细胞生理20084.ppt
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1、第三章 细胞生物学研究方法,细胞形态结构的观察方法 细胞组分的分析方法 细胞培养、细胞工程与显微操作技术 用于细胞生物学研究的模式生物,第一节 细胞形态结构的观察方法,光学显微镜技术( Light microscopy ) 电子显微镜技术 ( Electro microscopy ) 扫描遂道显微镜 (Scanning tunnel microscope , STM),一、Light microscopy,普通复式光学显微镜技术 荧光显微镜技术 (Fluorescence Microscopy) 暗视野显微镜技术,激光共焦扫描显微镜技术 (Laser Confocal Microscopy)
2、紫外线显微镜技术,相差显微镜 (phase-contrast microscope) 微分干涉显微镜 (differential interference contrast microscope, DIC) 录像增差显微镜技术 (video-enhance microscopy),(一)普通复式光学显微镜技术,普通光学显微镜,1. 构成: 照明系统; 光学放大系统; 机械装置 2. 原理:经物镜形成倒立实像,经目镜放大成虚像。,石蜡切片的基本流程,材料固定(F.A.A固定液) 逐级脱水(不同浓度的酒精) 二甲苯透明透蜡纯蜡包埋材料修块切片二甲苯脱蜡染色逐级脱水(不同浓度的酒精) 封片永久切片,
3、光镜样本制作,影响显微镜成像清晰度最关键的因素是显微镜的分辨率 , 分辨率 是指显微镜能将近邻的两个质点分辨清楚的能力, 分辨率的大小决定于光波的波长和镜口率, 通常是用相邻两点间的距离来表示.,光学显微镜的分辨率( D=0.61/NA),其中为入射光线波长;可见光波长400700nm, 计算时取其平均值为550nm. NA为镜口率 sin/2, n=物镜与标本间介质折射率; =镜口角(聚光器交点对物镜镜口的张角),镜口角总是要小于180o, 所以sin/2的最大值必然小于1.,几种介质的折射率,介质折射率越接近镜头玻璃的(1.7)越好。油镜头用香柏油为介质,镜口率可接近1.5,如用溴萘,镜口
4、率可达1.6,根据计算, 显微镜最小数值不会小于0.2m, 即分辨率约为0.2m (人眼的分辨力为0.2mm),因此显微镜的最大有效倍数为10001500。,0.2m这一数值是光学显微镜分辨率的极限. 限制显微镜分辨率的关键因素是光的波长(光的衍射效应), 光学显微镜无论制作得如何精密, 都无法突破是一极限.,紫外显微镜,原理: 光源光波越短,显微镜的分辨本领越大. 波长介于400nm与X射线之间的辐射称为紫外线或紫外光. 特点: 紫外线为光源, 分辨率可提高一倍, 用特殊材料(如石英等)制成的光学玻璃来制作显微镜透镜.常配有照相装置. 用途: 观察胶体颗粒,测定细胞核中有核酸含量. 不足:
5、价格比较昂贵,使用受限.,(二)荧光显微镜技术(Fluorescence Microscopy),荧光显微镜 Fluorescence microscope,荧光显微镜成像原理,荧光显微镜成像原理,荧光显微镜特点:,光源为短波光;有两个特殊的滤光片(激发光滤片和阻断滤片);照明方式通常为落射式。 激发光滤片: 光源和样品之间, 只让能激发荧光染料发光的特定波长的光通过. 阻断滤片: 物镜和目镜之间, 只让染料所发出的荧光通过.,荧光显微镜可以观察细胞内天然物质(自发荧光)或经短波光照射后发出荧光的物质(诱发荧光), 如叶绿体中的叶绿素能发出血红色荧光。也可观察诱发荧光物质,如用丫啶橙染色后,细
6、胞中RNA发红色荧光,DNA发出绿色荧光,根据发光部位,可以定位研究某些物质在细胞内的变化情况。,应用: 直接荧光标记技术 间接免疫荧光标记技术 在光镜水平用于特异蛋白质等生物大分子的定性定位:如绿色荧光蛋白(GFP)的应用。,直接荧光标记技术,用于观察能激发出荧光的结构。用途:免疫荧光观察、基因定位、疾病诊断。,Fluorescence image, DNA in blue and Microtubules in green,暗视野显微镜,使照明光线不直接进入物镜。只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜,因而视野的背景是黑的,物体的边缘是亮的。 利用这种显微镜能见到小至的质点,分辨率比普通显微
7、镜高了40倍,有些细胞器,如核、线粒体,均清晰可见。,(三)激光扫描共焦显微镜技术(LSCM) (Laser Scanning Confocal Microscopy),原理:,激光共聚焦扫描显微镜光路图,特点:,在某一瞬间只用很小一束光照明,这一束光通过检测器前的一个小孔后只让来自该焦平面的光成像. 物镜和聚光镜同时聚焦到同一点.即它们互相共焦点.,用激光作光源,逐点、逐行、逐面快速扫描。 能显示细胞样品的立体结构。 分辨率是普通光学显微镜的3倍, 是荧光显微镜的1.4-1.7倍。像异常清晰. 用途类似荧光显微镜,样品一般须经免疫荧光标记, 但能扫描不同层次,形成立体图像。,应用: 由于它能
8、排除焦平面以外光的干扰,增强图像反差和提高分辨率,可重构样品的三维结构。在亚细胞结构与组分的定位及动态变化等的研究中应用广泛.,LCSM Image of a Xenopus Melanophore microtubule cytoskeleton (green) and the nucleus (blue) http:/www.itg.uiuc.edu,非洲爪蟾黑色素细胞,(四)相差显微镜 (phase-contrast microscope) 原理: 将透过标本的可见光的光程差或相位差转换成振幅差,从而提高了各种结构间的对比度,使各种结构变得清晰可见。 用途: 可用于观察活细胞,研究细胞核
9、、线粒体等细胞器的动态.,相差显微镜特点,在构造上,相差显微镜有不同于普通光学显微镜两个特殊之处。 1. 环形光阑(annular diaphragm):位于光源与聚光器之间。 2. 相位板(annular phaseplate):物镜中加了涂有氟化镁的相位板,可将直射光或衍射光的相位推迟1/4。,(五)微分干涉显微镜(DIC显微镜) (differential-interference microscope),DIC利用的是偏振光 增加了四个光学组件: 偏振器, DIC棱镜(石英Wollaston棱镜), DIC滑行器(第二个Wollaston棱镜), 检偏器. 偏振器: 在聚光系统前, 使
10、光线发生线性偏振. DIC棱镜: 将一束光分解成偏振方向不同的两束光, 二者成一小夹角.,DIC滑行器: 物镜后的焦平面处, 把两束通过样品发生了光程差的光波合并成一束(两束光的偏振面仍然存在) 检偏器: 第二个偏振装置, 在光束形成目镜DIC影像之前, 检偏器与偏光器的方向成垂直角. 检偏器将两束直的光波组合成具有相同偏振面的两束兴,从而使二者发生干涉.,(五)微分干涉显微镜 (differential-interference microscope) 以平面偏振光为光源, 偏振光经棱镜合成后,使样品中厚度上的微小区别转化成明暗区别,增加了样品反差且具有立体感。适于研究活细胞中的颗粒及细胞器
11、的运动。,原理,原理:,用途:观察未经染色的玻片标本,微分干涉差显微镜 Differential interference contrast microscope (DIC),1952年Nomarski发明,利用两组平面偏振光的干涉,加强影像的明暗效果,能显示结构的三维立体投影。标本可略厚一点,折射率差别更大,故影像的立体感更强。,b) phase-contrast,A comparison of yeast cells that were growing on the vaginal epithelium seen with different types of LM.,a) under b
12、right-field,c) DIC,(六)倒置显微镜 inverse microscope,物镜与照明系统颠倒;用于观察培养的活细胞,通常具有相差或DIC物镜,有的还具有荧光装置。,显微操作技术 micromanipulation technique,是在倒置显微镜下利用显微操作器进行细胞或早期胚胎操作的一种方法。 包括细胞核移植、显微注射、嵌合体技术、胚胎移植以及显微切割等。 细胞核移植技术已有几十年的历史,1952 年,Briggs和King等将不同阶段的蛙胚细胞核注入去核的蛙卵,构建核移植胚。Gordon(1962)证明原肠胚以后的细胞核移植能发育到成体。1997年,Wilmut等克隆
13、了绵羊Dolly。,显微操作仪,转基因显微操作过程,当代显微镜的发展趋势,采用组合方式,集普通光镜、相差、荧光、暗视野、DIC、摄影装置于一体。 自动化与电子化。,(七)录像增差显微镜技术(video-enhance microscopy),计算机辅助的DIC显微镜可在高分辨率下研究活 细胞中的颗粒及细胞器的运动,(八) 荧光共振能量转移技术 (Fluorescence resonance energy transfer, FRET),FRET技术是检测活体中生物大分子纳米级距离和纳米级距离变化的有力工具,可用于检测某一细胞中两个蛋白质分子是否存在直接的相互作用,或相互作用的强弱。,原理:选择
14、供体蛋白CFP和受体蛋白YFP分别与两种目的蛋白融合表达。当两个融合蛋白的距离在5-10nm的范围内,则供体CFP发出的荧光可以被YFP所吸收,并激发YFP发出黄色荧光,此时可通过测量CFP荧光强度的损失来确定这两个蛋白是否发生相互作用。两个蛋白距离越近,CFP所发出的荧光被YFP接收的量就越多,检测器所接收到的荧光就越少。反之就不会产生FRET效应。,(九) 荧光漂白恢复技术 (Fluorescence recovery after photobleaching,FRAP),FRAP 起源于20世纪70年代,使用与蛋白质或脂质耦联的亲脂性或亲水性的荧光分子,如荧光素,绿色荧光蛋白等,检测活体
15、细胞表面或细胞内部的分子运动以及在各种结构上分子动态变化率的大小。,荧光素标记膜蛋白或膜脂 2. 激光照射细胞表面某一区域,使被照射区的荧光淬灭变暗(光漂白) 3. 恢复,原理:,应用: FRAP不仅给出蛋白质运动的定性结果,更重要的是还给出了定量的信息,如扩散常数和蛋白移动率等。它可用于解决活细胞内包括蛋白定位、动力学以及与其他成分相互作用等一系列问题。,二、Electro microscopy,电子显微镜的基本知识 主要电镜制样技术 扫描电镜,电子显微镜技术,1933年第一台电子显微镜在德国诞生, 利用电镜可以观察到病毒的形态结构、细胞器的微细结构、许多生物大分子、单个重金属原子。目前的电
16、镜已由单纯的形态描述进入了成分分析、定性和定量分析。此外,将电镜与计算机连用,对图象进行信息处理也取得了很大进展。总之,电镜已成为研究生物学的有力工具,必将发挥越来越大的作用。,(一)电子显微镜的基本知识,1. 电镜与光镜的比较,2. 电镜与光镜光路图比较,电子显微镜的基本构造,3.电子显微镜的基本构造,电镜设计原理及分类,一、设计原理 1、 选择波长短的“光源”电子束; 2 、电磁透镜代替玻璃透镜; 3、 高真空封闭系统和电子供电系统。 从R=0.61/NA分析知,欲提高R,可能的途径是选择波长更短的光源。敏锐的科学家想到了电子波长。,电子波长()主要与电子的运动速度()和质量(m)有关:
17、=h/m (h为普郎克常数) (1) 依能量定律1/2 m2=ev (e 电荷 v加速电压)(2) 从(2)式可得=2ev/m (3) 将(3)式代入(1)式得:=h/2emv (4) 式中h=6.6210-27尔格; e =4.810-10绝对静电单位电量 m=9.110-28g (V为伏特)。将这些数字代入(4)式得: =12.25/V (埃) 即电子的波长与加速电压的平方根成反比,亦V越高,越短,电子束电压 波长 100V 1.23A 10000V 0.122A 1000000V 0.0387A,二、电镜的种类,当电子入射至样品时,有下列几种情形: 1 、其中一部分电子几乎不损失其能量,
18、在样品表面被散射回来,这部分电子称背散射电子。 2 、如果样品非常薄,入射电子的一部分将会穿过样品而成为透射电子(TE)。 3 、其余电子的能量在样品内消耗而为样品所吸收,称为吸收电子。,4 、入射电子将样品中的表面电子打出样品表面,产生出能量很小的所谓二次电子(SE),其中也包括由于俄歇效应而产生的具有特征能量的一种二次电子俄歇电子(样品内深层电子打出)。,俄歇电子:样品原子中的内层电子被入射电子束激发而电离后流下空穴,此时高能级上的电子必然要向低能级跃迁以填补空穴,电子从高能级向低能级跃迁时势必释放能量,这种多余的能量可以以辐射形式释放(即产生特征X射线),也可以使另一外层电子从样品表面逸
19、出,以这种方式逸出的二次电子叫俄歇电子。,如果利用电子穿透样品成象而设计成电镜,则为透射式电子显微镜,反映样品内部的状况。 如果利用二次电子成象设计成的电镜,则为扫描式电镜,反映样品的表面立体形貌。另有隧道式扫描电镜,透射扫描电镜和超高压透射扫描电镜,作为特殊观察用。,透射式电子显微镜的基本结构,一般电镜由电子光学系统、真空系统和供电系统三大部分组成。 1 、电源电器控制系统(电子供电系统) 主要是发射电子束和稳定电压,可分为六部分: (1)安全系统:受各种传感器信号控制; (2)总调压变压器; (3)真空电源系统; (4)透镜电源系统,大电流低电压; (5)高压电源系统,使电子加速的小电流高
20、电 压; (6)辅助电源系统,包括快门开关、照相装置、爆光表、对中调节器和聚焦摆动器等。,2 镜筒部分(透镜系统,电子光学系统) 这是电镜的基本部分 ,可细分为照明系统、成象系统和观察记录系统。 (1)照明系统:电子枪和聚光镜组成。 电子枪是电镜的照明源,由此发射高速电子束。电子枪的钨丝阴极通过电流时白炽化射出电子,然后经阳极加速电压下成为高速电子,再通过聚光镜系统聚光于样品上。最后投向荧光屏而出现亮点。在栅极上加一电压,以控制电子束流的大小,从而改变荧光屏上的亮度。,(2)成像系统: 一般由物镜、中间镜及投影镜组成。物镜直接将样品放大,中间镜和投影镜进一步把物镜的像放大。 物镜、中间镜、投影
21、镜均为电子透镜(磁透镜),它是沿一光轴呈旋转对称的电磁场,可使从轴上一点发出的电子,重新会聚在中心轴的另一点上。 磁透镜是由一只大的电磁圈组成,好像一个螺旋管,当电流通过时便可产生磁场,磁场对电子来说是折射介质。,(3)观察记录系统: 投影镜下面的观察室中装有萤光屏,显现出标本的电子显微像,便于观察。同时装有自动拍摄系统,以便把显示图像拍摄下来供观察分析。,3 真空系统 镜筒中的高速电子和气体分子间的相互作用,与气体分子间的相互作用一样,会使高速电子散射而偏离直线;此外,电子枪中存在气体会产生电离和放电,引起电子束的不稳定或闪烁,还会腐蚀灯丝;再者,真空可保护透镜和防止标本污染。所以,电子显微
22、镜的真空度越高越好,一般采用10-4乇(tor)相当于10-7大气压。,扫描式电子显微镜,1940年,英国剑桥大学首先试制成功扫描电子显微镜。直到1965年,才有英国剑桥科学仪器有限公司生产出实用性强的商品扫描电镜。由于扫描电镜具有显著的优点,因此,几十年来,已广泛应用于生物学、医学、古生物学、地质学、化学、物理学、电子学以及勘察、冶金,机械与轻工业等领域,成为十分有用的研究工具。,Scanning electron microscope( SEM),20世纪60年代问世,用来观察标本表面结构。 分辨力为610nm,由于人眼的分辨力(区别荧光屏上距离最近两个光点的能力)为0.2mm,扫描电镜的
23、有效放大倍率为0.2mm/10nm=20000X。,与透射电镜相比,扫描电镜具有下列特点: 1、景深大,图像富有立体感; 2、图像的放大范围大,分辨率也较高。(光镜1000倍左右,透射电镜几百倍到一百万倍,扫描电镜十几倍到几十万倍,分辩率介于光镜与透射镜之间(6030A); 3、样品制备简单; 4、观察样品的尺寸可大至1208050mm,而透射电镜只有23mm;,5、样品可在样品室中作三度空间的平移和旋转; 6、电子束对样品的损伤与污染程度很少; 7、在观察形貌的同时,还可以利用从样品发出的其它信号作微区成分分析或进行晶体学分析。,一、扫描电镜的基本结构,1、 电子学系统:产生扫描电子束,包括
24、: 电子枪: 由阴极、栅极、阳极组成,钨丝做成发叉式,发出直径为30m的电子束斑。 电磁透镜: 不起放大作用,只起缩小电子束斑直径的作用,将来自电子枪的30m的电子束斑,经过第一、二聚光镜及物镜的缩小作用,形成一直径为几十埃的扫描电子束,即扫描电子探针。 2、扫描系统 :其作用是使电子束作光栅状扫描。 3、 电子信号的收集、处理和显示系统。,(1)信号种类:在样品室中,扫描电子束与样品发生相互作用后产生出多种信号,各种信号为特定的检测系统检测后,可形成不同的图像并用于不同的目的。主要有二次电子、背反射电子、X射线、吸收电子、俄歇电子等。 1)二次电子:指被入射电子所激发出来的样品原子中的外层电
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