生物化学实验蛋白质性质试验.ppt

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1、生物化学基础实验生物化学基础实验教学课件教学课件生化与分子生物学实验室生化与分子生物学实验室 于乐军于乐军目目录录 实验一实验一 生物化学实验技能培训生物化学实验技能培训 实验二实验二 蛋白质部分性质实验蛋白质部分性质实验 实验三实验三 Folin-wu Folin-wu法定量测定血糖的含量法定量测定血糖的含量 实验四实验四 Folin-Folin-酚试剂法测定蛋白质浓度酚试剂法测定蛋白质浓度 实验五实验五 氨基酸的纸层析氨基酸的纸层析 实验六实验六 醋酸纤维薄膜电泳血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳血清蛋白 实验七实验七 酵母酵母RNARNA的提取及鉴定的提取及鉴定 实验八实验八 DNA DNA的提取

2、及测定的提取及测定 实验九实验九 胰蛋白酶的活力测定胰蛋白酶的活力测定 实验十实验十 水果中维生素水果中维生素C C的定量测定的定量测定 实验十一实验十一 聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳牛血清聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳牛血清生物化学实验技能培训生物化学实验技能培训通过生物化学实验应该做到：学习设计一个实验的基本思路，掌握各个实验的基本原理，学会严密地组织自己的实验，合理地安排实验步骤和时间。训练实验的动手能力，学会熟练地使用各种生物化学实验仪器。学会准确翔实地记录实验现象和数据的技能，提高实验报告的写作能力，能够整齐清洁地进行所有的实验，培养严谨细致的科学作风。掌握生物化学的各种基本实验方法和实验技术，为

3、今后参加科研工作打下坚实的基础。实验室规则实验室规则 实验前必须认真预习实验内容，明确本次实验的目的和要求，掌握实验原理。实验时自觉遵守实验室纪律，保持室内安静，不大声说笑和喧哗。实验过程中要听从教师指导，认真按照实验步骤和操作规程进行实验。若想改进和设计新的实验方法，必须取得教师的同意。实验时认真进行实验记录，实验完毕及时整理数据，按时上交实验报告。实验台面、称量台、药品架、水池以及各种实验仪器内外都必须保持清洁整齐，药品称完后立即盖好瓶盖放回药品架，严禁瓶盖及药勺混杂，切勿使药品（尤其是NaOH）洒落在天平和实验台面上，毛刷用后必须立即挂好，各种器皿不得丢弃在水池内。配制试剂按实验实际使用

4、量配制，多余的重要试剂和各种有机试剂要按教师要求进行回收；昂贵试剂需要回收，不得丢弃。配制的试剂和实验过程中的样品，尤其是保存在冰箱和冷室中的样品，必须贴上标签、写上品名、浓度、姓名和日期等，放在冰箱中的易挥发溶液和酸性溶液，必须严密封口。强酸强碱以及其他实验废液必须倒入废液桶。电泳后的凝胶和各种废物不得倒入水池，只能倒入废物桶。使用贵重精密仪器应严格遵守操作规程。使用分光光度计时不得将溶液洒在仪器内外和地面上。仪器发生故障应立即报告教师，未经许可不得自己随意检修。实验室内严禁吸烟、饮水和进食，严禁用嘴吸移液管和虹吸管。易燃液体不得接近明火和电炉，凡产生烟雾、有害气体和不良气味的实验，均应在通

5、风条件下进行。实验完毕必须及时洗净并放好各种玻璃仪器，插好自动部分收集器上的试管，保持实验台面和实验柜内的整洁。严禁抄拿他组仪器，不得将器皿遗弃在分光光度计内和其他实验台面上，打破了玻璃仪器要及时向教师报告，并自觉登记，学期结束时按规定进行处理。每日实验完毕，值日生要认真做好实验室的卫生值日工作。最后离开实验室的实验人员，必须检查并关好水、电、门、窗。蛋白质部分性质实验蛋白质部分性质实验 蛋白质颜色反应和沉淀反应蛋白质颜色反应和沉淀反应 蛋蛋白白质质分分子子中中某某种种或或某某些些集集团团可可与与显显色色剂剂作作用用，产产生生颜颜色色。不不同同的的蛋蛋白白质质由由于于所所含含的的氨氨基基酸酸不

6、不完完全全相相同同，颜颜色色反反应应亦亦不不完完全全相相同同。颜颜色色反反应应不不是是蛋蛋白白质质的的专专一一反反应应，一一些些非非蛋蛋白白物物质质也也可可产产生生同同样样的的颜颜色色反反应应，因因此此不不能能根根据据颜颜色色反反应应的的结结果果来来决决定定被被测测物物是是否否为为蛋蛋白白质质。另另外外，颜颜色色反反应应也也可可作作为为一一些些常常用用蛋蛋白白质质定定量量测定的依据。测定的依据。第一部分第一部分 蛋白质的颜色反应蛋白质的颜色反应一、试验原理一、试验原理二、实验仪器二、实验仪器二、实验仪器二、实验仪器1 1、吸吸管管 2 2、滴滴管管 3 3、试试管管 4 4、电电炉炉 5 5、

7、pHpH试试纸纸 6 6、水水浴浴锅锅三、实验试剂三、实验试剂三、实验试剂三、实验试剂1 1、卵清蛋白液：鸡蛋清用蒸馏水稀释、卵清蛋白液：鸡蛋清用蒸馏水稀释10-2010-20倍，倍，3-43-4层纱布过滤，滤液放在层纱布过滤，滤液放在冰箱里冷藏备用。冰箱里冷藏备用。2 2、0.5%0.5%苯酚：苯酚：1g1g苯酚加蒸馏水稀释至苯酚加蒸馏水稀释至200ml200ml。3 3、MillonMillons s试剂：试剂：40g40g汞溶于汞溶于60ml60ml浓硝酸（水浴加温助溶）溶解后，冷却，浓硝酸（水浴加温助溶）溶解后，冷却，加二倍体积的蒸馏水，混匀，取上清夜备用。此试剂可长期保存。加二倍体积

8、的蒸馏水，混匀，取上清夜备用。此试剂可长期保存。4 4、1%CuSO1%CuSO4 4：1g CuSO1g CuSO4 4晶体溶于蒸馏水，稀释至晶体溶于蒸馏水，稀释至100ml100ml5 5、10%NaOH10%NaOH：10g NaOH10g NaOH溶于蒸馏水，稀释至溶于蒸馏水，稀释至100ml100ml6 6、0.1%0.1%茚三酮溶液：茚三酮溶液：0.1g0.1g茚三酮溶于茚三酮溶于95%95%的乙醇并稀释至的乙醇并稀释至100ml.100ml.7 7、尿素晶体、尿素晶体 8 8、浓硝酸、浓硝酸 9 9、冰醋酸冰醋酸 10 10、浓硫酸、浓硫酸（一）米伦（一）米伦（MillonMil

9、lons s）反应）反应原理原理原理原理：米伦试剂是硝酸、亚硝酸、硝酸汞、亚硝：米伦试剂是硝酸、亚硝酸、硝酸汞、亚硝酸汞的混合物。他能与苯酚及某些二羟基苯衍生物起酸汞的混合物。他能与苯酚及某些二羟基苯衍生物起颜色反应。组成蛋白质的氨基酸中只有酪氨酸含苯酚颜色反应。组成蛋白质的氨基酸中只有酪氨酸含苯酚基团，因此该反应为蛋白质中酪氨酸存在的依据。基团，因此该反应为蛋白质中酪氨酸存在的依据。操作操作操作操作：1 1、苯酚实验：、苯酚实验：取取0.5%0.5%苯酚溶液苯酚溶液1ml1ml于试管中，加于试管中，加MillonMillons s试剂试剂0.5ml0.5ml，于电炉上小心加热，溶液即出现玫瑰

10、红色。，于电炉上小心加热，溶液即出现玫瑰红色。2 2、蛋白质实验：、蛋白质实验：取取2ml2ml蛋白液，加蛋白液，加MillonMillons s试剂试剂0.5ml0.5ml，出现白色，出现白色的蛋白质沉淀，小心加热，凝固的蛋白质出现红色。的蛋白质沉淀，小心加热，凝固的蛋白质出现红色。四、实验步骤四、实验步骤（二）双缩脲反应（二）双缩脲反应原理原理原理原理：尿素被加热，则两分子的尿素放出一分子氨：尿素被加热，则两分子的尿素放出一分子氨而形成双缩脲。双缩脲在碱性环境中，能与硫酸铜结合而形成双缩脲。双缩脲在碱性环境中，能与硫酸铜结合成紫色的化合物，此反应称为双缩脲反应。蛋白质分子成紫色的化合物，此

11、反应称为双缩脲反应。蛋白质分子中含有肽键与缩脲结构相似，故也能进行此反应。双缩中含有肽键与缩脲结构相似，故也能进行此反应。双缩脲反应可作为蛋白质定量测定的依据。脲反应可作为蛋白质定量测定的依据。操作操作操作操作：1 1、尿素实验尿素实验取少量尿素晶体放在干燥的试管中，微火加热使其取少量尿素晶体放在干燥的试管中，微火加热使其熔化成液体熔化成液体，此时有氨气放出，可用湿润的试纸检验，此时有氨气放出，可用湿润的试纸检验，至液体重新结晶出现白色固体时至液体重新结晶出现白色固体时，停止加热，冷却。然停止加热，冷却。然后加后加10%NaOH10%NaOH溶液溶液1ml1ml，摇匀，再加，摇匀，再加2-42

12、4滴滴1%CuSO1%CuSO4 4溶液，溶液，混匀，观察有无紫色出现。混匀，观察有无紫色出现。2 2、蛋白液实验蛋白液实验取取蛋蛋白白液液1ml1ml，加加10%NaOH10%NaOH溶溶液液1ml1ml，摇摇匀匀，再再加加2-42-4滴滴1%CuSO1%CuSO4 4溶液，混匀，观察有无紫色出现。溶液，混匀，观察有无紫色出现。（三）黄色反应（三）黄色反应原原原原理理理理：蛋蛋白白质质分分子子中中含含有有苯苯环环结结构构的的氨氨基基酸酸（如如酪酪氨氨酸酸、色色氨氨酸酸等等），于于浓浓硝硝酸酸可可反反应应并并生生成成黄黄色色物物质质，此此物物质质在在碱碱性性环环境境下下变变为为桔桔黄黄色色的

13、的硝硝基基苯苯衍衍生生物物硝醌酸等。硝醌酸等。操操操操作作作作：取取一一支支试试管管，加加入入1ml1ml蛋蛋白白液液及及浓浓硝硝酸酸5 5滴滴。加加热热，冷冷却却后后注注意意颜颜色色变变化化。然然后后再再加加入入10%NaOH10%NaOH溶溶液液1ml1ml，颜色有什么变化？，颜色有什么变化？（四）茚三酮反应（四）茚三酮反应原理原理原理原理：蛋白质与茚三酮共热，产生兰紫色的还原茚三：蛋白质与茚三酮共热，产生兰紫色的还原茚三酮、茚三酮和氨的缩合物。此反应为一切蛋白质及酮、茚三酮和氨的缩合物。此反应为一切蛋白质及a-a-氨基氨基酸所共有。亚氨基酸（脯氨酸和羟脯氨酸）与茚三酮反应酸所共有。亚氨基

14、酸（脯氨酸和羟脯氨酸）与茚三酮反应呈黄色，含有氨基的其他物质亦呈此反应。呈黄色，含有氨基的其他物质亦呈此反应。操作操作操作操作：取蛋白液：取蛋白液1ml1ml于试管中，加于试管中，加4-84-8滴茚三酮溶液，加热至滴茚三酮溶液，加热至沸，即有蓝紫色出现。沸，即有蓝紫色出现。第二部分第二部分 蛋白质的沉淀反应蛋白质的沉淀反应一、试验原理一、试验原理蛋蛋白白质质是是亲亲水水性性胶胶体体，在在溶溶液液中中的的稳稳定定性性与与质质点点大大小小、电电荷荷、水水化化作作用用有有关关，但但其其稳稳定定性性是是有有条条件件的的，相相对对的的。如如果果条条件件发发生生了了变变化化，破破坏坏了了蛋蛋白白质质的的稳

15、稳定定性，蛋白质就会从溶液中沉淀出来。性，蛋白质就会从溶液中沉淀出来。蛋白质胶体溶液的稳定因素：水化膜、带电荷蛋白质胶体溶液的稳定因素：水化膜、带电荷。当破。当破坏这两个因素时，蛋白质中从溶液中析出而产生沉淀。坏这两个因素时，蛋白质中从溶液中析出而产生沉淀。二、实验仪器二、实验仪器1 1、移液管、移液管 2 2、吸管、吸管 3 3、试管、试管 4 4、电炉、电炉三、实验试剂三、实验试剂1 1、卵卵清清蛋蛋白白液液：鸡鸡蛋蛋清清用用蒸蒸馏馏水水稀稀释释10-2010-20倍倍，3-43-4层层纱纱布布过过滤滤，滤滤液液放在冰箱里冷藏备用。放在冰箱里冷藏备用。2 2、饱和硫酸铵溶液：、饱和硫酸铵溶

16、液：100ml100ml蒸馏水中加硫酸铵至饱和。蒸馏水中加硫酸铵至饱和。3 3、硫酸铵晶体：用研钵研成碎末。、硫酸铵晶体：用研钵研成碎末。4 4、95%95%乙醇。乙醇。5 5、醋酸铅溶液：、醋酸铅溶液：1g1g醋酸铅溶于蒸馏水并稀释至醋酸铅溶于蒸馏水并稀释至100ml100ml6 6、硫酸铜溶液：、硫酸铜溶液：1g CuSO1g CuSO4 4晶体溶于蒸馏水，稀释至晶体溶于蒸馏水，稀释至100ml100ml7 7、氯化钠晶体、氯化钠晶体8 8、10%10%三氯乙酸溶液：三氯乙酸溶液：10g10g三氯乙酸溶于蒸馏水中并稀释至三氯乙酸溶于蒸馏水中并稀释至100ml100ml9 9、饱和苦味酸溶液

17、饱和苦味酸溶液：100ml100ml蒸馏水中加苦味酸至饱和。蒸馏水中加苦味酸至饱和。1010、1%1%醋酸溶液。醋酸溶液。四、实验步骤四、实验步骤（一）蛋白质的盐析作用一）蛋白质的盐析作用原原原原理理理理：向向蛋蛋白白质质中中加加入入大大量量的的中中性性盐盐（硫硫酸酸铵铵、硫硫酸酸钠钠或或氯氯化化钠钠等等），使使蛋蛋白白质质胶胶体体颗颗粒粒脱脱水水，破破坏坏其其水水化化层层，同同时时它它所所带带有有的的电电荷荷亦亦被被中中性性盐盐上上所所带带的的相相反反电电荷荷的的离离子子所所中中和和。于于是是稳稳定定因因素素被被破破坏坏，蛋蛋白白质质聚聚集集沉淀。盐析作用一般不使蛋白质变性。沉淀。盐析作

18、用一般不使蛋白质变性。操操操操作作作作：1 1、取取试试管管1 1支支，加加蛋蛋白白液液2ml2ml，然然后后加加固固体体硫硫酸酸铵铵(加加的的过过程程要要缓缓慢慢，加加的的量量要要少少随随时时摇摇匀匀），直直至至其其饱饱和（大约为和（大约为50%50%）。摇匀静置数分钟，则有球蛋白析出。）。摇匀静置数分钟，则有球蛋白析出。2 2、将将上上述述混混合合液液过过滤滤。向向滤滤液液中中逐逐渐渐加加入入少少量量固固体体硫硫酸酸铵铵（每每次次加加入入量量约约为为米米粒粒大大小小），边边加加边边摇摇，直直至至饱饱和和为为止止，此此时时析析出出为为清清蛋蛋白白。再再加加入入少少量量蒸蒸馏馏水，观察沉淀是否

19、溶解。水，观察沉淀是否溶解。（二）有机溶剂沉淀蛋白质（二）有机溶剂沉淀蛋白质原原原原理理理理：某某些些有有机机溶溶剂剂（如如乙乙醇醇、甲甲醇醇、丙丙醇醇等等），因因引引起起蛋蛋白白质质脱脱去去水水化化层层以以及及降降低低介介电电常常数数而而增增加加带带电电质质点点间的相互作用，致使蛋白质颗粒容易凝聚而沉淀。间的相互作用，致使蛋白质颗粒容易凝聚而沉淀。操操操操作作作作：取取一一试试管管加加蛋蛋白白液液1ml1ml，加加入入晶晶体体氯氯化化钠钠少少许许，待溶解后再加待溶解后再加95%95%乙醇乙醇3ml,3ml,摇匀，观察现象。摇匀，观察现象。（三）重金属盐与某些有机酸沉淀蛋白质（三）重金属盐与某

20、些有机酸沉淀蛋白质原原原原理理理理：重重金金属属离离子子（如如PbPb2+2+、CuCu2+2+等等）与与蛋蛋白白质质的的羧羧基基等等结结合合生生成成不不溶溶性性的的金金属属盐盐类类而而沉沉淀淀，同同时时蛋蛋白白质质发发生生变变性性。某某些些有有机机酸酸的的酸酸根根则则与与蛋蛋白白质质的的自自由由氨氨基基结结合而沉淀。合而沉淀。操操操操作作作作：1 1、取取试试管管2 2支支，各各加加蛋蛋白白液液2ml2ml，一一支支管管中中滴滴加加1%1%醋醋酸酸铅铅溶溶液液，另另一一支支管管中中滴滴加加1%1%硫硫酸酸铜铜溶溶液液，至至有有沉淀产生。沉淀产生。（四）生物碱试剂沉淀蛋白质（四）生物碱试剂沉淀

21、蛋白质原原原原理理理理：植植物物体体内内具具有有显显著著生生理理作作用用的的含含氮氮碱碱性性化化合合物物成成为为生生物物碱碱。能能沉沉淀淀生生物物碱碱或或与与其其产产生生颜颜色色反反应应的的物物质质称称为为生生物物碱碱试试剂剂，如如鞣鞣酸酸等等。当当溶溶液液PHPH小小于于等等电电点点时时，蛋蛋白白质质颗颗粒粒带带正正电电荷荷，容容易易与与生生物物碱碱试试剂剂的的负负离离子子发发生生反反应应而沉淀。而沉淀。操操操操作作作作：取取2 2支支试试管管，分分别别加加入入蛋蛋白白液液2ml2ml及及醋醋酸酸4-54-5滴滴，再再加饱和苦味酸和鞣酸数滴，观察现象加饱和苦味酸和鞣酸数滴，观察现象。（一）（

22、一）米伦（米伦（MillonMillons s）反应）反应1 1、苯酚实验：取、苯酚实验：取0.5%0.5%苯酚溶液苯酚溶液1ml1ml于试于试管中，加管中，加MillonMillons s试剂试剂0.5ml0.5ml，电炉，电炉小心加热观察颜色变化。小心加热观察颜色变化。2 2、蛋白质实验：取、蛋白质实验：取2ml2ml蛋白液，加蛋白液，加MillonMillons s试剂试剂0.5ml0.5ml，出现白色的蛋，出现白色的蛋白质沉淀，小心加热，观察现象。白质沉淀，小心加热，观察现象。（二）（二）双缩脲反应双缩脲反应1 1、取少量尿素晶体放在干燥的试管中，、取少量尿素晶体放在干燥的试管中，微火

23、加热熔化，至重新结晶时冷却。微火加热熔化，至重新结晶时冷却。然后加然后加10%NaOH10%NaOH溶液溶液1ml1ml，摇匀，再加，摇匀，再加2-42-4滴滴1%CuSO1%CuSO4 4溶液，混匀，观察现象。溶液，混匀，观察现象。2 2、取取蛋蛋白白液液1ml1ml，加加10%NaOH10%NaOH溶溶液液1ml1ml，摇摇匀匀，再再加加2-42-4滴滴1%1%CuSOCuSO4 4溶溶液液，混混匀匀，观察现象。观察现象。（三）（三）黄色反应黄色反应 取一支试管，加入取一支试管，加入1ml1ml蛋白液及浓硝蛋白液及浓硝酸酸5 5滴。加热，冷却后注意颜色变化。滴。加热，冷却后注意颜色变化。然

24、后再加入然后再加入10%NaOH10%NaOH溶液溶液1ml1ml，颜色有，颜色有什么变化？什么变化？（四）（四）茚三酮反应茚三酮反应 取蛋白液取蛋白液1ml1ml于试管中，加于试管中，加1010滴茚三滴茚三酮溶液，加热至沸，即有蓝紫色出现酮溶液，加热至沸，即有蓝紫色出现。（一）蛋白质的盐析作用（一）蛋白质的盐析作用（一）蛋白质的盐析作用（一）蛋白质的盐析作用1 1、取取试试管管1 1支支，加加蛋蛋白白液液2ml2ml，然然后后加加固固体体硫硫酸酸铵铵(加加的的过过程程要要缓缓慢慢，加加的的量量要要少少，随随时时摇摇匀匀），直直至至其其饱饱和和（大大约约为为50%50%）。摇摇匀匀静静置置数数

25、分钟，则有球蛋白析出。分钟，则有球蛋白析出。2 2 2 2、将上述混合液过滤。向滤液中、将上述混合液过滤。向滤液中、将上述混合液过滤。向滤液中、将上述混合液过滤。向滤液中逐渐加入少量固体硫酸铵，直至饱逐渐加入少量固体硫酸铵，直至饱逐渐加入少量固体硫酸铵，直至饱逐渐加入少量固体硫酸铵，直至饱和为止，此时析出为清蛋白。再加和为止，此时析出为清蛋白。再加和为止，此时析出为清蛋白。再加和为止，此时析出为清蛋白。再加入少量蒸馏水，观察沉淀是否溶解。入少量蒸馏水，观察沉淀是否溶解。入少量蒸馏水，观察沉淀是否溶解。入少量蒸馏水，观察沉淀是否溶解。（二）有机溶剂沉淀蛋白质（二）有机溶剂沉淀蛋白质（二）有机溶剂

26、沉淀蛋白质（二）有机溶剂沉淀蛋白质试管中加蛋白液试管中加蛋白液试管中加蛋白液试管中加蛋白液1ml1ml1ml1ml，加晶体氯化，加晶体氯化，加晶体氯化，加晶体氯化钠少许，溶解后加钠少许，溶解后加钠少许，溶解后加钠少许，溶解后加95%95%95%95%乙醇乙醇乙醇乙醇3ml,3ml,3ml,3ml,摇摇摇摇匀，观察现象。匀，观察现象。匀，观察现象。匀，观察现象。（三）重金属盐与某些有机酸沉淀（三）重金属盐与某些有机酸沉淀（三）重金属盐与某些有机酸沉淀（三）重金属盐与某些有机酸沉淀蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质1 1 1 1、取试管、取试管、取试管、取试管2 2 2 2支，各加蛋白液支，各加蛋白液支，各

27、加蛋白液支，各加蛋白液2ml2ml2ml2ml，一支管中滴加一支管中滴加一支管中滴加一支管中滴加1%1%1%1%醋酸铅溶液，另一醋酸铅溶液，另一醋酸铅溶液，另一醋酸铅溶液，另一支管中滴加支管中滴加支管中滴加支管中滴加1%1%1%1%硫酸铜溶液，至有沉硫酸铜溶液，至有沉硫酸铜溶液，至有沉硫酸铜溶液，至有沉淀产生。淀产生。淀产生。淀产生。2 2 2 2、取一支试管加蛋白液、取一支试管加蛋白液、取一支试管加蛋白液、取一支试管加蛋白液2ml2ml2ml2ml，再加，再加，再加，再加入入入入10%10%10%10%三氯乙酸三氯乙酸三氯乙酸三氯乙酸1ml1ml1ml1ml，充分混匀，观，充分混匀，观，充分

28、混匀，观，充分混匀，观察结果。察结果。察结果。察结果。（四）生物碱试剂沉淀蛋白质（四）生物碱试剂沉淀蛋白质（四）生物碱试剂沉淀蛋白质（四）生物碱试剂沉淀蛋白质取一支试管，加入蛋白液取一支试管，加入蛋白液取一支试管，加入蛋白液取一支试管，加入蛋白液2ml2ml2ml2ml及醋及醋及醋及醋酸酸酸酸4-54-54-54-5滴，再加饱和苦味酸数滴，滴，再加饱和苦味酸数滴，滴，再加饱和苦味酸数滴，滴，再加饱和苦味酸数滴，观察现象。观察现象。观察现象。观察现象。蛋白质的颜色反应蛋白质的颜色反应蛋白质的沉淀蛋白质的沉淀http:/222.195.234.199/openclass登录名：自己的学号密码：自己

29、的学号大家先把电子版的实验报告作好，然后在周五或周六以后再上传文件实验报告要求：1目的2原理3实验仪器4实验试剂5实验步骤6实验结果7实验分析下次实验：血糖的定量测定-folin-wu法Folin-WuFolin-Wu法法定量测定血糖的含量定量测定血糖的含量1.1.氧化供能氧化供能 2.2.人体的主要组成成分之一人体的主要组成成分之一 糖糖蛋蛋白白、糖糖脂脂、蛋蛋白白多多糖糖、核核糖糖；转转化化成成脂脂肪肪和某些非必需氨基酸等和某些非必需氨基酸等3.3.糖代谢紊乱糖代谢紊乱供能障碍供能障碍一系列代谢变化一系列代谢变化 糖的重要生理功能糖的重要生理功能：血糖及血糖水平的概念：血糖及血糖水平的概念

30、血糖：血糖：指血液中的单糖：葡萄糖指血液中的单糖：葡萄糖血糖水平：血糖水平：血浆中葡萄糖浓度血浆中葡萄糖浓度血糖总维持在恒定水平：血糖总维持在恒定水平：3.93.96.7mmol/L6.7mmol/L 血糖的来源和去路血糖的来源和去路血糖测定的目的和意义血糖测定的目的和意义临床：临床：血糖检测是目前诊断糖代谢异常相关疾病的血糖检测是目前诊断糖代谢异常相关疾病的主要依据。主要依据。科研：科研：在代谢疾病的研究中，常测定血糖。在某些在代谢疾病的研究中，常测定血糖。在某些药物的研究中，也涉及血糖的测定。药物的研究中，也涉及血糖的测定。v调节血糖水平的激素：调节血糖水平的激素：胰岛素、胰高胰岛素、胰

31、高血糖素、糖皮质激素和肾上腺素。血糖素、糖皮质激素和肾上腺素。v血糖水平异常：血糖水平异常：高血糖及糖尿病；高血糖及糖尿病；低血糖低血糖 高血糖症：高血糖症：指空腹血糖浓度超过7.3mmol/L,有生理性和病理性之分，临床上最常见的病理性高血糖症是糖尿病。糖尿病：糖尿病：是一种慢性、复杂的代谢紊乱性疾病,系胰岛素绝对不足或相对不足，以高血糖症为基本生化特点。同时伴有糖、脂类、蛋白质、水、电解质和酸碱平衡紊乱，甚至出现一系列并发症如眼、肾的微血管病变及神经病变等。症状随机血浆葡萄糖症状随机血浆葡萄糖 11.1mmol/L,11.1mmol/L,或空腹或空腹血浆葡萄糖血浆葡萄糖 7.0mmol/L

32、 7.0mmol/L。症状不典型者需另。症状不典型者需另一天再次证实。随机血糖是指一天中的任一时一天再次证实。随机血糖是指一天中的任一时间采血测得的血糖浓度。间采血测得的血糖浓度。糖尿病典型的症状是糖尿病典型的症状是“三多一少三多一少”，即多饮即多饮、多尿、多食及消瘦多尿、多食及消瘦糖尿病的诊断标准糖尿病的诊断标准血糖的测定方法血糖的测定方法测定测定方法方法酶法：酶法：（1 1）己糖激酶法（）己糖激酶法（HKHK）（2 2）葡萄糖氧化酶法（）葡萄糖氧化酶法（GODGOD法）法）特异性高，灵敏度高，干扰因素少特异性高，灵敏度高，干扰因素少，适用于自动化适用于自动化分析，为葡萄糖测定的分析，为葡萄

33、糖测定的参考方法参考方法，但是试剂较贵但是试剂较贵无机化学法：无机化学法：Folin-WuFolin-Wu法，特异性差法，特异性差有机化学法：有机化学法：邻甲苯胺法、联苯胺法、氨基联苯法邻甲苯胺法、联苯胺法、氨基联苯法干扰因素多干扰因素多掌握掌握FolinFolinWuWu法测定血糖含量的原理和方法。法测定血糖含量的原理和方法。学会制备无蛋白血滤液。学会制备无蛋白血滤液。掌握掌握72007200型可见分光光度计的使用方法型可见分光光度计的使用方法。一一、目的要求目的要求二、实验原理二、实验原理葡萄糖是一种多羟基的醛类化合物。其醛基具有还原性，葡萄糖是一种多羟基的醛类化合物。其醛基具有还原性，与

34、碱性铜试剂混合加热，葡萄糖分子中的醛基被氧化成羧与碱性铜试剂混合加热，葡萄糖分子中的醛基被氧化成羧基基，CuCu2+2+即被葡萄糖还原成即被葡萄糖还原成CuCu+（CuCu2 2O O）而沉淀。）而沉淀。Cu Cu2+2+(CuSO(CuSO4 4)+)+葡萄糖葡萄糖 Cu Cu+（CuCu2 2O O）无蛋白血滤液中的葡萄糖和酸性钼酸盐溶液共热反应无蛋白血滤液中的葡萄糖和酸性钼酸盐溶液共热反应,CuCu2 2O O又把酸性钼酸试剂（又把酸性钼酸试剂（MoMo6+6+）还原成低价的蓝色钼化合物）还原成低价的蓝色钼化合物钼蓝钼蓝 。CuCu2 2O+O+酸性钼酸试剂酸性钼酸试剂 蓝色钼化合物蓝色

35、钼化合物 OD OD420420比色比色 血滤液中葡萄糖的含量与产生的血滤液中葡萄糖的含量与产生的CuCu2 2O O成正比，而成正比，而CuCu2 2O O的量的量与产生的钼化合物的量成正比。可用比色法定量的测定。与产生的钼化合物的量成正比。可用比色法定量的测定。三、实验仪器三、实验仪器1 1、25mL25mL血糖管血糖管3 3支；支；2 2、血糖管橡胶塞、血糖管橡胶塞3 3个；个；3 3、沸水浴小锅沸水浴小锅1 1个个；4 4、100mL100mL锥形瓶锥形瓶2 2个；个；5 5、电炉、电炉1 1个；个；6 6、滤纸、滤纸1 1盒；盒；7 7、吸耳球、吸耳球2 2个；个；8 8、72007

36、200型分光光度计型分光光度计1 1台台;血糖管血糖管7200型分光光度计型分光光度计 1 1、标准葡萄糖溶液（、标准葡萄糖溶液（0.1mg/ml0.1mg/ml）(1)1%(1)1%葡萄糖母液：称取葡萄糖母液：称取1.000g1.000g葡萄糖，溶于蒸馏水，稀释并定容至葡萄糖，溶于蒸馏水，稀释并定容至100ml100ml。(2)(2)葡萄糖标准液：取葡萄糖标准液：取1.0ml1.0ml葡萄糖母液于葡萄糖母液于100ml100ml容量瓶中，加蒸馏水定容。容量瓶中，加蒸馏水定容。2 2、10%10%钨酸钠溶液：钨酸钠溶液：称取钨酸钠称取钨酸钠10g10g，溶于蒸馏水并定容至，溶于蒸馏水并定容至1

37、00100毫升。毫升。3 3、0.33mol/LH0.33mol/LH2 2SOSO4 4溶液：溶液：于于53ml53ml蒸馏水中加入蒸馏水中加入1ml1ml的浓硫酸。的浓硫酸。4 4、碱性硫酸铜溶液、碱性硫酸铜溶液 A A液：无水碳酸钠液：无水碳酸钠35g35g，酒石酸钠，酒石酸钠13g13g及碳酸氢钠及碳酸氢钠11g11g溶于蒸馏水，稀释溶于蒸馏水，稀释定容至定容至1000ml.1000ml.B B液：硫酸铜晶体液：硫酸铜晶体5g5g，溶于蒸馏水并定容至，溶于蒸馏水并定容至100ml100ml。临用时，临用时，A A液：液：B B液液=9=9：1 1混合（体积比），混合液于冰箱中保存混合（

38、体积比），混合液于冰箱中保存（44）。）。四、实验试剂四、实验试剂5 5、酸性钼酸盐溶液：、酸性钼酸盐溶液：称取钼酸钠称取钼酸钠600g,600g,用少量蒸馏水溶解后倾入用少量蒸馏水溶解后倾入2000ml 2000ml 的容量瓶中，加蒸的容量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀，倾入另一较大的试剂瓶中，加溴水馏水至刻度，摇匀，倾入另一较大的试剂瓶中，加溴水0.5ml0.5ml，摇匀，摇匀，静止数小时后取上清夜静止数小时后取上清夜500ml500ml，于，于1000ml1000ml容量瓶中，徐徐加入容量瓶中，徐徐加入225ml85%225ml85%磷酸，边加边摇匀，再加磷酸，边加边摇匀，再加25%25%硫

39、酸硫酸150ml150ml。置暗处次日，用空气将剩余的溴赶去。然后加置暗处次日，用空气将剩余的溴赶去。然后加99%99%醋酸醋酸75ml75ml，摇匀，摇匀，用蒸馏水稀释定容至用蒸馏水稀释定容至1000ml,1000ml,贮于棕色瓶中。贮于棕色瓶中。四、实验试剂四、实验试剂1 1、无蛋白血滤液的制备、无蛋白血滤液的制备：用用5ml5ml移移液液管管吸吸取取全全血血（已已加加抗抗凝凝剂剂）1ml,1ml,缓缓缓缓放放入入100ml100ml锥锥形形瓶瓶中中，加加蒸蒸馏馏水水7ml7ml，摇摇匀匀，溶溶血血后后（血血液液变为红色透明）加变为红色透明）加10%10%钨酸钠钨酸钠1ml1ml，摇匀，摇

40、匀.。再再加加0.33mol/L 0.33mol/L H H2 2SOSO4 41ml1ml，边边加加边边摇摇，加加毕毕充充分分摇摇匀匀，放放置置5 51515分分钟钟，至至沉沉淀淀变变为为暗暗棕棕色色（如如不不变变色色可可再再加加0.33mol/L H0.33mol/L H2 2SOSO4 41-21-2滴）。滴）。用用干干滤滤纸纸过过滤滤。先先倾倾入入少少许许，待待滤滤纸纸湿湿润润后后在在全全部部倒倒入入，如如滤滤液液不不清清需需重重新新过过滤滤。每每毫毫升升无无蛋蛋白白血血滤滤液液相相当于当于1/10ml1/10ml全血。全血。五、实验步骤五、实验步骤2 2、血糖的定量测定：、血糖的定量

41、测定：取取25ml25ml的血糖管的血糖管3 3支，编号。第一支血糖管中加入支，编号。第一支血糖管中加入2ml2ml蒸馏水蒸馏水（空白管）；第二支血糖管中加（空白管）；第二支血糖管中加2ml2ml标准葡萄糖液；用吸管标准葡萄糖液；用吸管吸取无蛋白血滤液吸取无蛋白血滤液2ml2ml，放入第三支血糖管中。，放入第三支血糖管中。然后向三支血糖管中各加入然后向三支血糖管中各加入2ml2ml新配制的碱性硫酸铜溶液，新配制的碱性硫酸铜溶液，同时置于沸水浴中同时置于沸水浴中8 8分钟，取出，在流水中迅速冷却后分钟，取出，在流水中迅速冷却后,勿摇勿摇动动，各加，各加4ml4ml酸性钼酸盐溶液。酸性钼酸盐溶液。

42、一分钟后，用蒸馏水稀释至一分钟后，用蒸馏水稀释至25ml25ml，混匀，用，混匀，用72007200分光光度计分光光度计在在420nm420nm波长处比色，以空白管调节零点。波长处比色，以空白管调节零点。按下式计算按下式计算100ml100ml全血中所含血糖的含量全血中所含血糖的含量m=Am=A1 1/A/A0 0C C0 00.1100100式中式中:m m=100ml=100ml全血中含血糖毫克数全血中含血糖毫克数;C C0 0=标准液葡萄糖含量标准液葡萄糖含量（0.1mg/ml0.1mg/ml）；A A1 1=样品液光吸收值样品液光吸收值;A A0 0=标准液光吸收值标准液光吸收值 0.

43、10.1：1ml1ml无蛋白血溶液相对于无蛋白血溶液相对于0.1ml0.1ml全血全血六、结果计算六、结果计算：空白管标准管（A0）样品管（A1）OD4200OD4200OD4200OD平均0七、思考题七、思考题实验过程中那些操作可能影响实验结果的实验过程中那些操作可能影响实验结果的准确性？准确性？实验中，血糖管有什么作用？实验中，血糖管有什么作用？实验过程中，为什么要用流水冷却加入碱实验过程中，为什么要用流水冷却加入碱性硫酸铜液反应后的血糖管？性硫酸铜液反应后的血糖管？注意事项注意事项：1.1.加硫酸、钨酸钠时，要边加边摇匀加硫酸、钨酸钠时，要边加边摇匀2.2.沉淀由鲜红变为暗棕色，是因钨酸

44、钠与硫酸生成钨酸，在沉淀由鲜红变为暗棕色，是因钨酸钠与硫酸生成钨酸，在适当酸度时，使血红蛋白变性沉淀，如果沉淀不变暗棕色或适当酸度时，使血红蛋白变性沉淀，如果沉淀不变暗棕色或重新过滤后仍混浊，是因为血液中所加抗凝剂过多，可以加重新过滤后仍混浊，是因为血液中所加抗凝剂过多，可以加入入1010硫酸硫酸1-21-2滴，待暗棕色后再过滤。滴，待暗棕色后再过滤。3.3.用定量滤纸过滤后应该得到完全澄清无色之无蛋白血滤液。用定量滤纸过滤后应该得到完全澄清无色之无蛋白血滤液。如果得到仍带有红色的血滤液则说明蛋白质未被完全去除。如果得到仍带有红色的血滤液则说明蛋白质未被完全去除。五、实验步骤五、实验步骤1 1

45、无蛋白血滤液的制备、无蛋白血滤液的制备：蒸馏水蒸馏水7ml 7ml 摇匀摇匀 10%10%钨酸钠钨酸钠1ml 1ml 摇匀摇匀 0.33mol/L 0.33mol/L H H2 2SOSO4 41ml 1ml 边加边摇边加边摇,加毕充分摇匀加毕充分摇匀 放置放置515分分(沉淀变为暗棕色沉淀变为暗棕色)(如不如不变色色,再加再加0.33mol/L H2SO412滴滴)干滤纸过滤干滤纸过滤 无蛋白血滤液无蛋白血滤液(每毫升相当于每毫升相当于1/10ml1/10ml全血全血)20ml20ml锥形瓶锥形瓶溶血溶血(变为红色透明变为红色透明)用用5ml5ml移液管移液管取全血取全血1ml1ml（已加

46、抗凝剂（已加抗凝剂2、血糖的定量测定：、血糖的定量测定：1 1号管号管2ml2ml蒸蒸馏水水2ml2ml新新配制的配制的碱性硫碱性硫酸酸铜溶溶液液同同时置置于沸水于沸水浴中浴中8min8min，取出取出在流水在流水中迅速中迅速冷却冷却4ml4ml酸酸性性钼酸酸盐溶液溶液一分一分钟后，用后，用蒸蒸馏水水稀稀释至至25ml25ml，混匀混匀用用72207220分分光光度光光度计在在420420波波长处比色比色,以以空白管空白管调节零点零点2 2号管号管2ml2ml标准葡萄糖准葡萄糖液液3 3号管号管2ml2ml无蛋白血无蛋白血滤液液m=OD1/OD2 C 10 100分光光度计的工作原理分光光度计

47、的工作原理朗伯朗伯-比尔定律比尔定律朗伯定律朗伯定律：A=kA=k1 1L L 比尔定律比尔定律：A=kA=k2 2C C朗伯朗伯-比尔定律比尔定律：如同时考虑液：如同时考虑液层厚度和溶液浓度对吸光度的层厚度和溶液浓度对吸光度的影响，则吸光度与溶质的浓度影响，则吸光度与溶质的浓度和溶液的厚度的乘积成正比。和溶液的厚度的乘积成正比。A=KLC A=KLC 朗伯朗伯-比尔定律应用比尔定律应用A A标标=KC=KC标标L LA A样样=KC=KC样样L L 标准品法测定未知样品含量标准品法测定未知样品含量C C样样=A A样样A A标标C C标标72007200型分光光度计的操作程序型分光光度计的操

48、作程序连接仪器电源线，确定仪器供电电源有良好的接地性能。连接仪器电源线，确定仪器供电电源有良好的接地性能。接通电源，使仪器预热接通电源，使仪器预热2020分钟。分钟。用用键设置测试方式：投射比（键设置测试方式：投射比（T T），吸光度（），吸光度（A A），），已知标准样品浓度值方式（已知标准样品浓度值方式（C C）和已知标准样品斜率（）和已知标准样品斜率（F F）方式。方式。用波长选择旋钮设置您所需的分析波长用波长选择旋钮设置您所需的分析波长。将参比样品溶液和被测样将参比样品溶液和被测样品溶液分别倒入比色皿中，品溶液分别倒入比色皿中，打开样品室盖，将盛有溶打开样品室盖，将盛有溶液的比色皿分别

49、插入比色液的比色皿分别插入比色皿槽中，盖上样品室盖。皿槽中，盖上样品室盖。一般情况下，参比样品放一般情况下，参比样品放在第二个槽位中。在第二个槽位中。将将0 0T T校具（黑体）置入校具（黑体）置入光路中，在光路中，在T T方式下按方式下按“0 0T T”键，此时显示器显示键，此时显示器显示“000.0000.0”按按 MODE MODE键选择键选择A A模式模式将参比样品拉入光路中，将参比样品拉入光路中，按按“0A/1000A/100T T”键调键调0A/1000A/100T T，此时显示器，此时显示器显示的显示的“BLABLA”直至显示直至显示“0.0000.000”A A为止。为止。当仪

50、器显示器显示出当仪器显示器显示出“0.0000.000”A A后，将被测样后，将被测样品推入光路，这时，您便品推入光路，这时，您便可从显示器上得到被测样可从显示器上得到被测样品的吸光度。品的吸光度。分光光度计的使用注意事项分光光度计的使用注意事项:比比色色皿皿的的清清洁洁程程度度，直直接接影影响响实实验验结结果果。因因此此，特特别要将比色皿清洗干净。别要将比色皿清洗干净。装装样样前前处处理理：自自来来水水反反复复冲冲洗洗蒸蒸馏馏水水漂漂洗洗2 2次次待待装溶液漂洗装溶液漂洗2 2次。次。用用完完后后用用自自来来水水和和蒸蒸馏馏水水洗洗净净并并用用檫檫镜镜纸纸檫檫干干放放回回比色皿盒中。比色皿盒