γ干扰素加强TRAIL抑制人大肠癌细胞株作用的研究.pdf
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1、 3 6 5 文章编号 1 0 0 ) 一 4 7 1 8 ( 2 0 0 6 ) 0 2 一 0 3 6 5 一 0 3 Y 一干扰素加强 T R A I L抑制人大肠癌 细胞株作用的研究 何 超, 胡文献, 胡晓形, 黄学 锋 ( 浙江大学医学院附属邵逸夫医院肛肠外科, 浙江 杭州3 1 0 0 1 6 ) 摘要 目的: 探讨Y 一 干扰素( O N - ,Y ) 对肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体( T R A I L ) 抑制人大肠癌细胞株作 用的影响。 方法: 以大肠癌细胞株R K O 为对象, 采用N M, 比色法和流式细胞术研究IFS 一 Y 对T R A I L 抑制R K O 的
2、影 响。 结果: I F N 一 Y 组、 T R A I L 组和I F N 一 ,1 7 2 h + T R A I L 组的存活分数分别为9 9 . 2 8 %, 8 5 . 4 5 %, 5 2 . 6 0 %o I F N 一 Y 组、 T R A I L 组、 I F N 一 y 2 4 h + T R A I L 组、 I F N 一 7 4 8 h 十 T R A I L 组和I F N 一 y 7 2 h + T R A I L 组的凋亡率分别为1 . 5 1 %, 2 . 3 8 %, 4 . 9 7 %, 1 3 . 3 0 %, 2 1 . 0 0 %. I F N 一
3、 y 2 4 h + T R A I L 组的凋亡率高于I F N 一 Y 组与T R A I L 组的凋亡率之和( P 0 . 0 1 ) 。随 着I F N 一 Y 预处理时间的延长, T R A I L 引起 R K O的凋亡率也明显上升( P 0 . 0 1 ) 。 结论二 I F N 一 Y 能有效加强T R A I L 对 R K O 细胞株的凋亡诱导作用。 关键词 干扰素II 型; R K O 细胞株; 肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体 中图分类号 R 3 6 3 文献标识码l A I F N一y r e i n f o r c e s t h e i n h i b i t o r
4、 y e ff e c t o f t u m o r n e c r o s i s f a c t o r 一r e l a t e d a p o p t o s i s 一 i n d u c i n g l i g a n d o n a p o p t o s i s o f h u m a n c o l o n c a n c e r c e l l li n e R K O c e l l s H E C h a o , H U We n 一 x i a n , H U Ma o 一 t o n g , H U A N G X u e 一 f e n g ( C l i n
5、i c a l R e s e a r c h I n s t it u t e of S i r R u n R u n S h a w H o s p i ta l , Z h ej ia n g U n i v e r s i ty , H a n g z h o ti 3 1 0 0 1 6 , C h i n a ) A B S T R A C T A I M: T o e x p l o re th e in fl u e n c e o f I F N 一 y o n t h e ro l e o f t u m o r n e c ro s is f a c to r 一 re
6、 l a t e d a p o p to s i “ 一 i n d u c in g l ig a n d ( T R A I L ) i n in d u c in g a p o p t o s is o f R K O c e ll l i n e . ME T H O D S : S u r v iv a l fr a c t i o n a n d a p o p t o s is w e re m e a s u r e d场N M m e t h o d a n d fl o w c y to m e t iy ( F A C S ) . R E S U L T S : S
7、u r v iv a l f r a c t io n o f I F N 一 y g r o u p , T R A I L a n d IF N 一 y 7 2 h 十 T R A I L g ro u p w e re 9 9 . 2 8 %, 8 5 . 4 5 % T R A I L g ro u p , I F N , 5 2 . 6 0 %,r e s p e c t i v e l y . T h e p e r c e n t a g e o f a p o p t o t i c c e l l s o f I F N一 y g r o 叩, T R A I L g ro
8、u p , I F N一y 2 4 h 十 一y 4 8 h + s p e c t i v e l y . T h e p e r c e n t a g e o f T R A I L a n d I F N一 y 7 2 h + T R A I L g ro u p w e re 1 . 5 1 % a , 2 . 3 8 %, 4 a p o p t o t i c c e ll s o f I F N 一 y 2 4 h + T R A I L g ro u p w a s h i g h e r t h a n t h e : T h e l o n g e r t h e I F
9、 N一 y p re t re a t e d, t h e h i g h e r t h e p e r c e n t a g e o f a p o p t o t i c . 9 7 %, 1 3 . 3 0 %, 2 1 . 0 0 %, re- m o f I M 一 y g r o u p a n d T R A I L e l l s w a s o b s e r v e d( P0 . 0 1 ) . I F N一yc a n rei n f o r c e t h e e ff e c t o f T R A I L I n t e r f e ro n t y p e
10、 I l ; R K O c e ll l i n e ; i n d u c i n g a p o p t o s i s i n R K O . T u m o r n e c r o s i s f a c t o r 一 re l a t e d a p o p t o s i s 一 i n d u c i n g l i g a n d 有研究发现, 部分肿瘤细胞对肿瘤坏死因子相 关 凋 亡 诱导配 体( t u m o r n e c ro s is f a c t o r 一 re la te d a p o p to - s i s 一 i n d u c in g l i
11、 g a n d , T R A I L ) 诱导的凋亡作用并不十 分敏 感 , 这限 制了T R A I L 在抗肿瘤治疗中的 应用。 本实验以体外培养人大肠癌细胞株 R K O为研究对 象, 探讨y 一 干扰素( I F N - y ) 对 T R A I L 抑制 R K O细 胞株生长作用的影响。 材料和方法 1 材料 可溶性T R A I L 蛋白购自 美国P e p ro T e c h 公司。 重组人 I F N - -i 购自 上海克隆生物高技术有限公司。 M T T 试剂为 A m r e s c o 产品。A n n e x i n V一 P I 凋亡试剂 盒为I m m
12、u n o t e c h 产品。自 动酶联检测仪为 B i o 一 R a d 产品。C 仇恒温孵箱为H e r a e u s 产品。 2 细胞培养 R I C O细胞株是一种低分化的结肠癌细胞株, 由 浙大医学院肿瘤所提供。以D M E M加 1 0 %胎牛血 收稿日 期 2 0 0 4 - 0 6 - 2 3 修回日 期 2 0 0 4 - 1 0 - 1 8 * 基金项目 浙江省自 然科学基金资助项目 ( N o . 3 0 2 6 7 8 ) T e l : 0 5 7 1 一8 5 5 2 7 1 8 8 ; E 一 m a i l : h w x 2 2 0 6 s o h u
13、 . c o m 4 3 . 0 3 %( 图1 ) , 其量效关系曲线近似标准的“ S ” 形, 近似直线部分位于5 0 一1 0 0 0 W L o 2 0 0 K g / L的 T R A I L 作用于细胞, 细胞的存活分数随时间的延长而 减少, 从6 h 的9 9 . 2 4 % 下降到3 6 h 的7 5 . 1 0 %( 图2 ) 0 2 T R A I L对 R K O细胞株的凋亡诱导作用 对照组、 1 0 0 0 j Cg / L T R A I L 组、 2 0 0 0 W L T R A I L 组对 R K ( ) 的凋亡诱导率分别为 1 . 0 3 %, 2 . 3
14、8 %, 1 2 . 4 2 %. T R A I L组与对照组之间差异显著( P 0 . O 1 ) ; T R A I L 1 0 0 0 t t g / L 组与” R A I L 2 0 0 0 p 岁 L 组之 间差异显著( P 0 . 0 1 ) 。随着 T R A I L剂量的增加, R K O的凋亡率也上升。 nlj八认八UOCU八U ZnUO八642 罗uo一妇豁妇1.奋.W奋JnS 0 0 5 0 l O a 下2 0 0 5 0 0 1 0 0 0 2 0 0 0 T R AI L d o s e ( p g / L ) D o s e 一e ff e c t r e l
15、 a t i o n s h i p o f T R A I L o n R K O s u r v i v a l f r a c t i o n . n=6. T R A I L对 R K O细胞存活分数的量效关系 1吸1 Fis图 n曰心nUnU10n ZnOO孟U月峥, 勺勺且 罗uo1另JJ工司卜1奋n的 清、 1 x 1 0 5 U / L 青霉素、 1 0 0 m g / L 链霉素为培养液, 置3 7 , 5 %C 仇孵箱培养。 3 预实验确定T R A I L使用剂量 3 . 1 M I T 法检测 T R A I L对 R K ( 存活分数的影响 T R A I L 对 R
16、 K O存活分数的量效关系按 5 0 , 1 0 0 , 2 0 0 , 5 0 0 , 1 0 0 0 , 2 0 0 0 t g / L 分别给予T R A I L , 对照组给予 同体积的P B S , 药物作用1 8 h 后测值。T R A I L 对R K O 存活分数的时效关系按每孔” R A I L 2 0 0 “ 岁 L , 孵育 0 , 6 , 1 2 , 1 8 , 2 4 , 3 6 h 后测值, 每个时段均设对照。当 细胞至对数生长期时, 以0 . 2 5 %胰蛋白酶消化细胞, 吹打成单细胞悬液, 按3 x 1 0 3 c e l l s / w e l l 接种于%孔
17、 板, 每孔终体积为2 0 0 ji L 。 培养2 4 h 后按上述分组 加人药物。测值前4h 每孔加人M T l 溶液( 5 g / L ) 2 0 匹, 继续孵育4 h , 终止培养。 小心吸弃上清, 每孔 加人1 5 0 t t L D M S O , 震荡1 0 m i n , 选择5 7 0 n m波长, 在 自 动酶联检测仪上测定各孔吸光度值( A 了 。 存活分 数= 试验组A / 对照组Ax 1 0 0 %。 3 . 2 F A C S 检测 T R A I L对 R K O细胞的凋亡诱导作 用 设立对照组、 T R A I L 1 0 0 0扩 L 和2 0 0 0岁L 组
18、, 共3 组。按 1 x 1 0 5 c e l l s / w e l l 接种于6 孔板, 培养2 d 后按组加药, 作用 2 4 h 后收集细胞。采用 a n n e x i n V 一 P I 凋亡试剂盒, F A C S 分析凋亡细胞百分率。碘化 丙陡( P I ) , a n n e x i n V均阴性以及 P I 阳性、 a n n e x i n V 阴性者为活细胞; P I 阴性、 a n n e x i n V阳性者为早期 凋亡细胞; P I , a n n e x i n V均阳性者为晚期凋亡细胞。 4 MT I 一 法检测 I F N - y 对 T R A M 抑制
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- 干扰素 加强 TRAIL 抑制 人大 肠癌 细胞株 作用 研究
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