康为世纪技术讲座-上医(WB&IF)-2.ppt
Western Blot & Immunofluorescence www.cwbiotech.com 01062667528,北京康为世纪生物科技有限公司 技术总监 刘雪松,2,内 容,生物学反应系统检测原理,反应系统：蛋白与蛋白、核酸与核酸 指示系统： 酶、荧光素、同位素,直接法 间接法,背景知识,6,单克隆抗体和多克隆抗体,7,多克隆抗体： 多株B细胞针对多个抗原 决定簇产生的抗体。,多克隆抗体,单克隆抗体,单克隆抗体： 由单一克隆B细胞杂交骨髓瘤细胞产生的,只识别一种抗原表位的具有高度特异性的抗体。,制备单克隆抗体的流程,抗原的种类,一 颗粒性抗原 细胞，细菌 二 可溶性抗原 表达蛋白 合成多肽 细菌或病毒的某种蛋白,抗原的要求,1 抗原量的要求，蛋白2mg,多肽 56mg 2 纯度要求，蛋白纯度要90%以上，SDS-PAGE要一条带，多肽纯度要85%以上。 3 蛋白背景，是否带有标签蛋白？与其他蛋白的同源性,康为提供的服务,1 蛋白表达，制备抗体 2 客户提供蛋白序列，我们提供蛋白表位预测、多肽合成，多肽与载体交联，制备抗体 3 抗体制备后的后续服务， 抗体的纯化，蛋白A/G，抗原或多肽的特异性亲和纯化 抗体的标记，HRP，FITC 抗体识别不同表位的测定 ELISA 配对抗体的筛选 IHC、WB 的应用,12,一抗和二抗,13,一抗：针对抗原的抗体,二抗：针对一抗的抗体,单克隆抗体,多克隆抗体,带标记的抗体（生物素、HRP、AP）,应 用,研究检测样品中特异性蛋白质的存在 细胞中特异蛋白质的半定量分析 蛋白质分子的相互作用研究,14,抗体的化学结构及其模式图,15,免疫球蛋白根据重链结构命名： IgG(), IgA()，IgD(), IgE()， IgM(),抗体的化学结构及其模式图,16,五种免疫球蛋白只有两种类型的 轻链： Kappa()和Lambda() 每个抗体分子的轻链必须相同； 某一单独的抗体分子决不可能既有 链又有链。这一点在免疫组化的淋 巴瘤诊断中十分重要。,17,内容,Western Blotting 免疫印迹，是指将蛋白样品转移到固相载体上，而后利用相应的抗体来检测目的蛋白的一种方法。,间接Western Blotting操作流程,Y,发光或显色,第一步：电泳分离蛋白质,Bac-细菌蛋白抽提试剂 Mam-哺乳动物蛋白抽提试剂 Yea-酵母蛋白抽提试剂 Tis-组织蛋白抽提试剂 Mem-真核细胞膜蛋白提取试剂盒 Nc-细胞核/细胞浆抽提试剂盒,WB过程中最重要的一点就是确定目的蛋白在组织、细胞中的定位，选择合适的提取方法把目的蛋白提取出来才能进行后续的实验 防止蛋白质的降解,蛋白抽提,第一步：电泳分离蛋白质,定量,Bradford,BCA,Lowry,22,SDS-PAGE,第二步：转膜,膜的选择：NC，PVDF，尼龙膜 转膜方法：半干转、湿转 转膜确认,印迹膜选择,转移方法,半干转 湿转,25,注意：对于大分子量的蛋白建议使用湿转,转膜后确认,丽春红 可逆染色 与下游WB检测完全相容，无任何干扰 蛋白质预染Marker 实时监测 分子量参照,第三步：封闭,封闭液选择 BSA 脱脂奶粉（涉及到生物素系统，避免使用） 封闭条件优化 时间 温度,第四步：抗体孵育,一抗的选择 单克隆抗体 多克隆抗体,二抗的选择 HRP，AP，生物素，荧光素，罗丹明标记,注意：抗体的稀释倍数是由底物和待检 测蛋白质的丰度决定的，为了获得最佳 实验结果，强烈推荐进行预实验，以确 定具体的实验参数,两种常用检测酶系统的比较,第五步检测方法,化学显色法 方便、便宜、有毒、灵敏度较低、费抗体、反应慢、线性窄、不易保存、不能重新剥离检测 化学发光法 灵敏、快速、节省抗体、反应快、线性宽、无害、特异性高、可重新剥离检测,康为世纪化学发光底物特点,高灵敏度：比显色法高103-106倍 灵敏度选择（普通型10-11g,增强型pg级别） 节约抗体:其它底物用量1/101/1000 强信号，长发光，824小时 底物稳定，常温保存 检测快速：1-5分钟 高特异性，高信/噪比 检测方便： X光片或CCD检测 多次曝光：选择满意的信号强度,32,化学发光底物选择原则,样品丰度 检测灵敏度,34,内容,常见问题分析,比较均一的高背景 信号弱或者无信号 非特异性条带 信号下降太快,比较均一的高背景,比较均一的高背景续表,信号弱或者无信号,信号弱或者无信号续表,非特异性条带,A 1：5000 B 1：10000 C 1:5000 D 1:10000 抗血清检测结果,信号下降太快,推荐,对照设置 内参照 beta-actin /beta-tubulin/GAPDH 阳性对照 检测一抗是否正常 阴性对照 检测一抗特异性 空白对照 不加一抗，光加二抗，检测二抗是否发生交叉反应,45,优化条件 电泳分离蛋白质：蛋白抽提，样品制备，电泳 转膜：膜的选择，转膜确认 封闭：封闭液选择，封闭条件优化 漂洗：漂洗液的配制与选择 抗体孵育：抗体选择，抗体稀释倍数优化 底物孵育：恰当的发光或显色底物 曝光：曝光时间掌控,46,打造完美的实验结果,特别推荐：不需反复作WB的选择 Stripping buffer,无须反复电泳和转膜，节省宝贵时间 节省珍贵的样品 在不损伤蛋白的基础上，剥离一抗和二抗 一份样品，一次电泳，一次转膜，多次印迹，更多数据,Stripping buffer应用实例,Beta-actin,漂洗,GAPDH,特别推荐 可曝光的Marker Western blot Marker,可结合二抗或通过一抗间接结合二抗 可与目的蛋白在同一张胶片上曝光,特别推荐 可曝光的marker Western-Show Marker,6条蓝色条带，电泳过程全程监控 35kD条带可结合抗体， 可与目的蛋白一起曝光,内容,52,免疫荧光概念,免疫荧光（Immunofluorescence）技术是利用抗原抗体特异性结合的原理，用经荧光染料标记的抗体对细胞或组织内的蛋白质进行定性或定量研究的方法。该技术与荧光显微镜观察相结合，可对特定的蛋白质进行细胞或组织内的精确定位。,53,常用的荧光染料 显示绿色荧光：Fluorescein isothocyancie(FITC), Alexa-488 显示红色荧光：Rhodamine B, Texas Red, Alexa-546,568,594 显示蓝色荧光：Alexa350,54,直接法,间接法,55,免疫荧光操作过程,第二步,第三步,第一步,待测样本的准备 爬片 固定 封闭 取材 冰冻 切片,免疫荧光染色 一抗结合 二抗结合 衬 染,细胞爬片,冰冻切片,染色,后处理 封片,56,待测样品的准备,57,取材和固定,细胞爬片的制备,固定,目 的： 通过物理和化学方法使细胞内蛋白质凝固，终止或减少外 源性和内源性细胞内分解酶的反应，防止细胞自溶,常用方法： 甲醇、多聚甲醛或丙酮 ，室温，一般为10-20min。,透化和封闭,透化：0.2Triton X100 （丙酮固定法不用透化处理 ） 封闭：二抗相同宿主的血清封闭,一抗及二抗孵育,60,一抗4度湿盒内过夜，或37 1-2小时,二抗室温2小时（避光），或者37度1个半小时 PBS洗三遍,衬 染,61,伊文氏蓝，红色荧光。 DAPI染核，蓝色荧光。,封 片,95甘油封片 抗淬灭剂,62,特异性荧光强度：,63,（-）无荧光； （±）极弱的可疑荧光； （+）荧光较弱，但清楚可见； （+）荧光明亮； （+ -+）荧光闪亮。,镜下观察,64,Indirect immunofluorescence of iron-regulated cell wall mannoprotein FIT1 of S. cerevisiae,镜下观察,65,Confocal image to detect phosphorylated AKT (green) in cardiomyocytes infected with adenovirus,66,内容,67,IF常见问题分析,1.设立实验对照,2.出现背景,3.信号微弱,68,设立实验对照,阳性对照：没有阳性对照就无法做出真正的阴性结果判断。,阴性对照：没有阴性对照就无法做出真正的阳性结果判断。,找到合适的阳性对照和阴性对照是正确判断实验结果的保障,荧光标记物对照：PBS+荧光标记物,69,结果判断标准,1.设立好对照是前提,2.阳性信号必须在细胞和组织特定的抗原部位才能视为阳性,3.阴性结果不能视为抗原不表达,4.避免假阳性和假阴性的发生,不在特定部位，不视为阳性,即使1个细胞阳性，也视为阳性,Barrier Filters,70,出现背景的几种原因,1.正常动物血清使用不合理 ：如二抗为羊抗兔IgG，应该用羊的正常血清。,3.缓冲液洗涤不够干净 ：增加清洗次数并延长时间，减少残液，缓冲液每次更换。,4.抗体稀释不合理，浓度太高,2.缓冲液及洗涤液中加入2%吐温-20,71,如何最大限度减低背景,1.合适的一抗浓度 ：检测推荐稀释度上下两个梯度。,2.实验组织 ：及时固定新鲜的细胞,3.优先选择单抗 ：多抗有非特异性着色。,4.PBS冲洗充分：冲洗不充分有非特异性着色。,6.避免细胞过于干燥 ：否则无法补救。,5.缓冲液及洗涤液中加入2%吐温-20,72,荧光减弱,荧光染色后一般在1h内完成观察，或于4保存4h，时间过长 ，会使荧光减弱 提高一抗和二抗的浓度 延长一抗和二抗的孵育时间 改变检测方法，用共聚焦显微镜观察，可提高敏感性,73,北京康为世纪生物科技有限公司,74,010-62667528 www.cwbiotech.com,75,76,77,THANK YOU 01062667528,
