γ干扰素加强TRAIL抑制人大肠癌细胞株作用的研究.pdf

3 6 5 文章编号 1 0 0 ) 一 4 7 1 8 ( 2 0 0 6 ) 0 2 一 0 3 6 5 一 0 3 Y 一干扰素加强 T R A I L抑制人大肠癌 细胞株作用的研究 何 超， 胡文献， 胡晓形， 黄学 锋 ( 浙江大学医学院附属邵逸夫医院肛肠外科， 浙江 杭州3 1 0 0 1 6 ) 摘要 目的: 探讨Y 一 干扰素( O N - ,Y ) 对肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体( T R A I L ) 抑制人大肠癌细胞株作 用的影响。 方法: 以大肠癌细胞株R K O 为对象， 采用N M， 比色法和流式细胞术研究IFS 一 Y 对T R A I L 抑制R K O 的影 响。 结果: I F N 一 Y 组、 T R A I L 组和I F N 一 ,1 7 2 h + T R A I L 组的存活分数分别为9 9 . 2 8 %, 8 5 . 4 5 %, 5 2 . 6 0 %o I F N 一 Y 组、 T R A I L 组、 I F N 一 y 2 4 h + T R A I L 组、 I F N 一 7 4 8 h 十 T R A I L 组和I F N 一 y 7 2 h + T R A I L 组的凋亡率分别为1 . 5 1 %, 2 . 3 8 %, 4 . 9 7 %, 1 3 . 3 0 %, 2 1 . 0 0 %. I F N 一 y 2 4 h + T R A I L 组的凋亡率高于I F N 一 Y 组与T R A I L 组的凋亡率之和( P 0 . 0 1 ) 。随 着I F N 一 Y 预处理时间的延长， T R A I L 引起 R K O的凋亡率也明显上升( P 0 . 0 1 ) 。 结论二 I F N 一 Y 能有效加强T R A I L 对 R K O 细胞株的凋亡诱导作用。 关键词 干扰素II 型; R K O 细胞株; 肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体 中图分类号 R 3 6 3 文献标识码l A I F N一y r e i n f o r c e s t h e i n h i b i t o r y e ff e c t o f t u m o r n e c r o s i s f a c t o r 一r e l a t e d a p o p t o s i s 一 i n d u c i n g l i g a n d o n a p o p t o s i s o f h u m a n c o l o n c a n c e r c e l l li n e R K O c e l l s H E C h a o ， H U We n 一 x i a n , H U Ma o 一 t o n g , H U A N G X u e 一 f e n g ( C l i n i c a l R e s e a r c h I n s t it u t e of S i r R u n R u n S h a w H o s p i ta l ， Z h ej ia n g U n i v e r s i ty , H a n g z h o ti 3 1 0 0 1 6 , C h i n a ) A B S T R A C T A I M: T o e x p l o re th e in fl u e n c e o f I F N 一 y o n t h e ro l e o f t u m o r n e c ro s is f a c to r 一 re l a t e d a p o p to s i “ 一 i n d u c in g l ig a n d ( T R A I L ) i n in d u c in g a p o p t o s is o f R K O c e ll l i n e . ME T H O D S : S u r v iv a l fr a c t i o n a n d a p o p t o s is w e re m e a s u r e d场N M m e t h o d a n d fl o w c y to m e t iy ( F A C S ) . R E S U L T S : S u r v iv a l f r a c t io n o f I F N 一 y g r o u p , T R A I L a n d IF N 一 y 7 2 h 十 T R A I L g ro u p w e re 9 9 . 2 8 %， 8 5 . 4 5 % T R A I L g ro u p , I F N ， 5 2 . 6 0 %，r e s p e c t i v e l y . T h e p e r c e n t a g e o f a p o p t o t i c c e l l s o f I F N一 y g r o 叩， T R A I L g ro u p , I F N一y 2 4 h 十 一y 4 8 h + s p e c t i v e l y . T h e p e r c e n t a g e o f T R A I L a n d I F N一 y 7 2 h + T R A I L g ro u p w e re 1 . 5 1 % a ， 2 . 3 8 %， 4 a p o p t o t i c c e ll s o f I F N 一 y 2 4 h + T R A I L g ro u p w a s h i g h e r t h a n t h e : T h e l o n g e r t h e I F N一 y p re t re a t e d， t h e h i g h e r t h e p e r c e n t a g e o f a p o p t o t i c . 9 7 %， 1 3 . 3 0 %， 2 1 . 0 0 %， re- m o f I M 一 y g r o u p a n d T R A I L e l l s w a s o b s e r v e d( P0 . 0 1 ) . I F N一yc a n rei n f o r c e t h e e ff e c t o f T R A I L I n t e r f e ro n t y p e I l ; R K O c e ll l i n e ; i n d u c i n g a p o p t o s i s i n R K O . T u m o r n e c r o s i s f a c t o r 一 re l a t e d a p o p t o s i s 一 i n d u c i n g l i g a n d 有研究发现， 部分肿瘤细胞对肿瘤坏死因子相 关 凋 亡 诱导配 体( t u m o r n e c ro s is f a c t o r 一 re la te d a p o p to - s i s 一 i n d u c in g l i g a n d , T R A I L ) 诱导的凋亡作用并不十 分敏 感 ， 这限 制了T R A I L 在抗肿瘤治疗中的 应用。 本实验以体外培养人大肠癌细胞株 R K O为研究对 象， 探讨y 一 干扰素( I F N - y ) 对 T R A I L 抑制 R K O细 胞株生长作用的影响。 材料和方法 1 材料 可溶性T R A I L 蛋白购自 美国P e p ro T e c h 公司。 重组人 I F N - -i 购自 上海克隆生物高技术有限公司。 M T T 试剂为 A m r e s c o 产品。A n n e x i n V一 P I 凋亡试剂 盒为I m m u n o t e c h 产品。自 动酶联检测仪为 B i o 一 R a d 产品。C 仇恒温孵箱为H e r a e u s 产品。 2 细胞培养 R I C O细胞株是一种低分化的结肠癌细胞株， 由 浙大医学院肿瘤所提供。以D M E M加 1 0 %胎牛血 收稿日 期 2 0 0 4 - 0 6 - 2 3 修回日 期 2 0 0 4 - 1 0 - 1 8 * 基金项目 浙江省自 然科学基金资助项目 ( N o . 3 0 2 6 7 8 ) T e l : 0 5 7 1 一8 5 5 2 7 1 8 8 ; E 一 m a i l : h w x 2 2 0 6 s o h u . c o m 4 3 . 0 3 %( 图1 ) ， 其量效关系曲线近似标准的“ S ” 形， 近似直线部分位于5 0 一1 0 0 0 W L o 2 0 0 K g / L的 T R A I L 作用于细胞， 细胞的存活分数随时间的延长而 减少， 从6 h 的9 9 . 2 4 % 下降到3 6 h 的7 5 . 1 0 %( 图2 ) 0 2 T R A I L对 R K O细胞株的凋亡诱导作用 对照组、 1 0 0 0 j Cg / L T R A I L 组、 2 0 0 0 W L T R A I L 组对 R K ( ) 的凋亡诱导率分别为 1 . 0 3 %, 2 . 3 8 %, 1 2 . 4 2 %. T R A I L组与对照组之间差异显著( P 0 . O 1 ) ; T R A I L 1 0 0 0 t t g / L 组与” R A I L 2 0 0 0 p 岁 L 组之 间差异显著( P 0 . 0 1 ) 。随着 T R A I L剂量的增加， R K O的凋亡率也上升。 nlj八认八UOCU八U ZnUO八642 罗uo一妇豁妇1.奋.W奋JnS 0 0 5 0 l O a 下2 0 0 5 0 0 1 0 0 0 2 0 0 0 T R AI L d o s e ( p g / L ) D o s e 一e ff e c t r e l a t i o n s h i p o f T R A I L o n R K O s u r v i v a l f r a c t i o n . n=6. T R A I L对 R K O细胞存活分数的量效关系 1吸1 Fis图 n曰心nUnU10n ZnOO孟U月峥， 勺勺且 罗uo1另JJ工司卜1奋n的 清、 1 x 1 0 5 U / L 青霉素、 1 0 0 m g / L 链霉素为培养液， 置3 7 , 5 %C 仇孵箱培养。 3 预实验确定T R A I L使用剂量 3 . 1 M I T 法检测 T R A I L对 R K ( 存活分数的影响 T R A I L 对 R K O存活分数的量效关系按 5 0 , 1 0 0 , 2 0 0 , 5 0 0 , 1 0 0 0 , 2 0 0 0 t g / L 分别给予T R A I L ， 对照组给予 同体积的P B S ， 药物作用1 8 h 后测值。T R A I L 对R K O 存活分数的时效关系按每孔” R A I L 2 0 0 “ 岁 L , 孵育 0 , 6 , 1 2 , 1 8 , 2 4 , 3 6 h 后测值， 每个时段均设对照。当 细胞至对数生长期时， 以0 . 2 5 %胰蛋白酶消化细胞， 吹打成单细胞悬液， 按3 x 1 0 3 c e l l s / w e l l 接种于%孔 板， 每孔终体积为2 0 0 ji L 。 培养2 4 h 后按上述分组 加人药物。测值前4h 每孔加人M T l ' 溶液( 5 g / L ) 2 0 匹， 继续孵育4 h ， 终止培养。 小心吸弃上清， 每孔 加人1 5 0 t t L D M S O ， 震荡1 0 m i n ， 选择5 7 0 n m波长， 在 自 动酶联检测仪上测定各孔吸光度值( A 了 。 存活分 数= 试验组A / 对照组Ax 1 0 0 %。 3 . 2 F A C S 检测 T R A I L对 R K O细胞的凋亡诱导作 用 设立对照组、 T R A I L 1 0 0 0扩 L 和2 0 0 0岁L 组， 共3 组。按 1 x 1 0 5 c e l l s / w e l l 接种于6 孔板， 培养2 d 后按组加药， 作用 2 4 h 后收集细胞。采用 a n n e x i n V 一 P I 凋亡试剂盒， F A C S 分析凋亡细胞百分率。碘化 丙陡( P I ) , a n n e x i n V均阴性以及 P I 阳性、 a n n e x i n V 阴性者为活细胞; P I 阴性、 a n n e x i n V阳性者为早期 凋亡细胞; P I , a n n e x i n V均阳性者为晚期凋亡细胞。 4 MT I 一 法检测 I F N - y 对 T R A M 抑制R K O细胞 株存活分数的影响 经过预实验确定， T R A I L 使用剂量为1 0 0 0 W L o 设立P B S 组， I F N 一 7 组， T R A I L 组， I F N 一 y 分别预处 理0 h , 2 4 h , 4 8 h , 7 2 h 后加人 T R A I L 组( 即 I F N一 y 0h + T R A I L 组、 I F N一 y2 4h + T R A I L 组、 I F N一y 4 8 h + T R A I L 组、 I F N一 y7 2h + T R A I L 组) ， 共 7 组。I F N 一 y 使用剂量为5 x 1 0 5 U / L o 5 F A G S 分析O N一 Y 对T R A II 诱导R K O细胞株 的凋亡作用的影响 按 1 x 1 0 5 c e l l s / w e ll 接种于6 孔板， 培养2 4 h 后 按前一步骤分组情况分别加人药物。作用2 4 h 后收 集细胞， 然后按 a n n e x i n V一 P I 法检测凋亡。 6 统计学处理 采 用S P S S 1 0 . 0 软 件 进 行x 2 检 验。 结果 2 4 3 6 T i me 一e ff e c t n二6. 6 1 2 1 8 T i m e ( h ) re l a t i o n s h i p o f T R A I L o n R KO s u r v i v a l fr a c t i o n . T R A M对R K O细胞存活分数的时效关系 22 Fis图 1 T R A I L对 R K O细胞株存活分数的影响 不同剂量的T R A I L 与R K O 孵育 1 8 It 后， 细胞存 活分数从 5 0 t g / L的8 9 . 5 6 %下降至2 0 0 0 W L的 3 I F N 一 7 增强T R A I L对R K O细胞株存活分数的 抑制作用 各组结果见表I 。采用W e b b 系数来判定两药之 间的相互作用 2 l 。预估效应C = A x B , A , B 指两药 单用时各自的存活分数。当两药合用时其实际存活 分数盛 7 0 %预估效应时， 两药有协同作用。结果表 明I F N 一 y 预处理7 2 h 后加人T R A I L 有协同作用。 4 I F N一 7 增强 T R A I L对 R K 细胞株的凋亡诱导 作用 本研究设P B S 组、 I F N一 y 组、 T R A I L 组、 I F N 一 y 0h + T R A I L 组、 I F N一y2 4h +T R A I L组、 I F N一-1 4 8 h 3 6 7 + T R A I L 组和I F N一 y 7 2 h + T R A I L 组， 共7 组， 这7 组的凋亡诱导率分别为 1 . 0 3 %, 1 . 5 1 %, 2 . 3 8 %, 2 . 2 6 % 、 4 . 9 7 %、 1 3 . 3 0 % 、 2 1 . 0 0 %。I F N一y2 4h+ T R A I L 组、 I F N一y 4 8 h + T R A I L组、 I F N一y7 2h+ T R A I L 组的凋亡率明显高于I F N一 y 组与一T R A I L 组之 和， 差异显著( P 0 . 0 1 ) . T I N一 y 0 h + T R A I L 组、 I F N一 y 2 4h + T R A I L 组、 I F N一1 4 8 h + T R A I L 组、 I F N 一 y 7 2 h + T R A I L 组的凋亡率逐步增高， 这4 组之间 差异显著( P 0 . 0 1 ) ( 图3 ) 0 表 1 I F N一 Y 对 T R A I L抑制 R K O细胞株的影响 T a b I E f f e c t o # I F N 一 y o n t h e s u p r e s s i o n o f T R A I L t o R K O( %. x土s .n = 6 ) S u r v i v a l f r a c t i o n ( %) 7 0 % o f p r e d i c t i v e e f f e c t ( %) I F N一y T R AI L I F N一下0h 十T R A I L I F N一y 2 4 h +T R A I L I F N一y 4 8 h +T l 认I L I F N一y 7 2 h +T R A I L 9 9. 2 8士4 . 0 3 8 5. 4 5土3 . 5 5 8 9. 3 7 1 3 . 7 5 5 9 . 3 8士2 . 5 5 8 2 . 7 2 1 3 . 2 6 5 9 . 3 8土2 . 5 5 8 4 . 3 4 1 2 . 6 9 5 9 . 3 8 t 2 . 5 5 5 2 . 印1 2 . 0 6 0 5 9 . 3 8 t 2 . 5 5 0 s y n e r g i s t i c e ff e c t . * # * # 效和时效关系。同时， T R A I L 对 R K O细胞的凋亡诱 导率也随着T R A I L 剂量的增加而明显上升。证实了 T R A I L 对R K ( 细胞株存在杀伤作用。本研究结果还 显示R K O 细胞株对T R A I L 并不十分敏感。当T R A I L 剂量为 2 0 0 0 p 酬 L 时， R K O 细胞的 凋 亡诱导率也仅仅 达到 1 2 . 4 2 %， 同时其存活分数仍高达4 3 . 0 3 %0 I F N- y 是由T 细胞和自 然杀伤细胞分泌的细胞 因子。它具有多种功能， 如抑制病毒复制、 抑制肿瘤 细胞增殖、 激活免疫细胞和上调各种靶基因的表 达 3 。 最近， 有研究表明I F N 一 y 能通过调节T R A I L 途径增强T R A I L 诱导肿瘤细胞的凋亡 4 ,5 。 本结果 显示， I F N一 y 使R K O细胞株的凋亡率从单独应用 T R A I L 时的 2 . 3 8 %上升至联合用药时的 2 1 . 0 0 %. 此结果提示 I F N一 y 提高了R K O细胞株对 T R A I L 的 敏感程度， 明显增强了T R A I L 对肿瘤细胞的凋亡诱 导作用。 此外， 本研究结果还显示I F N 一 y 与T R A I L 联合用药后的疗效同I F N一 7 对肿瘤细胞预处理时 间的长短密切相关。随着 I F N一 y 预处理时间的延 长， T R A I L 引起 R K O细胞株的凋亡率也逐渐上升。 I F N 一 y 预处理7 2 h 后引起 R K O细胞株的凋亡率达 到高峰， 同时M TT结果也显示I F N一 7 预处理7 2 h 后 加人T R A I L 时两药有协同作用。这些结果为我们进 一步研究I F N一 7 和 T R A I L 联合抗肿瘤的用药时机 方面提供了线索。 参考文 0 , 1 2 3 4 5 6 7 T h e a p o p t o t ic r a t e o f R K O . %. x 士 s . n 二 4 . 尸 0 . 0 1 v s I F N 一 y g r o u p 十 T R A I L g ro u p ; # 尸 0 . 0 1 v s I F N 一 y 0 h 十 T R A I L g r o u p ; 0 P 0 . 0 1 v s I F N 一 y 2 4 h 十 T R A I L g ro u p ; 尸 0 . 0 1 v s I F N 一 了 4 8 h 十 T R A I L g ro u p . 卜P B S g ro u p ; 2 : I F N一 y g ro u p ; 3 : T R A I L g ro u p ; 4 : I F N 一 y 0 h 十 ，T R A I L g ro u p ; 5 : I F N一 y 2 4 h + T R A I L g ro u p ; 6 : I F N- 1 4 8 h + T R A I L g ro u p ; 7 : I F N 一 y 7 2 h + T R A I L g ro u p . 各组R K O细胞的凋亡率 讨论 1 E g g e rt A , G ro t z e r M A , n e c ros i s f a c t o r 一rel a t e d 一 i n d u c e d a p o p t o s i s i n Z u z a k T J , 献 e t a l . R e s i s t a n c e t o t u mo r a p o p t o s i s 一 i n d u c in g li g a n d ( T R A I L ) n e u rob a s t o m a c e ll s c o r r e l a t e - w i t h a 252015105 岁11。.Wlold。牙勺5。据以 T R A I L 是近几年发现的肿瘤坏死因子超家族成 它能够选择性地诱导肿瘤细胞发生凋亡， 而对 330 叮匕|1!、 F口口仁夕 正常组织细胞无明显的毒性作用， 故被认为是一种 安全和有前途的抗肿瘤制剂。但是有研究发现， 部 分肿瘤细胞对T R A I L 诱导的凋亡作用并不敏感， 这 限制了T R A I L 在抗肿瘤治疗中的应用。本研究结果 显示， T R A I L 对 R K O细胞株存活分数存在较好的量 l o s s o f c a s p a s e 一 8 e x p re s s i o n J 。 C a n c e r R e s , 2 0 0 1 ， 6 1 ( 4 ) : 1 3 1 4一1 3 1 9. 2 Y e h Y A , H e re n y io v a M , W e b e r G . Q u e r c e ti n : s y n e r g is t ic a c - t i o n w i t h c a r b o x y a m i d o一t r i a x o l e i n h u m a n b re a s t c a r c i n o m a c e ll s J . L if e S c i , 1 9 9 5 , 5 7 0 3 ) : 1 2 8 5 一 1 2 9 2 . 3 K a k im i K , G u i d o t t i L G , K o e z u k a Y , e t a l . N a t u r a l k i ll e r T c e l l a c t iv a t io n i n h i b it s h e p a t it i s B v i ru s re p li c a t io n in v iv o J J E x p M e d , 2 0 0 0 , 1 9 2 ( 7 ) : 9 2 1 一 9 3 0 . 4 S h in E C , A lm J M , K i m C H , e t a l . I F N一y in d u c e s c e ll d e a t h i n h u m a n h e p a to m a c e l ls t h r o u g h a T R A I L / D e a t h r e c e p - to r 一 m e d i a t e d a p o p to ti c p a t h w a y J . I n t J C a n c e r , 2 0 0 1 ， 9 3 ( 2 ) : 2 6 2 一 2 6 8 . 5 X u e z h o n g Y a n g , M e l i n d a S , M e r c h a n t , e t a . I n d u c t i o n o f c a s p a s e 8场 i n t e r f e r o n g a m m a re n d e r s s o m e n e u ro b l a s t o m a ( N B ) c e ll s s e n s i t iv e to t u m o r n e c ro s i s f a c t o r 一 re la t e d a p o p t o - s is 一 i n d u c i n g li g a n d ( T R A I L ) b u t re v e a ls t h a t a l a c k o f m e m - b r a n e T R I / T R 2 a l s o c o n t r i b u t e s t o T R A I L r -i -r i c e i n N B L J . C a n c e r R e s , 2 0 0 3 , 6 3 ( 5 ) : 1 1 2 2一 1 1 2 9