细胞生理20084.ppt

第三章 细胞生物学研究方法,细胞形态结构的观察方法 细胞组分的分析方法 细胞培养、细胞工程与显微操作技术 用于细胞生物学研究的模式生物,第一节 细胞形态结构的观察方法,光学显微镜技术（ Light microscopy ） 电子显微镜技术 ( Electro microscopy ) 扫描遂道显微镜 (Scanning tunnel microscope ， STM),一、Light microscopy,普通复式光学显微镜技术 荧光显微镜技术 （Fluorescence Microscopy） 暗视野显微镜技术,激光共焦扫描显微镜技术 （Laser Confocal Microscopy） 紫外线显微镜技术,相差显微镜 （phase-contrast microscope） 微分干涉显微镜 （differential interference contrast microscope, DIC） 录像增差显微镜技术 （video-enhance microscopy）,（一）普通复式光学显微镜技术,普通光学显微镜,1. 构成： 照明系统; 光学放大系统; 机械装置 2. 原理：经物镜形成倒立实像，经目镜放大成虚像。,石蜡切片的基本流程,材料固定(F.A.A固定液) 逐级脱水(不同浓度的酒精) 二甲苯透明透蜡纯蜡包埋材料修块切片二甲苯脱蜡染色逐级脱水(不同浓度的酒精) 封片永久切片,光镜样本制作,影响显微镜成像清晰度最关键的因素是显微镜的分辨率 , 分辨率 是指显微镜能将近邻的两个质点分辨清楚的能力, 分辨率的大小决定于光波的波长和镜口率, 通常是用相邻两点间的距离来表示.,光学显微镜的分辨率( D=0.61/NA),其中为入射光线波长；可见光波长400700nm, 计算时取其平均值为550nm. NA为镜口率 sin/2， n=物镜与标本间介质折射率； =镜口角（聚光器交点对物镜镜口的张角）,镜口角总是要小于180o, 所以sin/2的最大值必然小于1.,几种介质的折射率,介质折射率越接近镜头玻璃的（1.7）越好。油镜头用香柏油为介质，镜口率可接近1.5，如用溴萘,镜口率可达1.6，根据计算, 显微镜最小数值不会小于0.2m, 即分辨率约为0.2m (人眼的分辨力为0.2mm)，因此显微镜的最大有效倍数为10001500。,0.2m这一数值是光学显微镜分辨率的极限. 限制显微镜分辨率的关键因素是光的波长(光的衍射效应), 光学显微镜无论制作得如何精密, 都无法突破是一极限.,紫外显微镜,原理: 光源光波越短,显微镜的分辨本领越大. 波长介于400nm与X射线之间的辐射称为紫外线或紫外光. 特点: 紫外线为光源, 分辨率可提高一倍, 用特殊材料(如石英等)制成的光学玻璃来制作显微镜透镜.常配有照相装置. 用途: 观察胶体颗粒,测定细胞核中有核酸含量. 不足: 价格比较昂贵,使用受限.,（二）荧光显微镜技术（Fluorescence Microscopy）,荧光显微镜 Fluorescence microscope,荧光显微镜成像原理,荧光显微镜成像原理,荧光显微镜特点：,光源为短波光；有两个特殊的滤光片(激发光滤片和阻断滤片)；照明方式通常为落射式。 激发光滤片: 光源和样品之间, 只让能激发荧光染料发光的特定波长的光通过. 阻断滤片: 物镜和目镜之间, 只让染料所发出的荧光通过.,荧光显微镜可以观察细胞内天然物质(自发荧光)或经短波光照射后发出荧光的物质(诱发荧光)， 如叶绿体中的叶绿素能发出血红色荧光。也可观察诱发荧光物质，如用丫啶橙染色后，细胞中RNA发红色荧光，DNA发出绿色荧光，根据发光部位，可以定位研究某些物质在细胞内的变化情况。,应用： 直接荧光标记技术 间接免疫荧光标记技术 在光镜水平用于特异蛋白质等生物大分子的定性定位：如绿色荧光蛋白(GFP)的应用。,直接荧光标记技术,用于观察能激发出荧光的结构。用途：免疫荧光观察、基因定位、疾病诊断。,Fluorescence image, DNA in blue and Microtubules in green,暗视野显微镜,使照明光线不直接进入物镜。只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，因而视野的背景是黑的,物体的边缘是亮的。 利用这种显微镜能见到小至的质点,分辨率比普通显微镜高了40倍,有些细胞器,如核、线粒体,均清晰可见。,（三）激光扫描共焦显微镜技术（LSCM） （Laser Scanning Confocal Microscopy）,原理：,激光共聚焦扫描显微镜光路图,特点：,在某一瞬间只用很小一束光照明,这一束光通过检测器前的一个小孔后只让来自该焦平面的光成像. 物镜和聚光镜同时聚焦到同一点.即它们互相共焦点.,用激光作光源，逐点、逐行、逐面快速扫描。 能显示细胞样品的立体结构。 分辨率是普通光学显微镜的3倍, 是荧光显微镜的1.4-1.7倍。像异常清晰. 用途类似荧光显微镜，样品一般须经免疫荧光标记, 但能扫描不同层次，形成立体图像。,应用： 由于它能排除焦平面以外光的干扰，增强图像反差和提高分辨率，可重构样品的三维结构。在亚细胞结构与组分的定位及动态变化等的研究中应用广泛.,LCSM Image of a Xenopus Melanophore microtubule cytoskeleton (green) and the nucleus (blue) http:/www.itg.uiuc.edu,非洲爪蟾黑色素细胞,（四）相差显微镜 （phase-contrast microscope） 原理: 将透过标本的可见光的光程差或相位差转换成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。 用途: 可用于观察活细胞，研究细胞核、线粒体等细胞器的动态.,相差显微镜特点,在构造上，相差显微镜有不同于普通光学显微镜两个特殊之处。 1. 环形光阑（annular diaphragm）：位于光源与聚光器之间。 2. 相位板（annular phaseplate）：物镜中加了涂有氟化镁的相位板，可将直射光或衍射光的相位推迟1/4。,（五）微分干涉显微镜(DIC显微镜) （differential-interference microscope）,DIC利用的是偏振光 增加了四个光学组件: 偏振器, DIC棱镜(石英Wollaston棱镜), DIC滑行器(第二个Wollaston棱镜), 检偏器. 偏振器: 在聚光系统前, 使光线发生线性偏振. DIC棱镜: 将一束光分解成偏振方向不同的两束光, 二者成一小夹角.,DIC滑行器: 物镜后的焦平面处, 把两束通过样品发生了光程差的光波合并成一束(两束光的偏振面仍然存在) 检偏器: 第二个偏振装置, 在光束形成目镜DIC影像之前, 检偏器与偏光器的方向成垂直角. 检偏器将两束直的光波组合成具有相同偏振面的两束兴,从而使二者发生干涉.,（五）微分干涉显微镜 （differential-interference microscope） 以平面偏振光为光源, 偏振光经棱镜合成后，使样品中厚度上的微小区别转化成明暗区别，增加了样品反差且具有立体感。适于研究活细胞中的颗粒及细胞器的运动。,原理,原理：,用途：观察未经染色的玻片标本,微分干涉差显微镜 Differential interference contrast microscope （DIC）,1952年Nomarski发明，利用两组平面偏振光的干涉，加强影像的明暗效果，能显示结构的三维立体投影。标本可略厚一点，折射率差别更大，故影像的立体感更强。,b) phase-contrast,A comparison of yeast cells that were growing on the vaginal epithelium seen with different types of LM.,a) under bright-field,c) DIC,（六）倒置显微镜 inverse microscope,物镜与照明系统颠倒；用于观察培养的活细胞，通常具有相差或DIC物镜，有的还具有荧光装置。,显微操作技术 micromanipulation technique,是在倒置显微镜下利用显微操作器进行细胞或早期胚胎操作的一种方法。 包括细胞核移植、显微注射、嵌合体技术、胚胎移植以及显微切割等。 细胞核移植技术已有几十年的历史，1952 年，Briggs和King等将不同阶段的蛙胚细胞核注入去核的蛙卵，构建核移植胚。Gordon（1962）证明原肠胚以后的细胞核移植能发育到成体。1997年，Wilmut等克隆了绵羊Dolly。,显微操作仪,转基因显微操作过程,当代显微镜的发展趋势,采用组合方式，集普通光镜、相差、荧光、暗视野、DIC、摄影装置于一体。 自动化与电子化。,（七）录像增差显微镜技术（video-enhance microscopy）,计算机辅助的DIC显微镜可在高分辨率下研究活 细胞中的颗粒及细胞器的运动,(八) 荧光共振能量转移技术 (Fluorescence resonance energy transfer, FRET),FRET技术是检测活体中生物大分子纳米级距离和纳米级距离变化的有力工具，可用于检测某一细胞中两个蛋白质分子是否存在直接的相互作用，或相互作用的强弱。,原理：选择供体蛋白CFP和受体蛋白YFP分别与两种目的蛋白融合表达。当两个融合蛋白的距离在5-10nm的范围内，则供体CFP发出的荧光可以被YFP所吸收，并激发YFP发出黄色荧光，此时可通过测量CFP荧光强度的损失来确定这两个蛋白是否发生相互作用。两个蛋白距离越近，CFP所发出的荧光被YFP接收的量就越多，检测器所接收到的荧光就越少。反之就不会产生FRET效应。,(九) 荧光漂白恢复技术 (Fluorescence recovery after photobleaching,FRAP),FRAP 起源于20世纪70年代，使用与蛋白质或脂质耦联的亲脂性或亲水性的荧光分子，如荧光素，绿色荧光蛋白等，检测活体细胞表面或细胞内部的分子运动以及在各种结构上分子动态变化率的大小。,荧光素标记膜蛋白或膜脂 2. 激光照射细胞表面某一区域，使被照射区的荧光淬灭变暗（光漂白） 3. 恢复,原理：,应用： FRAP不仅给出蛋白质运动的定性结果，更重要的是还给出了定量的信息，如扩散常数和蛋白移动率等。它可用于解决活细胞内包括蛋白定位、动力学以及与其他成分相互作用等一系列问题。,二、Electro microscopy,电子显微镜的基本知识 主要电镜制样技术 扫描电镜,电子显微镜技术,1933年第一台电子显微镜在德国诞生, 利用电镜可以观察到病毒的形态结构、细胞器的微细结构、许多生物大分子、单个重金属原子。目前的电镜已由单纯的形态描述进入了成分分析、定性和定量分析。此外，将电镜与计算机连用，对图象进行信息处理也取得了很大进展。总之，电镜已成为研究生物学的有力工具，必将发挥越来越大的作用。,（一）电子显微镜的基本知识,1. 电镜与光镜的比较,2. 电镜与光镜光路图比较,电子显微镜的基本构造,3.电子显微镜的基本构造,电镜设计原理及分类,一、设计原理 1、 选择波长短的“光源”电子束； 2 、电磁透镜代替玻璃透镜； 3、 高真空封闭系统和电子供电系统。 从R=0.61/N·A分析知，欲提高R，可能的途径是选择波长更短的光源。敏锐的科学家想到了电子波长。,电子波长（）主要与电子的运动速度（）和质量（m）有关： =h/m (h为普郎克常数) （1） 依能量定律1/2 m2=ev （e 电荷 v加速电压)（2) 从（2）式可得=2ev/m （3） 将（3）式代入（1）式得：=h/2emv （4） 式中h=6.62×10-27尔格； e =4.8×10-10绝对静电单位电量 m=9.1×10-28g （V为伏特）。将这些数字代入（4）式得： =12.25/V (埃) 即电子的波长与加速电压的平方根成反比，亦V越高，越短,电子束电压 波长 100V 1.23A 10000V 0.122A 1000000V 0.0387A,二、电镜的种类,当电子入射至样品时，有下列几种情形： 1 、其中一部分电子几乎不损失其能量，在样品表面被散射回来，这部分电子称背散射电子。 2 、如果样品非常薄，入射电子的一部分将会穿过样品而成为透射电子（TE）。 3 、其余电子的能量在样品内消耗而为样品所吸收，称为吸收电子。,4 、入射电子将样品中的表面电子打出样品表面，产生出能量很小的所谓二次电子（SE），其中也包括由于俄歇效应而产生的具有特征能量的一种二次电子俄歇电子（样品内深层电子打出）。,俄歇电子：样品原子中的内层电子被入射电子束激发而电离后流下空穴，此时高能级上的电子必然要向低能级跃迁以填补空穴，电子从高能级向低能级跃迁时势必释放能量，这种多余的能量可以以辐射形式释放（即产生特征X射线），也可以使另一外层电子从样品表面逸出，以这种方式逸出的二次电子叫俄歇电子。,如果利用电子穿透样品成象而设计成电镜，则为透射式电子显微镜，反映样品内部的状况。 如果利用二次电子成象设计成的电镜，则为扫描式电镜，反映样品的表面立体形貌。另有隧道式扫描电镜，透射扫描电镜和超高压透射扫描电镜，作为特殊观察用。,透射式电子显微镜的基本结构,一般电镜由电子光学系统、真空系统和供电系统三大部分组成。 1 、电源电器控制系统（电子供电系统） 主要是发射电子束和稳定电压，可分为六部分： （1）安全系统：受各种传感器信号控制； （2）总调压变压器； （3）真空电源系统； （4）透镜电源系统，大电流低电压； （5）高压电源系统，使电子加速的小电流高电 压； （6）辅助电源系统，包括快门开关、照相装置、爆光表、对中调节器和聚焦摆动器等。,2 镜筒部分（透镜系统，电子光学系统） 这是电镜的基本部分 ，可细分为照明系统、成象系统和观察记录系统。 （1）照明系统：电子枪和聚光镜组成。 电子枪是电镜的照明源，由此发射高速电子束。电子枪的钨丝阴极通过电流时白炽化射出电子，然后经阳极加速电压下成为高速电子，再通过聚光镜系统聚光于样品上。最后投向荧光屏而出现亮点。在栅极上加一电压，以控制电子束流的大小，从而改变荧光屏上的亮度。,（2）成像系统： 一般由物镜、中间镜及投影镜组成。物镜直接将样品放大，中间镜和投影镜进一步把物镜的像放大。 物镜、中间镜、投影镜均为电子透镜（磁透镜），它是沿一光轴呈旋转对称的电磁场，可使从轴上一点发出的电子，重新会聚在中心轴的另一点上。 磁透镜是由一只大的电磁圈组成，好像一个螺旋管，当电流通过时便可产生磁场，磁场对电子来说是折射介质。,（3）观察记录系统： 投影镜下面的观察室中装有萤光屏，显现出标本的电子显微像，便于观察。同时装有自动拍摄系统，以便把显示图像拍摄下来供观察分析。,3 真空系统 镜筒中的高速电子和气体分子间的相互作用，与气体分子间的相互作用一样，会使高速电子散射而偏离直线；此外，电子枪中存在气体会产生电离和放电，引起电子束的不稳定或闪烁，还会腐蚀灯丝；再者，真空可保护透镜和防止标本污染。所以，电子显微镜的真空度越高越好，一般采用10-4乇（tor）相当于10-7大气压。,扫描式电子显微镜,1940年，英国剑桥大学首先试制成功扫描电子显微镜。直到1965年，才有英国剑桥科学仪器有限公司生产出实用性强的商品扫描电镜。由于扫描电镜具有显著的优点，因此，几十年来，已广泛应用于生物学、医学、古生物学、地质学、化学、物理学、电子学以及勘察、冶金，机械与轻工业等领域，成为十分有用的研究工具。,Scanning electron microscope（ SEM）,20世纪60年代问世，用来观察标本表面结构。 分辨力为610nm，由于人眼的分辨力（区别荧光屏上距离最近两个光点的能力）为0.2mm，扫描电镜的有效放大倍率为0.2mm/10nm=20000X。,与透射电镜相比，扫描电镜具有下列特点： 1、景深大，图像富有立体感； 2、图像的放大范围大，分辨率也较高。（光镜1000倍左右，透射电镜几百倍到一百万倍，扫描电镜十几倍到几十万倍，分辩率介于光镜与透射镜之间（6030A）； 3、样品制备简单； 4、观察样品的尺寸可大至120×80×50mm，而透射电镜只有23mm；,5、样品可在样品室中作三度空间的平移和旋转； 6、电子束对样品的损伤与污染程度很少； 7、在观察形貌的同时，还可以利用从样品发出的其它信号作微区成分分析或进行晶体学分析。,一、扫描电镜的基本结构,1、 电子学系统：产生扫描电子束，包括： 电子枪: 由阴极、栅极、阳极组成，钨丝做成发叉式，发出直径为30m的电子束斑。 电磁透镜: 不起放大作用，只起缩小电子束斑直径的作用，将来自电子枪的30m的电子束斑，经过第一、二聚光镜及物镜的缩小作用，形成一直径为几十埃的扫描电子束，即扫描电子探针。 2、扫描系统 ：其作用是使电子束作光栅状扫描。 3、 电子信号的收集、处理和显示系统。,（1）信号种类：在样品室中，扫描电子束与样品发生相互作用后产生出多种信号，各种信号为特定的检测系统检测后，可形成不同的图像并用于不同的目的。主要有二次电子、背反射电子、X射线、吸收电子、俄歇电子等。 1）二次电子：指被入射电子所激发出来的样品原子中的外层电子，它产生于样品表面以下几十埃到几百埃的区域，其产率主要取决于样品的形貌和成分。是研究样品表面形貌的最有用的电子信号。,2）背反射电子：是入射电子在样品中受到原子核的卢瑟福散射后被大角度散射（反射）回来的电子，它产生于样品内部约1000埃的深度，它所形成的图像的衬度主要取决于样品中的原子序数。利用背散射电子的衍射图像可研究样品的晶体学特征。,3）X射线：广义指波长在10-5埃100埃（波长在0.1埃1埃的称硬X射线，波长在1埃10埃的称软X射线），是样品原子中的内层电子被入射电子电离后所发出的一种光，产生于5000埃左右的样品深部区域，不同的元素可以发出不同的特征X射线，据此可对样品进行成分分析。,4）俄歇电子：样品原子中的内层电子被入射电子束激发而电离后流下空穴，此时高能级上的电子必然要向低能级跃迁以填补空穴，电子从高能级向低能级跃迁时势必释放能量，这种多余的能量可以以辐射形式释放（即产生特征X射线），也可以使另一外层电子从样品表面逸出，以这种方式逸出的二次电子叫俄歇电子。,（2）信号收集与处理 以上各种信号分别被特定的检测器所检测。使信号电子转变成光信号，在光电倍增管中，光信号被转变成电信号，再经前置放大及视频放大，电流信号转变成电压信号，最后被送至显像管的栅极。 信号电子（检测器）光信号（光电倍增管）电信号电压信号显像管。,（3）信号显示与记录 电压信号送到显象管栅极上，调制显象管的亮度。显象管中的电子束在荧光屏上也作光栅状扫描，并且这种扫描运动与样品表面的电子束的扫描运动严格同步，这样既获得衬度与所接收信号强度相对应的电子象，反映出样品表面的形貌或成分的特征。 （4）真空系统 （5）样品室与台,扫描电镜工作原理：,工作原理：是用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面激发出次级电子，次级电子的多少与样品表面结构有关，次级电子由探测器收集，信号经放大用来调制荧光屏上电子束的强度，显示出与电子束同步的扫描图像。 为了使标本表面发射出次级电子，标本在固定、脱水后，要喷涂上一层重金属膜，重金属在电子束的轰击下发出次级电子信号。,SEM- Light Pathway,人类精子,人类红细胞,酵母,扫描遂道显微镜,Scanning Probe Microscope, SPM (20世纪80年代发展起来的检测样品微观结构的仪器) 包括：STM、AFM、磁力显微镜、摩擦力显微镜等 原理：根据隧道效应设计，当原子尺度的针尖在不到一个纳米的高度上扫描样品时，此处电子云重叠，外加一电压（2mV2V），针尖与样品之间形成隧道电流。电流强度与针尖和样品间的距离有函数关系，将扫描过程中电流的变化转换为图像，即可显示出原子水平的凹凸形态。,分辨率：横向为0.10.2nm，纵向可达0.001nm。 用途：三态（固态、液态和气态）物质均可进行观察。,扫描隧道显微镜原理,STM image of a DNA molecule,Schematic drawing of AFM,（二）主要电镜制样技术,1、超薄切片技术： 超薄切片：用于电镜观察的标本须制成厚度仅50nm的超薄切片，用超薄切片机（ultramicrotome）制作。 通常以锇酸和戊二醛固定样品，丙酮逐级脱水，环氧树脂包埋，以热膨胀或螺旋推进的方式切片，重金属（铀、铅）盐染色。,用于电镜观察的样本制备示意图,2、负染技术,用重金属盐(如磷钨酸) 染色；吸去染料干燥后，样品凹陷处铺了一层重金属盐，而凸出的地方没有染料沉积，从而出现负染效果，分辨力可达1.5nm左右。,Negative Stained Archaebacteria,特点：染色背景，衬托出样品的精细结构,3、冰冻蚀刻技术（Freeze etching）,冰冻蚀刻 : 亦称冰冻断裂。标本置于干冰或液氮中冰冻。然后断开，升温后，冰升华，暴露断面结构。向断面喷涂一层蒸汽碳和铂。然后将组织溶掉，把碳和铂的膜剥下来，此膜即为复膜（replica）.,冰冻断裂与蚀刻复型： 主要用来观察膜断裂面的蛋白质颗粒和膜表面结构。,快速冷冻深度蚀刻技术（quick freeze deep etching）,培养细胞内面的深度蚀刻电镜照片，示 Clathrin衣被,断面的三种处理方法： 蚀刻（ etching ）、不蚀刻（no etching ）、深度蚀刻（deep etching ）,an onion root tip cell with no etching.,电镜三维重构技术,电子显微术、电子衍射与计算机图象处理相结合而形成的具有重要应用前景的一门新技术。 电镜三维重构技术与X-射线晶体衍射技术及核磁共振分析技术相结合，是当前结构生物学（Structural Biology）主要研究生物大分子空间结构及其相互关系的主要实验手段。,第二节 细胞组分的分析方法,一、离心分离技术：用于分离细胞器与生物大分子及其复合物。 离心技术是分离细胞器及各种大分子基本手段。转速为1025kr/min的离心机称为高速离心机。转25kr/min，离心力89K者称为超速离心机。,超速离心机的最高转速可达10,0000r/min，离心力超过500Kg。根据分离对象和目的不同，采用不同的离心方法-制备离心和分析离心。制备离心又可分为差速离心和密度梯度离心两种类型。,差速离心 Differential centrifugation,特点： 介质密度均一； 速度由低向高，逐级离心。 用途：分离大小相差悬殊的细胞和细胞器。 沉降顺序：核、线粒体、溶酶体与过氧化物酶体、内质网与高基体、核蛋白体。 可将细胞器初步分离，常需进一步通过密度梯离心再行分离纯化。,Differential centrifugation,密度梯度离心,用介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过离心力场的作用使细胞和细胞成分分层、分离。 类型：速度沉降、等密度沉降。 常用介质：氯化铯、蔗糖、多聚蔗糖。 分离活细胞的介质要求： 1）能产生密度梯度，且密度高时，粘度不高； 2）PH中性或易调为中性； 3）浓度大时渗透压不大； 4）对细胞无毒。,速度沉降 velocity sedimentation,用途：分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器。 特点：介质密度较低，介质的最大密度应小于被分离生物颗粒的最小密度。 原理：介质密度梯度平缓，分离物按各自的沉降系数以不同的速度沉降而达到分离。,等密度沉降 isopycnic sedimentation,用途：分离密度不等的颗粒。 特点： 介质密度高，陡度大，介质最高密度大于被分离组分的最大密度。 力场比速率沉降法大10100倍，需要高速或超速离心。 原理：样品各成分在连续梯度的介质中经过一定时间的离心则沉降到与自身密度相等的介质处，并停留在那里达到平衡，从而将不同密度的成分分离。,Velocity (A) and Equilibrium (B) sedimentation,（二）分析离心（analytical centrifuge）,分析和测定制剂中纯的大分子的种类和性质，如浮力密度和分子量、生物大分子的构象变化、分析样品的纯度等。此工作必须是在制备离心的基础上进行。,分析离心技术又可分为：,（1）细胞的选择性抽提（分离蛋白质、核酸大分子） （2）柱层析的技术（分析蛋白质和核酸） （3）电泳技术 （4）色谱分析技术（色谱学分离纯化样品） （5）氨基酸分析技术,二、 细胞内核酸、蛋白质、酶、糖与脂类等 的显示方法,原理：利用一些显色剂与所检测物质中一些特殊基团特异性结合的特征，通过显色剂在细胞中的定位及颜色的深浅来判断某种物质在细胞中的分布和含量。 如：核酸 - 福尔根反应；蛋白质 - 氮汞试剂，氢氧化重氮；多糖- PAS反应（高碘酸 六亚甲四胺银法）；脂质 - 四氧化鋨、苏丹黑、苏丹 。,组织化学和细胞化学染色方法用于对某些细胞成分进行定性和定位研究。 （一）固定 物理固定：血膜空气快速干燥、冷冻干燥。 化学固定：如甲醇、乙醇、丙酮、甲醛、戊二醛和锇酸等试剂。显示多糖常用乙醇固定，显示酶类多用甲醛丙酮缓冲液固定。,（二）显示方法,1、金属沉淀法：如磷酸酶分解磷酸酯底物后，反应产物最终生成CoS或PbS有色沉淀，而显示出酶活性。 2、Schiff（希夫）反应：醛基可使Schiff试剂中的无色品红变为红色。用于显示糖和脱氧核糖核酸（Feulgen反应）。 3、联苯胺反应：过氧化酶分解H202。产生新生氧，后者再将无色联苯胺氧化成联苯胺蓝，进而变成棕色化合物。 4、脂溶染色法：借苏丹染料溶于脂类而使脂类显色。 5、茚三酮反应：显示蛋白质。,三、特异蛋白抗原的定位与定性 （免疫细胞化学法）,免疫荧光技术 蛋白电泳(SDS-PAGE)与 免疫印迹反应(Western-Blot) 免疫电镜技术,原理：此项技术是将免疫学中抗原、抗体以及补体间专一性反应结合显微或亚显微组织学的一些研究方法的统称。是免疫学原理与光镜或电镜技术的结合。,1、免疫荧光技术：快速、灵敏、有特异性，但其分辨率有限。,1）免疫细胞化学 (immunocytochemistry)是利用抗体同特定抗原专一结合的原理，对抗原进行定位测定的技术。常用的标记物有荧光素和酶。 2）免疫荧光法（immunofluorescent technique）：如异硫氰酸荧光素、罗丹明等。,2、免疫电镜技术,免疫铁蛋白技术 免疫酶标技术 免疫胶体金技术 应用：通过对分泌蛋白的定位，可以确定某种蛋白的分泌动态；胞内酶的研究；膜蛋白的定位与骨架蛋白的定位等,酶标免疫法（enzyme-labeled antibody method）：如辣根过氧化物酶。,免疫胶体金技术,四、细胞内特异核酸序列的定位与定性,（一）DNA序列测定技术 （二）核酸分子杂交技术（molecular gbridization technique） 1、概念 两条具有互补核酸顺序的单链核酸分子片断，在适当的实验条件下，通过氢键结合，形成DNA-DNA、DNA-RNA或RNA-RNA双链分子的过程。,Southern杂交与Northern杂交,Southern杂交是体外分析特异DNA序列的方法，操作时先用限制性内切酶将核DNA或线粒体DNA切成DNA片段，经凝胶电泳分离后，转移到醋酸纤维薄膜上，再用探针杂交，通过放射自显影，即可辨认出与探针互补的特殊核苷序列。 将RNA转移到薄膜上，用探针杂交，则称为Northern杂交。,2、主要技术,1）印迹杂交 (blot hybridization)：用已知的带有标记的特定核酸分子（或抗体、蛋白质分子）作为探针，与通过印迹被转移的核酸分子（或抗原、蛋白质分子）片段杂交的过程。 （1） Southern blotting （DNA印迹法）：将分离的DNA片段通过毛细管作用转移到硝基纤维素膜上，用DNA探针与之杂交的过程。是以发明此项技术的人名命名的。是体外分析特异DNA序列的方法。,（2） RNA印迹术（Northern blotting） （3） 蛋白质印迹术（Western blotting） （4） Eastern blotting（Western blotting的变形）： 当用凝胶进行抗原抗体反应，再进行印迹的方法。 （5） DNA与蛋白质的体外吸附技术（South-western blotting）： 结合了Western印迹与southern印迹两种实验方法的特点而设计的一种检测序列特异性DNA结合蛋白的实验方法。,（6） 原位杂交（In situ hybridization）： 用已知的带有标记的特定核酸分子作为探针，来测定与之成互补关系的染色体DNA区段的位置。 A、光镜水平的原位杂交技术 （同位素标记或荧光素标记的探针） B、电镜水平的原位杂交技术 （生物素标记的探针与抗生物素抗体相连的胶体金标记结合）,人类染色体端粒DNA的荧光原位杂交照片,2）PCR 技术,PCR即：polymerase chain reaction。 反应体系： 样品DNA； 引物（primer），约15-20个核苷酸； 4种dNTP；, Tag DNA聚合酶，来自于嗜热水生菌Thermus aquaticus，最适作用温度7580，短时间在95下不失活。 缓冲体系和Mg2+。,反应过程： 变性：约90-95； 复性：约60左右； 延伸：70-75； 重复 “变性复性延伸” 过程20-30次循环。,PCR原理,五、放射自显影技术,这是一种利用放射性同位素作为标记物对细胞化学物质进行超显微结构的定位、定性或定量的实验技术。 原理：利用同位素的放射自显影，对细胞内生物大分子进行定性、定位与半定量研究。即将放射性同位素标记的化合物导入生物体内，经过一段时间后，制取切片，涂上卤化银乳胶，经放射性曝光，使乳胶感光。,一般用14C和3H标记。常用3H-TDR来显示DNA，用3H-UDR显示RNA；用3H氨基酸研究蛋白质，用3H甘露糖、3H岩藻糖研究多糖。 14C半衰期为5730年，3H为12.5年。,用途: 用于研究标记化合物在机体、组织和细胞中的分布、定位、排出以及合成、更新、作用机理、作用部位等等。 步骤： 前体物掺入细胞（标记：持续标记和脉冲标记） 放射自显影,六定量细胞化学分析技术,细胞显微分光光度术（Microspectrophotometry） 利用细胞内某些物质对特异光谱的吸收，测定这些物质（如核酸与蛋白质等）在细胞内的含量。 包括： 紫外光显微分光光度测定法 可见光显微分光光度测定法,流式细胞仪（Flow Cytometry） 对单个细胞进行快速定量分析与分选的一门技术。,主要应用： （1）用于定量测定细胞中的DNA、RNA或某一特异蛋白的含量； （2）测定细胞群体中不同时相细胞的数量； （3）从细胞群体中分离某些特异染色的细胞； （4）分离DNA含量不同的中期染色体。,流式细胞术,原理：包在鞘液中的细胞通过高频振荡控制的喷嘴，形成包含单个细胞的液滴，在激光束的照射下，这些细胞发出散射光和荧光，经探测器检测，转换为电信号，送入计算机处理，输出统计结果，并可根据这些性质分选出高纯度的细胞亚群，分离纯度可达99%。包被细胞的液流称为鞘液，所用仪器称为流式细胞计（flow cytometer）。,流式细胞术工作原理,细胞生理学技术,膜电位检测技术 膜片钳位记录技术 细胞电泳技术,膜电位检测技术,原理: 细胞的质膜内外两侧由于阳离子浓度不同而形成了浓度梯度差, 通常是外高内低, 从而在质膜两侧造成一定的电位差, 这一电位差即膜 电位(membrane potential). 膜电位范围在 -20-100mV之间，用负值是表示，膜内与膜外相比为负。 膜内外阳离子浓度差是由于膜的主动和被动运输造成的，故膜通透性的改变可引起膜电位的变化。,膜电位的变化反应了细胞的生理变化，测定膜电位的数值可作为细胞生理状态的一个指标。在神经传导和肌肉收缩运动中膜电位的变化起着极其重要的作用。 膜电位的测定方法：微电极法,微电极是由用玻璃毛细管拉制成的细管和管腔中插入一条金属丝组合而成。微电极管内充有电解质溶液，通常为KCl水溶液；插入的电极是一条镀有氯化银的银丝。用于插入细胞中的微电极的直径不超过1µm。微电极通过导线与示波器或大电位计相连。,测量时使用一对微电极，一个插入细胞内，另一个置于细胞外的介质中，这样即可显示或记录膜电位的变化。例如利用这利方法可测得神经细胞的静息电位和动作电位。 微电极端技术也可用于测量细胞内局部的某种离子浓度，进行这种测量时两个微电极端都要插入细胞内。,膜片钳位记录技术（patch-clamp recording） -指将膜片两侧的电位固定为一定数值,原理：离子是通过膜上的由通道蛋白构成的亲水小孔（离子通道貌岸然）进出细胞。用内径约为1µm的玻璃管电极将细胞质膜紧紧吸住，或拉下来，以测定进入管内的离子的种类和数量，从而表明离子通道的性质和功能。,单个离子通道的直径约为0.50.6nm，膜电位的变化可引起离子通道的开启或关闭，膜片钳技术能检测出变种变化。 该项技术是由德国马普研究院的Neher和Sakmann于1976年研制成功的，他们也因此项发明而获得1991年诺贝尔奖。,有些疾病与离子通道失常有关，例如胆囊炎（氯离子通道）、癫痫（钠离子和钾离子通道）、心血管病（钙离子通道）和神经失常（钙离子通道）。因此，膜片制导技术对许多因离子通道失常而引起的疾病的诊断和治疗有着重要的应用价值。现在已根据该技术的理论和技术研制出了许多有效的药物。,细胞电泳,原理：在一定PH值下细胞表面带有净的正或负电荷，能在外加电场的作用下发生泳动。 各种细胞或处于不同生理状态的同种细胞荷电量有所不同，故在一定的电场中的泳动速度不同 。 用途：检测细胞生理状态、分离不同种类的细胞。,第三节 细胞培养、细胞工程 与显微操作技术,细胞培养 细胞工程,一、细胞培养,细胞培养是当今细胞生物学乃至整个生命科学研究与生物工程中最基本的实验技术。细胞培养包括原核生物细胞（如细菌）、真核单细胞（如酵母、四膜虫等）、植物细胞与动物细胞的培养以及与此密切相关的病毒的培养。,几个基本概念：,1、器官培养（organ culture） 指器官的胚芽、整个器官在体外条件下的保存或生长，此时亦能有器官的分化并保持器官的立体结构和功能.,2、 组织培养（tissue culture） 指组织在体外条件下的保存或生长，此时可能有组织分化并保持组织的结构与功能。培养物是组织碎块或器官的一部分.,3、细胞培养（cell culture） 指细胞在体外条件下的生长，在细胞培养的过程中，细胞不再形成组织。培养物是单个细胞或细胞群. in vivo 在体、活体、生物体内 in vitro 离体、生物体外,（一）动物细胞培养,群体培养（mass culture）：将含有一定数量细胞的悬液置于培养瓶中，让细胞贴壁生长，汇合（confluence）后形成均匀的单细胞层； 克隆培养（clonal culture）：培养高度稀释的细胞悬液，细胞贴壁生长，每一个细胞形成一个细胞集落，称为克隆。,群体培养（左）和 克隆培养（右）,类型：原代培养细胞（primary culture ce