TRIzol法同时提取RNADNA蛋白质.docx

《TRIzol法同时提取RNADNA蛋白质.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《TRIzol法同时提取RNADNA蛋白质.docx（6页珍藏版）》请在三一文库上搜索。

1、TRIzol试剂适用于从细胞和组织中快速分离RNA。TRIzol试剂有多组分分离作用，与 其他方法如硫氰酸胍/酚法、酚/SDS法、盐酸胍法、硫氰酸胍法等相比，最大特点是可同时 分离一个样品的RNADNA蛋白质.TRIzol使样品匀浆化，细胞裂解，溶解细胞内含物，同 时因含有RNase抑制剂可保持RNA的完整性。在加入氯仿离心后，溶液分为水相和有机 相，RNA在水相中。取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA；用乙醇沉淀中间层可回收DNA； 用异丙醇沉淀有机相可回收蛋白质。TRIzol试剂可用于小量样品（50100mg组织、5x106细胞）也适用于大量样品（1g 组织、 107细胞）。对人，动物，植物组

2、织，细菌均适用，可同时处理大量不同样品，整 个提取过程在一小时内即可完成。分离的总RNA无蛋白质和DNA污染，可用于Northern Blot，dot blot，ployA筛选，体外翻译，RNase保护分析和分子克隆。在用于RT-PCR时 如果两条引物存在于一个单一外显子内，建议用无RNase的DNase I处理RNA样品，避 免出现假阳性。共纯化的DNA可用作标准，比较不同样品RNA的得率，也可用于PCR和 酶切。蛋白质可用于 Western Blotting。规格：100ml黄色透明液体储存条件：28C避光保存12个月 注意：请勿直接接触皮肤或吞咽，以免灼伤。如接触皮肤应立即用洗涤剂和大量

3、水冲洗。 忌用乙醇擦洗，乙醇会加重灼伤程度。预防 RNase 污染注意事项：1经常更换新手套，皮肤上常带有的细菌，霉菌可能成为RNase的来源。2使用灭过菌的RNA专用塑料制品避免交叉污染。3.RNA在TRIzol试剂中时不会被RNase污染，但提取后继续处理过程中应使用不含 RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150C烘烤4小时，塑料制品可在0.5M NaOH 中浸泡 10 分钟，然后用水彻底清洗，高压灭菌，即可去除 RNase。4配制溶液应使用无RNase的水（将水加入处理过不含RNase的玻璃瓶中，加入DEPC 至终浓度0.01%v/v，放置过夜，高压灭菌注：DEPC有致癌之嫌，需小

4、心操作）。RNA 的提取准备试剂：氯仿，异丙醇，75%乙醇，无RNase的水或0.5%SDS （溶液均需用DEPC 处理过的水配制）。操作步骤：1. 匀浆处理：a.组织将组织在液氮中磨碎，每50100mg组织加入1ml TRIzol,用匀浆仪进行匀浆 处理。样品体积不应超过TRIzol体积10%。b.单层培养细胞 直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞，每10cm2面积（即3.5cm直 径的培养板）加1ml,用移液器吸打几次。TRIzol的用量应根据培养板面积而定，不取决于 细胞数。TRIzol加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染。C.细胞悬液离心收集细胞，每510x106动物、植物、酵母

5、细胞或1x107细菌细胞加入 ImlTRIzol,反复吸打。加TRIzol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。一些酵母和细菌细 胞需用匀浆仪处理。2将匀浆样品在室温（1530C）放置5分钟，使核酸蛋白复合物完全分离。3. 可选步骤：如样品中含有较多蛋白质，脂肪，多糖或胞外物质（肌肉，植物结节部 分等）可于28C10000xg离心10分钟，取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜，多 糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。处理脂肪组织时，上层有大量油脂应去除。取澄清 的匀浆液进行下一步操作。4. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15秒，室温放置3分钟。5. 2-8C10000xg

6、 离心15分钟。样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相 和一个中间层。RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的60%。6. 把水相转移到新管中，如要分离DNA和蛋白质可保留有机相，进一步操作见后。 用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1mlTRIzol加入0.5ml异丙醇，室温放置10分钟。7. 28C10000xg离心10分钟，离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现 胶状沉淀。移去上清。8. 用75%乙醇洗涤RNA沉淀。每使用1ml TRIzol至少加1ml 75%乙醇。28C不超 过 7500xg 离心 5 分钟，弃上清。9室温放置干燥或真空抽干RNA沉淀，大约

7、晾510分钟即可不要真空离心干燥， 过于干燥会导致RNA的溶解性大大降低。加入25200pl无RNase的水或0.5%SDS,用 枪头吸打几次，5560C放置10分钟使RNA溶解。如RNA用于酶切反应，勿使用SDS 溶液。RNA也可用100%的去离子甲酰胺溶解，-70C保存。注意事项：1从少量样品（110mg组织或102104细胞）中提取RNA时可加入少许糖原以促 进RNA沉淀。例如加800mlTRIzol匀浆样品，沉淀RNA前加510pgRNase-free糖原。 糖原会与RNA一同沉淀出来，糖原浓度不高于4mg/ml是不影响第一链的合成，也不影响 PCR 反应。2匀浆后加氯仿之前样品可以在

8、60至-70C保存至少一个月。RNA沉淀可以保存于75% 酒精中28C星期以上或-5至-20C年以上。3.分层和RNA沉淀时也可使用台式离心机，2600xg离心3060分钟。预期产量：1mg组织或1x106细胞提取RNA分别为：肝和脾610pg，肾34pg，骨骼肌和脑组织11.5pg，胎盘14pg，上皮细 胞815pg，成纤维细胞57pg。常见问题分析：得率低：A. 样品裂解或匀浆处理不彻底。B. RNA沉淀未完全溶解。A260/A2801.65 ：A. 检测吸光度时，RNA样品没有溶于水，而溶于了 TE中。低离子浓度和低pH值条件 下 A280 值偏高。B. 样品匀浆时加的试剂量太少。C.

9、 匀浆样品时未在室温放置5分钟。D. 吸取水相时混入了有机相。E. RNA沉淀未完全溶解。RNA降解：A. 组织取出后没有马上处理或冷冻。B. 待提取RNA的样品没有保存于-60 至-70C,而保存在了-5至-20C。C. 细胞在用胰酶处理时过度。D. 溶液或离心管未经RNase去除处理。E. 电泳时使用的甲醛pH值低于了 3.5。DNA污染：A. 样品匀浆时加的试剂量太少。B. 样品中含有有机溶剂（如乙醇，DMSO等），强缓冲液或碱性溶液。蛋白聚糖和多糖污染：沉淀RNA的过程中作以下改进可去除这些污染，步骤7中，每使用1ml TRIzol在水相 中加0.25ml异丙醇和0.25ml高盐溶液（

10、0.8M柠檬酸钠和1.2MNaCI）混合离心，按之前 操作进行。这种方法可使蛋白聚糖和多糖留在溶液中，高效沉淀出纯RNA。从含有大量多 糖的植物中提取RNA时应在匀浆后离心，并加上以上操作步骤。DNA的分离准备试剂：乙醇0.1M柠檬酸钠（含10%乙醇）75%乙醇8mM NaOH操作步骤：1. 样品加氯仿分层后，移去上层水相，用乙醇沉淀中间层和有机相中的DNA。每使用 ImITRIzol加0.3ml无水乙醇混匀，室温放置3分钟，28C不超过2000xg离心5分钟。2. 移去上清，（如需分离蛋白质，可保留，进一步操作见后）用含 10%乙醇的 0.1M 柠檬酸钠洗涤DNA沉淀。每用ImITRIzol

11、加入1ml柠檬酸钠，室温放置30分钟，28C 2000xg 离心5 分钟，弃上清，重复一次。3. 用75%乙醇再洗一遍DNA沉淀，每用1ml TRIzol加入1.52 ml75%乙醇，室温放 置 1020 分钟（不时颠倒混合） 28C2000xg 离心5 分钟， 弃上清。4. 室温放置晾干DNA 515分钟，用8mM NaOH溶解DNA。从5070mg组织或 107细胞中分离的DNA溶于300600pl 8mM NaOH, DNA的浓度通常为0.20.3pg/pl。 提取的DNA沉淀不易溶于水和Tris缓冲液中，建议用弱碱溶解,8mMNaOH的pH值为9， 溶解DNA后可用TE，HEPES调节

12、pH。从某些样品（尤其是组织）中提取的DNA中可能 包含一些胶状不溶物可12000xg离心10分钟除去。DNA的定量：取一份溶于8mMNaOH的DNA加水测A260值。一单位A260值相当 于50pg/ml双链DNA。根据DNA产量可估计细胞数，人、大鼠、小鼠1x106二倍体细胞 含 DNA 的量分别为 7.1pg，6.5pg，5.8pg。预期产量：1mg组织或1x106细胞提取DNA分别为肝和肾34pg骨骼肌，脑组织， 胎盘23pg人，大鼠，小鼠培养细胞（1x106） 57pg成纤维细胞57pg。应用：1. 用于 PCR 溶于 8mM NaOH 的 DNA用 0.1M HEPES 调 pH

13、至 8.4,取 0.1 1pg DNA 用作模板。2. 酶切反应用HEPES或1mM EDTA调节pH至适当值。每pg DNA使用35单位的 酶，8090%的DNA是可消化的。1ml 8mM NaOH溶解的DNA样品pH值调节Final pH 0.1M HEPES（pl） Final pH 1M HEPES（pl）8.4 86 7.2 238.2 93 7.0 328.0 1017.8 1177.5 159注意事项：1. DNA在中间层和有机相中时可在28C保存过夜。2. DNA沉淀在75%乙醇中28C可保存几个月。3. DNA在8mM NaOH溶液中4C可放置过夜，如长期保存需用HEPES调

14、节pH至7 8并且加EDTA至1mM,可置于4C或-20C长期保存。常见问题分析：得率低：A. 样品匀浆和裂解的不彻底。B. 最终得到的DNA沉淀没有完全溶解。A260/A2801.70 ：A. 检测吸光度时，RNA样品没有溶于水，而溶于了 TE中。B. 酚除去的不彻底，可用0.1M柠檬酸钠（含10%乙醇）再洗一遍DNA沉淀。DNA降解：A. 组织取出后没有马上处理或冷冻。B. 待提取RNA的样品没有保存于-60至-70C,而保存在了-5至-20C。C. 样品匀浆时使用了高速匀浆仪。RNA污染：A. 氯仿分层后水相去除的不干净。B. DNA沉淀用0.1M柠檬酸钠（含10%乙醇）洗的不彻底。蛋白

15、质的提取准备试剂：异丙醇含0.3M盐酸胍的95%乙醇无水乙醇1%SDS。操作步骤：1取沉淀DNA后剩余的上清，用异丙醇沉淀蛋白质。每使用1ml TRIzol加1.5ml异丙 醇，室温放置10分钟，28C12000xg离心10分钟弃上清。2用含0.3M盐酸胍的95%乙醇洗涤蛋白质沉淀。每使用1mlTRIzol加2ml洗涤液， 室温放置 20 分钟， 28C7500xg 离心 5 分钟，弃上清，重复两次。用 2ml 无水乙醇同样 方法再洗一次。3真空抽干蛋白质沉淀510分钟，用1%SDS溶解蛋白质，反复吸打，50C温浴使 其完全溶解，不溶物28C10000xg离心10分钟除去。分离得到的蛋白质样品可用于 Western Blot 或-5 至-20 C保存备用。注意事项：1蛋白质沉淀可保存在含0.3M盐酸胍的95%乙醇或无水乙醇中28C一个月以上或 -5至-20C年以上。2.用0.1% SDS在28C透析三次，10000xg离心10分钟取上清即可用于Western Blot。常见问题分析：得率低：A. 样品裂解或匀浆处理不彻底。B. 最后得到的蛋白质沉淀未完全溶解。蛋白质降解：组织取出后没有马上处理或冷冻。电泳时条带变形：蛋白质沉淀洗涤不充分。