康为世纪技术讲座-上医(WB&IF)-2.ppt
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1、Western Blot & Immunofluorescence 01062667528,北京康为世纪生物科技有限公司 技术总监 刘雪松,2,内 容,生物学反应系统检测原理,反应系统:蛋白与蛋白、核酸与核酸 指示系统: 酶、荧光素、同位素,直接法 间接法,背景知识,6,单克隆抗体和多克隆抗体,7,多克隆抗体: 多株B细胞针对多个抗原 决定簇产生的抗体。,多克隆抗体,单克隆抗体,单克隆抗体: 由单一克隆B细胞杂交骨髓瘤细胞产生的,只识别一种抗原表位的具有高度特异性的抗体。,制备单克隆抗体的流程,抗原的种类,一 颗粒性抗原 细胞,细菌 二 可溶性抗原 表达蛋白 合成多肽 细菌或病毒的某种蛋白,
2、抗原的要求,1 抗原量的要求,蛋白2mg,多肽 56mg 2 纯度要求,蛋白纯度要90%以上,SDS-PAGE要一条带,多肽纯度要85%以上。 3 蛋白背景,是否带有标签蛋白?与其他蛋白的同源性,康为提供的服务,1 蛋白表达,制备抗体 2 客户提供蛋白序列,我们提供蛋白表位预测、多肽合成,多肽与载体交联,制备抗体 3 抗体制备后的后续服务, 抗体的纯化,蛋白A/G,抗原或多肽的特异性亲和纯化 抗体的标记,HRP,FITC 抗体识别不同表位的测定 ELISA 配对抗体的筛选 IHC、WB 的应用,12,一抗和二抗,13,一抗:针对抗原的抗体,二抗:针对一抗的抗体,单克隆抗体,多克隆抗体,带标记的
3、抗体(生物素、HRP、AP),应 用,研究检测样品中特异性蛋白质的存在 细胞中特异蛋白质的半定量分析 蛋白质分子的相互作用研究,14,抗体的化学结构及其模式图,15,免疫球蛋白根据重链结构命名: IgG(), IgA(),IgD(), IgE(), IgM(),抗体的化学结构及其模式图,16,五种免疫球蛋白只有两种类型的 轻链: Kappa()和Lambda() 每个抗体分子的轻链必须相同; 某一单独的抗体分子决不可能既有 链又有链。这一点在免疫组化的淋 巴瘤诊断中十分重要。,17,内容,Western Blotting 免疫印迹,是指将蛋白样品转移到固相载体上,而后利用相应的抗体来检测目的蛋
4、白的一种方法。,间接Western Blotting操作流程,Y,发光或显色,第一步:电泳分离蛋白质,Bac-细菌蛋白抽提试剂 Mam-哺乳动物蛋白抽提试剂 Yea-酵母蛋白抽提试剂 Tis-组织蛋白抽提试剂 Mem-真核细胞膜蛋白提取试剂盒 Nc-细胞核/细胞浆抽提试剂盒,WB过程中最重要的一点就是确定目的蛋白在组织、细胞中的定位,选择合适的提取方法把目的蛋白提取出来才能进行后续的实验 防止蛋白质的降解,蛋白抽提,第一步:电泳分离蛋白质,定量,Bradford,BCA,Lowry,22,SDS-PAGE,第二步:转膜,膜的选择:NC,PVDF,尼龙膜 转膜方法:半干转、湿转 转膜确认,印迹膜
5、选择,转移方法,半干转 湿转,25,注意:对于大分子量的蛋白建议使用湿转,转膜后确认,丽春红 可逆染色 与下游WB检测完全相容,无任何干扰 蛋白质预染Marker 实时监测 分子量参照,第三步:封闭,封闭液选择 BSA 脱脂奶粉(涉及到生物素系统,避免使用) 封闭条件优化 时间 温度,第四步:抗体孵育,一抗的选择 单克隆抗体 多克隆抗体,二抗的选择 HRP,AP,生物素,荧光素,罗丹明标记,注意:抗体的稀释倍数是由底物和待检 测蛋白质的丰度决定的,为了获得最佳 实验结果,强烈推荐进行预实验,以确 定具体的实验参数,两种常用检测酶系统的比较,第五步检测方法,化学显色法 方便、便宜、有毒、灵敏度较
6、低、费抗体、反应慢、线性窄、不易保存、不能重新剥离检测 化学发光法 灵敏、快速、节省抗体、反应快、线性宽、无害、特异性高、可重新剥离检测,康为世纪化学发光底物特点,高灵敏度:比显色法高103-106倍 灵敏度选择(普通型10-11g,增强型pg级别) 节约抗体:其它底物用量1/101/1000 强信号,长发光,824小时 底物稳定,常温保存 检测快速:1-5分钟 高特异性,高信/噪比 检测方便: X光片或CCD检测 多次曝光:选择满意的信号强度,32,化学发光底物选择原则,样品丰度 检测灵敏度,34,内容,常见问题分析,比较均一的高背景 信号弱或者无信号 非特异性条带 信号下降太快,比较均一的
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