大鼠脊髓神经干细胞的分离培养与鉴定.pdf
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1、基础研究 大鼠脊髓神经干细胞的分离培养与鉴定 王小飞1 , 2,富赛里2,王惠民1,陈建1,陆佩华2 ( 1南通大学附属医院,江苏南通2 2 6 0 0 1 ; 2上海第二医科大学) 【摘要】 探讨胚胎大鼠神经干细胞( NS C s )的分离培养和鉴定方法。采用无血清培养液,从胚胎大鼠脊髓分 离和培养NS C s ,应用3H- T d R掺入技术和免疫荧光技术进行细胞自我更新能力、巢蛋白表达和多向分化潜能的 鉴定。结果表明,从E 1 6胚胎大鼠脊髓分离培养的细胞具有NS C s特征,可在体外增殖存活,经1 %胎牛血清诱导 可分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。认为从胚胎大鼠脊髓成功分离培
2、养的NS C s可在体外稳定地培 养和传代,是研究细胞移植和基因治疗的理想细胞来源。 【关键词】 脊髓;神经系统;干细胞;细胞培养 【中图分类号】 R 3 3 1【文献标识码】 B【文章编号】 1 0 0 2 - 2 6 6 X ( 2 0 0 6 ) 0 1 - 0 0 2 3 - 0 3 神经干细胞( NS C s )是一类存在于神经系统中具 有自我更新能力和多向分化潜能的细胞,在一定条 件下可分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细 胞,并表现出相应的形态和电生理特征 1 。由于其具 有多向分化潜能和体内移植后易存活等特点,故成 为细胞移植治疗神经系统疾病或修复损伤神经组织 的理想材料。
3、2 0 0 4 2 0 0 5年,我们采用无血清培养液 从E 1 6胚胎大鼠脊髓分离和培养出具有NS C s特征 的细胞,经相关技术鉴定为NS C s 。现报告如下。 1 材料与方法 1 . 1 实 验 材 料实 验 动 物 为 孕 1 6 d的S p r a g u e - D a wl e y胚胎大鼠, 由上海第二医科大学实验动物中 心提供。 1 . 2 实验方法 1 . 2 . 1 NS C s分离与培养 用乙醚麻醉大鼠, 7 5 % 乙醇常规消毒,超净台上无菌取出胚胎,置Ha n k s液 中。手术显微镜下剥离脊髓组织,去除脊膜,置于L 1 5 培养液中。剪碎脊髓并吹打成细胞悬液。收集
4、细胞悬 液过尼龙筛网, 4 1 0 0 0 r / mi n离心6 mi n ,将细胞重 悬于 无 血 清 NS C s基 础 培 养 液( D ME M/ F 1 2 、 1 N2 、 0 . 0 6 %葡萄糖、 0 . 5 mM HE P E S 、 1 % B 2 7 、 2 g / ml肝 素 和2 mM 谷 氨 酰 胺)中,在 培 养 液 中 添 加 2 0 n g / ml表皮生长因子( E G F ) 和2 0 n g / ml碱性成纤 维生长因子( b F G F )后,按0 . 1 1 0 6/ ml 细胞密度种 入T2 5细胞培养瓶,在含5 %C O2的3 7 培养箱中 培
5、养。约7 d后,离心收集未贴壁生长的细胞克隆,稍 加吹打分散成单个细胞或小细胞团( P 0代) ,液氮保 存或继续传代。P 0代培养5 6 d后, NS C s分裂增殖 形成较大的NS C s球( P 1代) ,用于再传代或冰冻切 片作组织化学鉴定,或用于分化实验作分化潜能的 鉴定。 1 . 2 . 2 冰冻切片制备取P 0代细胞团或P 1代、 P 2 代NS C s球, P B S洗涤2次, 4 %多聚甲醛固定过液。 转移 NS C s球于3 0 %蔗糖至 组 织 沉 底,包 埋 后 作 1 5 m厚度冰冻切片, 室温3 0 mi n吹干, -8 0 保存。 1 . 2 . 3 NS C s
6、巢蛋白染色 取 NS C s球冰冻切片, 吹干。用含0 . 3 %T r i t o nX - 1 0 0和3 %正常山羊血清 的P B S预穿膜和封闭,室温3 0 mi n 。加小鼠Ne s t i n单 克隆抗体( 1 :2 0 0 ) 4 过夜。P B S洗涤3次,每次 5 mi n 。加罗丹明标记的山羊抗 小 鼠I g二 抗( 1 : 1 0 0 ) ,3 7 1 h 。 P B S洗 涤3次,每 次5 mi n 。用 Ho e c h s t 3 3 3 4 2作核染色,封片。于奥林巴斯B X 6 0型 荧光显微镜下观察结果。同时设无一抗和用正常小 鼠血清和正常山羊血清替代一抗的阴性
7、作对照。 1 . 2 . 4 NS C s自我更新能力鉴定 取P 1代或P 2代 细胞,在9 6孔培养板中进行单克隆化培养, 1 2 d形 成小克隆后,在培养液中加入3H- T d R ,分别在其后 2 、 4 、 8 、 1 6和3 2 h ,以多头细胞收集仪收集细胞至玻 璃纤维膜上,液体闪烁仪测定c p m值。以2 h时间点 为对照,分别计算4 、 8 、 1 6和3 2 h的c p m值与2 h的 c p m值比值, 重复实验3次,结果以x s表示,用组 间t检验比较显著性。 1 . 2 . 5NS C s分 化 与 鉴 定 离 心( 1 0 0 0 r / mi , 4 6 mi n
8、)收集NS C s球,通过机械吹打( 2 0 0 3 0 0 l总 体积, 2 0 0 l枪头中等速度吹打1 0 0次)使其分散成 为单个细胞并计数。细胞重悬于NS C s分化培养液 在 原NS C s基 础 培 养 液 中 添 加1 %胎 牛 血 清 ( F C S ) ,按0 . 5 1 0 6/ 片的细胞密度接种于预先包被 多聚赖氨酸的小玻片上,在含5 %C O2的3 7 培养箱 中促其分化,每隔2 d进行一次半量换液。分化培养 32 山东医药2 0 0 6年第4 6卷第1期 后第1 0天去除培养液, P B S洗涤两次, 4 %多聚甲醛 固定2 5 mi n ;再洗涤两次后,在无菌P
9、B S中4 保存。 鉴定时,小玻片分别加入小鼠抗大鼠型微管蛋白 单克隆抗体标记神经元、小鼠抗大鼠胶质纤维酸性 蛋白单克隆抗体标记星形胶质细胞、小鼠抗大鼠R i p 单克隆抗体标记少突胶质细胞,并与相同的异硫氰 荧光素标记的山羊抗小鼠I g二抗进行与Ne s t i n染 色相似的免疫荧光染色。 2 结果 2 . 1 接种后1 d ,除部分细胞贴壁生长外,培养液中 有许多不规则状悬浮的细胞团;在随后的1周内,这 些细胞团中的细胞大量死亡,部分细胞团逐渐贴壁 生长;而后,部分悬浮的细胞逐渐分裂生长成含数个 细胞的小球状细胞团。传代后,这些细胞生长增大至 由几十个至上百个圆形细胞组成的神经细胞球。每
10、 次传代采用机械法分散后,单个细胞及小细胞团又 重新增殖成较大的神经细胞球。传1 5代后,这些细 胞仍能维持基本的表型特征。 2 . 2 原代培养第2天,细胞团用抗Ne s t i n抗体免疫 荧光染色,仅见某些细胞团中散在的极少量阳性细 胞,从P 1代开始后,细胞球中大多数细胞Ne s t i n免 疫染色呈阳性反应,表现NS C s的特征性标志。 2 . 3 NS C s中加入 3 H- T d R 2 h后, 即能测到较高的 c p m值, 表明NS C s已经开始自我复制。随着时间延 长, c p m值快速增加,表明NS C s的自我复制进入快 速增长期。 2 . 4 经1 %F C
11、S诱导培养2 4 h后,可见NS C s球细 胞均出现贴壁,细胞逐渐突起,呈现不同形态;诱导 分化7 d后,表现为明显的神经元、星形胶质细胞、少 突胶质细胞形态特征;分化1 0 d后,三种细胞可通过 其特异性抗体免疫染色标志而鉴别。P 2代NS C s分 化后神经元占细胞总数的4 %5 %,少突胶质细胞 占6 %8 %,星形胶质细胞约占9 0 %,约1 . 0 %的细 胞不能明确分类。 3 讨论 本研究从E 1 6胚胎大鼠脊髓中分离细胞,在含 有E G F和b F G F的无血清培养基中培养和传代,部 分细胞形成克隆球并呈现悬浮生长;其胞体有巢蛋 白(胚胎期神经上皮细胞的标志物)表达; 3 H
12、- T d R掺 入提示细胞处于分裂增殖期,能分化成为神经元、星 形胶质细胞、少突胶质细胞。根据这些特点,我们认 为本研究已成功地分离培养出NS C s ,并且可在体外 大量增殖,长时间培养(超过1 5代) 。 目前,获得NS C s的常用方法有三种: 由胚胎 干细胞诱导。建立“永生化“ NS C s系:即采用转基 因方法,使NS C s细胞周期不断循环,其自我复制。该 法具有生长条件要求低、体外培养较容易、增殖较快 等优点,但由于外源基因的表达, NS C s的生物学特 性已经改变,故其应用的有效性和安全性需进一步 观察。原代细胞培养:即从中枢神经系统特定部位 分离NS C s ,并在合适的
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- 大鼠 脊髓 神经 干细胞 分离 培养 鉴定
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