大鼠脊髓神经干细胞的分离培养与鉴定.pdf
·基础研究· 大鼠脊髓神经干细胞的分离培养与鉴定 王小飞1 , 2,富赛里2,王惠民1,陈建1,陆佩华2 ( 1南通大学附属医院,江苏南通2 2 6 0 0 1 ; 2上海第二医科大学) 【摘要】 探讨胚胎大鼠神经干细胞( NS C s )的分离培养和鉴定方法。采用无血清培养液,从胚胎大鼠脊髓分 离和培养NS C s ,应用3H- T d R掺入技术和免疫荧光技术进行细胞自我更新能力、巢蛋白表达和多向分化潜能的 鉴定。结果表明,从E 1 6胚胎大鼠脊髓分离培养的细胞具有NS C s特征,可在体外增殖存活,经1 %胎牛血清诱导 可分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。认为从胚胎大鼠脊髓成功分离培养的NS C s可在体外稳定地培 养和传代,是研究细胞移植和基因治疗的理想细胞来源。 【关键词】 脊髓;神经系统;干细胞;细胞培养 【中图分类号】 R 3 3 1【文献标识码】 B【文章编号】 1 0 0 2 - 2 6 6 X ( 2 0 0 6 ) 0 1 - 0 0 2 3 - 0 3 神经干细胞( NS C s )是一类存在于神经系统中具 有自我更新能力和多向分化潜能的细胞,在一定条 件下可分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细 胞,并表现出相应的形态和电生理特征 1 。由于其具 有多向分化潜能和体内移植后易存活等特点,故成 为细胞移植治疗神经系统疾病或修复损伤神经组织 的理想材料。 2 0 0 4 2 0 0 5年,我们采用无血清培养液 从E 1 6胚胎大鼠脊髓分离和培养出具有NS C s特征 的细胞,经相关技术鉴定为NS C s 。现报告如下。 1 材料与方法 1 . 1 实 验 材 料实 验 动 物 为 孕 1 6 d的S p r a g u e - D a wl e y胚胎大鼠, 由上海第二医科大学实验动物中 心提供。 1 . 2 实验方法 1 . 2 . 1 NS C s分离与培养 用乙醚麻醉大鼠, 7 5 % 乙醇常规消毒,超净台上无菌取出胚胎,置Ha n k s液 中。手术显微镜下剥离脊髓组织,去除脊膜,置于L 1 5 培养液中。剪碎脊髓并吹打成细胞悬液。收集细胞悬 液过尼龙筛网, 4 1 0 0 0 r / mi n离心6 mi n ,将细胞重 悬于 无 血 清 NS C s基 础 培 养 液( D ME M/ F 1 2 、 1 × N2 、 0 . 0 6 %葡萄糖、 0 . 5 mM HE P E S 、 1 % B 2 7 、 2 µ g / ml肝 素 和2 mM 谷 氨 酰 胺)中,在 培 养 液 中 添 加 2 0 n g / ml表皮生长因子( E G F ) 和2 0 n g / ml碱性成纤 维生长因子( b F G F )后,按0 . 1 ×1 0 6/ ml 细胞密度种 入T2 5细胞培养瓶,在含5 %C O2的3 7 培养箱中 培养。约7 d后,离心收集未贴壁生长的细胞克隆,稍 加吹打分散成单个细胞或小细胞团( P 0代) ,液氮保 存或继续传代。P 0代培养5 6 d后, NS C s分裂增殖 形成较大的NS C s球( P 1代) ,用于再传代或冰冻切 片作组织化学鉴定,或用于分化实验作分化潜能的 鉴定。 1 . 2 . 2 冰冻切片制备取P 0代细胞团或P 1代、 P 2 代NS C s球, P B S洗涤2次, 4 %多聚甲醛固定过液。 转移 NS C s球于3 0 %蔗糖至 组 织 沉 底,包 埋 后 作 1 5 µ m厚度冰冻切片, 室温3 0 mi n吹干, -8 0 保存。 1 . 2 . 3 NS C s巢蛋白染色 取 NS C s球冰冻切片, 吹干。用含0 . 3 %T r i t o nX - 1 0 0和3 %正常山羊血清 的P B S预穿膜和封闭,室温3 0 mi n 。加小鼠Ne s t i n单 克隆抗体( 1 :2 0 0 ) 4 过夜。P B S洗涤3次,每次 5 mi n 。加罗丹明标记的山羊抗 小 鼠I g二 抗( 1 : 1 0 0 ) ,3 7 1 h 。 P B S洗 涤3次,每 次5 mi n 。用 Ho e c h s t 3 3 3 4 2作核染色,封片。于奥林巴斯B X 6 0型 荧光显微镜下观察结果。同时设无一抗和用正常小 鼠血清和正常山羊血清替代一抗的阴性作对照。 1 . 2 . 4 NS C s自我更新能力鉴定 取P 1代或P 2代 细胞,在9 6孔培养板中进行单克隆化培养, 1 2 d形 成小克隆后,在培养液中加入3H- T d R ,分别在其后 2 、 4 、 8 、 1 6和3 2 h ,以多头细胞收集仪收集细胞至玻 璃纤维膜上,液体闪烁仪测定c p m值。以2 h时间点 为对照,分别计算4 、 8 、 1 6和3 2 h的c p m值与2 h的 c p m值比值, 重复实验3次,结果以x ±s表示,用组 间t检验比较显著性。 1 . 2 . 5NS C s分 化 与 鉴 定 离 心( 1 0 0 0 r / mi , 4 6 mi n )收集NS C s球,通过机械吹打( 2 0 0 3 0 0 µ l总 体积, 2 0 0 µ l枪头中等速度吹打1 0 0次)使其分散成 为单个细胞并计数。细胞重悬于NS C s分化培养液 在 原NS C s基 础 培 养 液 中 添 加1 %胎 牛 血 清 ( F C S ) ,按0 . 5 ×1 0 6/ 片的细胞密度接种于预先包被 多聚赖氨酸的小玻片上,在含5 %C O2的3 7 培养箱 中促其分化,每隔2 d进行一次半量换液。分化培养 32 山东医药2 0 0 6年第4 6卷第1期 后第1 0天去除培养液, P B S洗涤两次, 4 %多聚甲醛 固定2 5 mi n ;再洗涤两次后,在无菌P B S中4 保存。 鉴定时,小玻片分别加入小鼠抗大鼠型微管蛋白 单克隆抗体标记神经元、小鼠抗大鼠胶质纤维酸性 蛋白单克隆抗体标记星形胶质细胞、小鼠抗大鼠R i p 单克隆抗体标记少突胶质细胞,并与相同的异硫氰 荧光素标记的山羊抗小鼠I g二抗进行与Ne s t i n染 色相似的免疫荧光染色。 2 结果 2 . 1 接种后1 d ,除部分细胞贴壁生长外,培养液中 有许多不规则状悬浮的细胞团;在随后的1周内,这 些细胞团中的细胞大量死亡,部分细胞团逐渐贴壁 生长;而后,部分悬浮的细胞逐渐分裂生长成含数个 细胞的小球状细胞团。传代后,这些细胞生长增大至 由几十个至上百个圆形细胞组成的神经细胞球。每 次传代采用机械法分散后,单个细胞及小细胞团又 重新增殖成较大的神经细胞球。传1 5代后,这些细 胞仍能维持基本的表型特征。 2 . 2 原代培养第2天,细胞团用抗Ne s t i n抗体免疫 荧光染色,仅见某些细胞团中散在的极少量阳性细 胞,从P 1代开始后,细胞球中大多数细胞Ne s t i n免 疫染色呈阳性反应,表现NS C s的特征性标志。 2 . 3 NS C s中加入 3 H- T d R 2 h后, 即能测到较高的 c p m值, 表明NS C s已经开始自我复制。随着时间延 长, c p m值快速增加,表明NS C s的自我复制进入快 速增长期。 2 . 4 经1 %F C S诱导培养2 4 h后,可见NS C s球细 胞均出现贴壁,细胞逐渐突起,呈现不同形态;诱导 分化7 d后,表现为明显的神经元、星形胶质细胞、少 突胶质细胞形态特征;分化1 0 d后,三种细胞可通过 其特异性抗体免疫染色标志而鉴别。P 2代NS C s分 化后神经元占细胞总数的4 %5 %,少突胶质细胞 占6 %8 %,星形胶质细胞约占9 0 %,约1 . 0 %的细 胞不能明确分类。 3 讨论 本研究从E 1 6胚胎大鼠脊髓中分离细胞,在含 有E G F和b F G F的无血清培养基中培养和传代,部 分细胞形成克隆球并呈现悬浮生长;其胞体有巢蛋 白(胚胎期神经上皮细胞的标志物)表达; 3 H- T d R掺 入提示细胞处于分裂增殖期,能分化成为神经元、星 形胶质细胞、少突胶质细胞。根据这些特点,我们认 为本研究已成功地分离培养出NS C s ,并且可在体外 大量增殖,长时间培养(超过1 5代) 。 目前,获得NS C s的常用方法有三种: 由胚胎 干细胞诱导。建立“永生化“ NS C s系:即采用转基 因方法,使NS C s细胞周期不断循环,其自我复制。该 法具有生长条件要求低、体外培养较容易、增殖较快 等优点,但由于外源基因的表达, NS C s的生物学特 性已经改变,故其应用的有效性和安全性需进一步 观察。原代细胞培养:即从中枢神经系统特定部位 分离NS C s ,并在合适的体外条件下培养。原代培养 的NS C s最接近于真实状态的NS C s ,可直接用于细 胞移植。目前,体外分离纯化NS C s方法有自然筛选、 流式细胞分选 2 和免疫磁珠分选法 3 。流式细胞分选 法技术要求高,免疫磁珠分选法可能对细胞活力有 一定影响,两种方法抗原抗体结合是否导致NS C s损 害尚存在争议。本文实验采用原代培养自然筛选方 法,由于非NS C s在上述培养系统中无法存活而逐渐 死亡,只有具备自我更新能力的NS C s能够存活而得 以分离获得,故这种方法无需特殊的设备,操作简 单,经济、实用。 研究发现,来自相同组织但不同发育阶段的 NS C s有不同的培养特性, 如从E 1 1大鼠脊髓神经管 中分离的神经上皮干细胞,其增殖和不分化状态的 维持需要鸡胚浸出液和b F G F 4 ; 而从E 1 4大鼠脊髓 和成年大鼠脊髓获得的 NS C s则是E G F反应性或 E G F +b F G F反应性的。但E 1 4大鼠脊髓较难获取, 脊膜不易剥离;成年大鼠脊髓分离困难,容易污染。 本文研究表明,用E 1 6大鼠可较方便地从脊髓中得 到NS C s ,且NS C s是E G F反应性或E G F +b F G F反 应性细胞, NS C s生长良好。 巢蛋白表达是NS C s的基本特征之一。目前,多 采用细胞活体染色或将细胞球粘贴到玻片再固定染 色的方法检测,前者存在对漂浮的细胞球洗涤困难, 抗体或其他试剂不易进入细胞球中央,不能观察到 细胞球中央细胞的染色情况等缺点;后者存在细胞 球粘贴不牢、易洗脱,粘贴使细胞球倾向分化等缺 点。本文实验采用细胞球直接固定、制作冰冻切片和 免疫组织化学染色的技术检测巢蛋白,可避免上述 方法的缺点,清楚地显示 NS C s中巢蛋白的表达情 况。 NS C s具有自我更新能力, 是其基本特征之一。 目前多采用5 -溴- 2 -脱氧尿苷( B r d U)标记新生细胞, 再用带荧光的抗B r d U抗体显示这些细胞的方法检 测。我们采用3H- T d R掺入技术,不仅可显示新增殖 的细胞,而且随着时间延长,可显示新增殖细胞呈快 速增长趋势,表明其具有很强的自我更新能力。 【参考文献】 1 Va c c a r i n oF M,G a n a t Y,Z h a n gY,e t a l . S t e m c e l l si nn e u r o d e - v e l o p me n t a n dp l a s t i c i t y J .Ne u r o p s y c h o p h a r ma c o l o g y ,2 0 0 1 , 2 5 : 8 0 5 - 8 1 5 . 42 山东医药2 0 0 6年第4 6卷第1期 2 Mo r r i s o nS J ,Wh i t eP M,Z o c kC ,e t a l . P r o s p e c t i v ei d e n t i f i c a - t i o n ,i s o l a t i o nb yf l o w c y t o me t r y ,a n di nv i v os e l f - r e n e wa lo f mu l t i p o t e n tma mma l i a nn e u r a l c r e s ts t e m c e l l s J .C e l l ,1 9 9 9 , 9 6 : 7 3 7 - 7 4 9 . 3 高国一,卢亦成,江基尧,等.免疫磁珠法分选胚胎大鼠脑神经 干 细胞的初步研究 J .第二军医大学学报,2 0 0 1 ,2 1 :1 0 9 2 - 1 0 9 4 . 4 Ka l y a n i A,Ho b s o nK,R a oMS . Ne u r o e p i t h e l i a l s t e m c e l l sf r o m t h ee mb r y o n i c s p i n a l c o r d :i s o l a t i o n ,c h a r a c t e r i z a t i o n ,a n dc l o n a l a n a l y s i s J . D e vB i o l ,1 9 9 7 ,1 8 6 : 2 0 2 - 2 2 3 . (收稿日期: 2 0 0 5 - 1 0 - 1 2 ) ·经验交流· 米氮平治疗脑卒中后抑郁 2 5例疗效观察 赵斌1 、 2,章军建1,秦碧勇2,王世凤2 ( 1武汉大学中南医院,湖北武汉4 3 0 0 7 1 ; 2郧阳医学院附属十堰市人民医院) 米氮平为新型的四环类抗抑郁药,临床报道其对抑郁症 及老年性抑郁有较好疗效,且副作用少,但其对脑卒中后抑郁 ( P S D )的治疗报道较少。2 0 0 3年9月2 0 0 5年3月,我们对 2 5例P S D患者采用米氮平治疗,取得较好疗效。现报告如下。 临床资料:本文5 0例P S D患者,均符合全国第四届脑血 管病学术会议制定的脑血管病诊断标准;发生脑卒中之前无 抑郁症及精神病病史;无其他内科系统严重疾病及智能损害; 汉密尔顿抑郁量表( HAMD , 1 7项)评分1 8分。随机分为两 组各5 0例,米氮平组男1 0例、女1 5例,年龄( 5 6 . 6 ±5 . 4 )岁; 氯丙咪嗪组男1 2例、女1 3例,年龄( 5 7 . 3 ±4 . 8 )岁。两组临床 资料无显著性差异。 治疗方法:两组均在脑卒中常规治疗基础上给予抗抑郁 治疗。米氮平组首次剂量1 5 mg ,以后1 5 4 5 mg / d ,睡前一次 顿 服,效 果 欠 佳 者 每 周 加 量1 5 mg ;氯 丙 咪 嗪 组 开 始 剂 量 5 0 mg / d ,分2次 服 用,逐 渐 加 量, 2周 时 治 疗 量7 5 1 5 0 ( 1 0 3 . 6 ±2 1 . 3 ) mg / d ;两组疗程均为6周,治疗期间不用其他 抗抑郁药,有严重失眠的患者可临时服用阿普唑仑0 . 4 0 . 8 mg /次。治疗前及治疗后4 、 6周末各评定HAMD ,以HAMD 减 分率( T)作为疗效评定指标, T7 5 %为痊愈, 7 5 %T 5 0 %为显著进步, 5 0 %T2 5 %为进步, T0 . 0 5 ) 。HAMD评定:米氮平组治疗前HAMD评分 ( 2 1 . 7 2 ± 2 . 6 9 )分,治 疗4周 时( 1 2 . 4 4 ± 1 . 4 2 )分, 6周 时 ( 9 . 4 8 ±1 . 0 5 )分;氯丙咪嗪组分别为( 2 2 . 7 6 ±2 . 2 4 ) 、 ( 1 3 . 1 6 ±1 . 7 7 ) 、 ( 9 . 8 4 ±1 . 4 0 )分。两组治疗前后均有显著性差异( P 0 . 0 5 ) 。 T E S S评定:米氮平组治疗4周时T E S S评分( 9 . 8 1 ±1 . 8 3 ) 分, 6周时( 7 . 1 7 ±0 . 9 8 ) ;氯丙咪嗪组分别为( 1 2 . 3 6 ±1 . 8 7 ) 、 ( 9 . 5 4 ±1 . 0 7 )分。两组比较均有显著性差异( P0 . 0 1 ) 。 讨论: P S D是指脑卒中后出现不同程度的抑郁症状持续 2周以上。据报道, P S D的发生率为1 8 %7 6 %,常发生于脑 卒中后3 6个月,是脑卒中后常见并发症,可严重影响患者 的生活质量及预后。脑卒中与抑郁的关系可能与脑卒中病灶 破坏去甲肾上腺素( NE )能神经元和5 -羟色胺( 5 - HT)能神经 元及其通路,使这些递质功能低下有关;患者躯体功能障碍、 生活自理能力下降是出现抑郁症状的心理诱发因素。脑卒中 病变部位与伴发抑郁症状有关,研究认为左侧半球损害比右 侧半球损害患者抑郁发生率高,皮质及靠近额叶的脑卒中易 发生抑郁;脑卒中性质(如出血性脑卒中与缺血性脑卒中)与 抑郁无明显相关性。 米氮平为哌嗪氮类衍生物,为5 - HT及NE回收抑制 剂,可提高突触间隙5 - HT、 NE含量,且起效快,有治疗抑郁, 改善焦虑及睡眠的作用,副作用较少。氯丙咪嗪为三环类抗抑 郁剂,其镇静作用较轻,对抑郁、焦虑、强迫等症状有较好疗 效。本文分别用米氮平及氯丙咪嗪治疗P S D ,结果显示两组 疗效无显著性差异,其HAMD评分于治疗第2周米氮平组低 于氯丙咪嗪组,具有显著性差异( P0 . 0 5 ) ,说明米氮平起效 较快,但治疗4 、 6周时两组无明显差异。米氮平的主要不良反 应是嗜睡、食欲增加、恶心、口干、便秘等轻微胃肠道反应;氯 丙咪嗪主要为嗜睡、无力、口干、便秘、视物模糊、心慌、排尿困 难、食欲减退等,其不良反应相对较重,部分老年患者难以耐 受。因此,本研究认为米氮平治疗P S D起效较快,不良反应少 而轻,老年患者容易接受,有较好的药物依从性,值得临床应 用。 (收稿日期: 2 0 0 5 - 0 8 - 2 6 ) 52 山东医药2 0 0 6年第4 6卷第1期
