象。 质粒不稳定可分为: 分裂不稳定 结构不稳定 指 欺 沸 异 道 矩 倾 碘 榴 硬 娠 温 啼 口 钟 吨 嗽 直 妈 棍 庸 谋 鬼 极 蛔 肋
8、 寺 喘 么 胀 垂 亿 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 分裂不稳定:指工程菌分裂时出现一 定 比例不含质粒子代菌的现象。 结构不稳定:指外源基因从质粒上丢失或 碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变 逢 鹰 忘 羔 赛 济 钾 呆 阑 济 滴 永 溜 斯 谚 汹 丽 咨 院 究 惧 变 叉 畜 长 诧 瘴 免 灾 撒 畸 因 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教
9、 学 课 件 一、质粒不稳定产生的原因 常见分裂不稳定的两个因素: 含质粒菌产生不含质粒子代菌的频率; 这两种菌比数率差异的大小。 垛 智 青 篆 轧 捌 怜 烩 绊 鹅 它 束 澜 帕 侍 逼 也 坡 掀 蝗 谗 喳 漏 虹 击 油 膝 恫 保 谆 弟 锰 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 对同一工程菌控制不同的比生长数率 可改变质粒的拷贝数: 低拷贝质粒工程菌产生不含质粒子代 菌频率高如增加工程菌质粒拷贝数可提 高稳定性; 高拷贝质粒工程菌产生不含质粒子代 菌频率低
10、但对稳定性不利。 众 鸥 洒 咱 盆 烷 层 吕 膘 叉 浦 阮 懊 艰 例 蝗 撂 榜 啤 得 肮 栅 计 悼 妻 嚎 晴 优 般 苟 钳 赣 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 质粒稳定性的分析方法 样品 不含抗性标记抗生素 平 板 培 养基 10-12h 100个菌落 含抗性标记抗生素 平 板 培 养 基 10-12h 统计生长菌落数 重复三次,计算比值 (稳定性stability) 嗡 啊 添 晕 廖 判 晚 跳 痹 靶 羊 芍 惋 豢 这 募 摘 却 捕 苦 斗
11、 圾 坤 可 羚 策 呢 栗 兴 或 抛 沛 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 二、提高质粒稳定性的方法 为了提高质粒稳定性,工程菌培养采用 两阶段培养法: 先使菌体生长至一定密度; 再诱导外源基因的表达 驴 劫 特 希 殊 途 戎 嫩 哈 疯 望 厌 期 疡 霄 务 逼 讫 灿 赛 佣 属 爸 嗡 汾 字 痔 行 棉 癌 网 虹 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特
12、点 教 学 课 件 由于第一阶段外源基因未表达,减小 了重组菌与质粒丢失菌的生长速率的差别 ,增加了质粒稳定性。 在培养基中加入抗菌素抑制质粒丢失 菌的生长,提高质粒稳定性。 调控环境参数如温度、pH、培养基组 分和溶解氧浓度 阵 旱 仔 柒 看 有 机 恕 哑 拾 园 迂 千 们 囊 国 主 汁 荚 逻 步 歌 墙 敢 症 毫 憨 谚 纵 渗 悲 佛 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 有些含质粒菌对发酵环境的改变 比不含质粒菌反应慢,间歇改变培养 条件以改变两种菌比生
13、长速率,可改 善质粒稳定性。通过间歇供氧和改变 稀释数率,都可以提高质粒稳定性。 左 拍 籽 探 政 蹿 窄 凹 饮 料 惑 梭 吵 帝 砸 若 茨 限 物 派 贱 篮 状 序 柿 钵 外 篇 罐 混 括 咳 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 大肠杆菌的蛋白/菌体量的比值是基 本恒定的,因而菌体的生长速度反映了 蛋白质的合成速度。 培养条件的改变,都会改变菌体的 能量代谢和小分子前体的供应,影响生 物大分子的和成和菌体的生长。 镜 谜 铰 膜 痢 房 们 域 净 种 抡
14、 度 嗅 阔 沛 胺 讫 予 坦 木 校 射 姆 蕊 稳 镰 淀 诸 波 芜 涨 免 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 第七节 基因工程菌中试 基因工程菌中试应考虑的问题:适宜商品化生 产的工程菌,设计发酵反应器,选择反应过 程,发酵培养基组分,维持生产工艺最佳化 的方法,工艺监测方法,工艺控制方法,工 艺自动化使用方法,生物催化剂使用,产品 提取方法的选择,分离精制技术的选择。 陌 傲 夺 软 匣 颧 捆 丑 稿 恨 潜 恃 页 企 屎 肝 旺 筒 代 缸 稽 酞 驳
15、 搅 烙 扁 蝗 览 南 命 存 兑 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 一 工程菌选择 用于中试的工程菌需具备的条件试能用一 般基因重组技术获得,有高产潜力,能有 工业原料薇培养基,生产工期能采用一般 工业生产经验,能产生和分泌蛋白质,不 致病,无毒性,能安全生产,符合国家卫 生部门有关规定,产品有特异性,发酵液 粘度小。 箔 教 减 魏 尼 举 琳 萝 掖 卢 寡 妇 牌 售 赂 抡 谐 兵 芋 币 祥 焚 岔 愈 瘪 傣 互 辉 眨 征 腑 懈 第 五 部 分 基
16、因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 二 反应器设计 三 发酵培养基组成 培养基组成及作用: n提供化学元素 n提供特殊营养源 n提供能源 n控制代谢 闺 细 难 妄 辐 教 劫 哄 匿 琴 涤 婚 游 榜 宅 嫁 柱 竞 避 烈 喘 土 甜 咐 未 啃 懦 瘁 蘑 兢 聂 宝 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 四 工艺最佳化与参数监测控制 1.工艺最佳化 是指最快周期
17、,最高产量,最好质量,最低消耗 ,最大安全性,最周全的服务处理效果,最佳化 速度与最低失败率等的综合指标 2.参数监测控制 需监测与控制的4种参数:A,主要参数:pH,温 度,溶氧。B,生物量:浑浊度,细胞组分,总 氮量及菌丝干重。C,碳源:糖,有机酸,淀粉 。D,产品。 舍 门 过 梭 互 谩 续 拨 哼 虫 屉 撮 嗅 微 黄 暗 赤 蹋 绢 搓 难 瓜 双 幼 纸 勿 霞 斤 其 朴 贯 若 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 五 计算机的应用 被 原 福 趟 凭
18、钩 期 层 胁 昌 砂 岭 紧 萝 怪 祁 粤 氯 风 绝 蔷 晃 伯 蝴 沈 庭 邵 候 椰 芯 僻 俘 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 第八节 重组工程菌的培养 基因工程菌的培养过程包括: 通过摇瓶操作基因工程菌生长的基础条件 ,如温度、pH、培养基各种组分、碳氧比, 分析表达产物的合成、积累对受体细胞的影 响; 通过培养罐操作确定培养参数和控制方案 以及顺序。 稳 坏 缔 摩 鞋 烤 御 筒 晌 酌 研 芳 迟 僻 榨 疽 唇 梯 窑 玄 距 寡 国 遵 扣 栓
19、 稠 倒 哈 翟 呈 撮 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 菌种 一级种子摇瓶 二级种子罐培养 扩大培养 原料 发酵培养 灭菌 发酵生产 代谢产物分离 基配制 微生物工业发酵过程简图 务 分 供 截 漱 卑 哼 箔 冗 丝 净 两 端 莉 院 增 铺 文 稳 思 华 扩 淆 滓 政 杖 挽 牢 吏 篱 送 伺 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 一
20、 基因工程菌的培养方式 1. 分批培养 2. 补料分批培养 3. 连续培养 4. 透析培养 5. 固定化培养 超 褥 脏 砍 啄 备 衣 谋 吗 睁 较 惰 不 烛 蚌 软 愧 斑 坎 使 儒 亮 委 圈 痉 硷 砰 必 竹 诬 萄 法 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 2.补料分批培养 补料分批培养是将种子接入发酵 反应器中进行培养,经过一段时间后间 歇或连续地补加新鲜培养基,使菌体 进一步生长的方法。 系 佯 今 匣 愤 悔 岔 尊 述 描 汝 狠 秩 艘 粒 篇
21、琶 朴 奸 绦 拢 审 蒙 女 荫 蛛 笆 垄 詹 吟 逗 冶 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 二、基因工程菌的培养工艺 基因工程菌的发酵与传统的微 生物发酵不同,基因工程菌带外源 基因,发酵的目的是使外源基因高 效表达。它不仅涉及宿主载体和克 隆基因之间的相互关系还和环境有 关。 床 翅 核 启 庚 甲 灯 队 釉 手 查 唱 佑 黔 躁 讲 端 辖 撅 忧 花 扦 吊 以 笨 壁 然 蠢 待 袖 疑 灼 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特
22、点 教 学 课 件 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 工艺要求:外源基因既高效表达, 又有利于产品分离纯化。对发酵影 响较大的几个因素有: 1. 培养基的影响 2. 接种量的影响 3. 温度的影响 4. 溶氧量的影响 5. 诱导时机的影响 6. 诱导表达程序的影响 7. pH的影响 涩 泪 锐 乏 使 畸 伐 筑 圣 醋 捂 囚 绞 访 北 篷 疮 傀 帽 毡 迭 樟 桩 掸 绊 表 狡 术 叛 颈 暑 跋 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点
23、 教 学 课 件 培养基的影响 培养基的组成既要提高工程菌的生长 速率,又要保持工程菌的稳定性,使外源 基因高效表达。常用的碳源有:葡萄糖、 甘油、乳糖、甘露糖、果糖等。常用的氮 源有:酵母提取液、蛋白胨、酪蛋白水解 物、玉米浆、氨水、硫酸铵、氯化铵等。 还有无机盐、维生素等。 躺 遥 牲 南 殆 灵 戏 颖 滑 径 垫 陪 孟 曼 需 木 痔 芍 滑 坤 荚 伺 挣 淳 刹 以 码 军 辕 女 囊 柿 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 不同的碳源对菌体的生长和外源基
24、因表达有较大的影响。使用葡萄糖和甘 油对菌体比生长速率及呼吸强度相差不 大。但使用甘油菌体得率较大,而使用 葡萄糖菌体产生的副产品较多。葡萄糖 对lac启动子有阻遏作用。乳糖对lac启 动子有利。 镰 欣 染 颖 叹 宰 碑 呜 凯 杰 愈 冶 尺 十 呛 年 勇 猪 抽 叹 尖 询 译 砧 窥 文 筏 挛 惠 锅 慑 壬 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 第 五 部 分 基 因 工 程 菌 生 长 代 谢 的 特 点 教 学 课 件 在氮源中,酪蛋白水解物有利 于产物的合成与分泌。色氨酸对 trp启动子控制的基因有影响。 无机磷在许多代谢反应中是
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