口腔微生物分子生物学.ppt

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1、口腔疾病分子生物学第一节第一节 分子遗传学基础分子遗传学基础一、生命的主要遗传物质一、生命的主要遗传物质-DNA（一）对遗传物质的认识（一）对遗传物质的认识什么是遗传物质？什么是遗传物质？蛋白质蛋白质 20种氨基酸种氨基酸DNA 四种碱基四种碱基转化实验的结果说明转化实验的结果说明（二）核酸的组成、分布及基本化学结构（二）核酸的组成、分布及基本化学结构l 核酸是一种高分子化合物，它的核酸是一种高分子化合物，它的基本单体是核苷酸。基本单体是核苷酸。l每一个核苷酸由三部分组成，一个每一个核苷酸由三部分组成，一个磷分子，一个糖分子，一个碱基。磷分子，一个糖分子，一个碱基。l根据核苷酸的组成，核酸分为

2、脱氧根据核苷酸的组成，核酸分为脱氧核糖核酸和核糖核酸。核糖核酸和核糖核酸。DNA与与RNA的区别的区别糖糖碱基碱基结构结构DNARNA脱氧核糖脱氧核糖核糖核糖腺嘌呤腺嘌呤 胞嘧啶胞嘧啶腺嘌呤腺嘌呤 胞嘧啶胞嘧啶鸟嘌呤鸟嘌呤 胸腺嘧啶胸腺嘧啶鸟嘌呤鸟嘌呤 尿嘧啶尿嘧啶双链双链单链单链（三）（三）DNA结构的推衍结构的推衍Chargaff:T+C=A+G A=T G=CX线衍射：线衍射：DNA在两条链组成，相互平行在两条链组成，相互平行二、二、DNA复制复制（一）（一）DNA复制中的几个概念复制中的几个概念1.复制子（复制子（replicon）DNA复制是与细胞的分裂相联系的，主要表现在复制是与细

3、胞的分裂相联系的，主要表现在DNA复制的起始就意味着将要进行下一次分裂。在复制的起始就意味着将要进行下一次分裂。在DNA完完成之前，下一次细胞分裂就不会开始。成之前，下一次细胞分裂就不会开始。一个单独的一个单独的DNA复制单位称为复制子。复制单位称为复制子。每一个复制子都含有一个复制起点序列，每一个复制子都含有一个复制起点序列，又称又称复制原点复制原点，也常含有一个，也常含有一个末端序列末端序列，复制的过程在此终止。复制的过程在此终止。复制是在起始阶段控制的，一旦开始复复制是在起始阶段控制的，一旦开始复制，就会继续进行下去，直到复制完成。制，就会继续进行下去，直到复制完成。DNA多聚酶种类多聚

4、酶种类uDNA多聚酶多聚酶是是DNA复制的主要合成酶。复制的主要合成酶。u合成合成DNA 还需要下列因素：还需要下列因素：uDNA的前体材料，四种脱氧核苷三磷酸的前体材料，四种脱氧核苷三磷酸uMg+的存在的存在u一小段一小段DNA或或RNA分子的分子的3-OHu一个一个DNA模板模板uDNA多聚酶的另一个重要特征是具有多聚酶的另一个重要特征是具有3 5方向的内方向的内切酶功能。切酶功能。（二）（二）DNA复制的方式复制的方式1.半保留复制半保留复制2.半不连续复制半不连续复制半保留复制半保留复制DNA复制的特点复制的特点新合成的子代新合成的子代DNA与亲代与亲代DNA完全一样，保证了遗传的稳定

5、性。完全一样，保证了遗传的稳定性。半不连接复制半不连接复制引导链：引导链：5 3方向的方向的DNA合成合成滞后链：滞后链：3 5方向，冈崎片段方向，冈崎片段三、基因表达三、基因表达（一）（一）RNA的类型的类型发卡环：发卡环：-AUUCGGAUAAGCCU-种类种类信使信使RNA（mRNA)核蛋白体核蛋白体RNA（rRNA)转运转运RNA（tRNA)(二二)RNA的生物合成的生物合成转录转录转录转录:在在RNA多聚酶作用下，以多聚酶作用下，以DNA为为 模板合成模板合成RNA的过程。的过程。1.转录的模板和方向：转录的模板和方向：l有意义链：模板链（有意义链：模板链（3 5DNA链）链）l反义

6、链：非模板链反义链：非模板链2.RNA多聚酶与启动子多聚酶与启动子 启动子启动子：能特异性地与：能特异性地与RNA多聚酶多聚酶 结合，引发结合，引发RNA合成。合成。从从DNA上特定起始序列（启动子）上特定起始序列（启动子）开始，至终止信号结束开始，至终止信号结束3.转录的起始与延伸转录的起始与延伸4.内含子和外显子的概念内含子和外显子的概念原核生物：基因是连续的原核生物：基因是连续的DNA片段片段真核生物：基因由若干个不连续的真核生物：基因由若干个不连续的DNA片段组成的。片段组成的。内含子：插入序列，它是位于基因的内部，能够被转录内含子：插入序列，它是位于基因的内部，能够被转录的一段的一段

7、DNA。但在转录后，与之相应的那部分转录产。但在转录后，与之相应的那部分转录产物在拼接中被去掉了。物在拼接中被去掉了。外显子：基因中与成熟的外显子：基因中与成熟的mRNA相对应的相对应的DNA片段，它片段，它不仅包括蛋白质编码的部分，而且包括不仅包括蛋白质编码的部分，而且包括5和和3末端不翻末端不翻译的前导序列和尾随序列。译的前导序列和尾随序列。釉原蛋白基因表达示意图釉原蛋白基因表达示意图（三）蛋白质的生物合成（三）蛋白质的生物合成翻译翻译1.遗传密码遗传密码遗传密码的性质遗传密码的性质所有的密码都是由三个连续的核苷酸所有的密码都是由三个连续的核苷酸组成，相邻的两个密码之间没有间隔组成，相邻的

8、两个密码之间没有间隔的核苷酸存在的核苷酸存在3个终止密码子个终止密码子UAA,UGA,UAG，起始，起始密码子：密码子：AUG密码子具有兼并性密码子具有兼并性通用性通用性2.蛋白质的生物合成蛋白质的生物合成翻译翻译蛋白质的合成过程蛋白质的合成过程.氨基酸活化氨基酸活化 氨基酸结合至氨基酸结合至tRNA，即氨基酸活化，由，即氨基酸活化，由氨酰氨酰-tRNA 合成酶催化。合成酶催化。氨基酸与氨基酸与tRNA结合后，由结合后，由tRNA根据遗传根据遗传密码子将氨基酸按顺序排列合成蛋白质。密码子将氨基酸按顺序排列合成蛋白质。.蛋白质合成的起始蛋白质合成的起始 蛋白质合成在核糖体上进行，核糖体由蛋白质合

9、成在核糖体上进行，核糖体由tRNA和核糖体蛋白质构成。和核糖体蛋白质构成。在细菌中，蛋白质合成的第一个氨基酸是在细菌中，蛋白质合成的第一个氨基酸是甲酰化甲硫氨酸（甲酰化甲硫氨酸（fMet)。它与相应的。它与相应的tRNA结结合成甲酰甲硫合成甲酰甲硫tRNA，只有它才能识别起始密，只有它才能识别起始密码并进入核糖体的特定部位，从而启动蛋白质码并进入核糖体的特定部位，从而启动蛋白质的合成的合成 AUG甲酰化甲硫氨酸（甲酰化甲硫氨酸（fMet).肽链的形成和延伸、合成的终止肽链的形成和延伸、合成的终止 终止码终止码UAA、UGA、UAG蛋白质合成的终止蛋白质合成的终止终止密码子终止密码子3.新生多肽

10、的加工新生多肽的加工.fMet水解水解.磷酸化、糖基化、甲基化修饰磷酸化、糖基化、甲基化修饰.信号肽信号肽 蛋白质向细胞外分泌蛋白质向细胞外分泌四、基因表达四、基因表达DNA RNA蛋白质蛋白质丰丰富富的的生生命命现现象象五、基因表达的调节五、基因表达的调节最初从一个受精卵，在个体发育过程中分化形成各种细胞最初从一个受精卵，在个体发育过程中分化形成各种细胞组织和类型，最终形成一个完整的生物体。组织和类型，最终形成一个完整的生物体。机体的每一个细胞都有一套完全相同的基因机体的每一个细胞都有一套完全相同的基因共同表达的基因共同表达的基因维持细胞基本结构、功能维持细胞基本结构、功能特异性表达的基因特

11、异性表达的基因红细胞产生血红蛋白红细胞产生血红蛋白B B淋巴细胞产生抗体淋巴细胞产生抗体成牙本质细胞分泌牙本质蛋白成牙本质细胞分泌牙本质蛋白基因表达调控的原因动力基因表达调控的原因动力细胞内细胞内细胞间细胞间或细胞与外界环境间关系的变化。或细胞与外界环境间关系的变化。基因表达调节的方式基因表达调节的方式启动子启动子强启动子与强启动子与RNA多聚酶有较强的结多聚酶有较强的结合能力，转录水平较高合能力，转录水平较高弱启动子则反之。弱启动子则反之。基因表达调节的方式基因表达调节的方式调节蛋白的作用调节蛋白的作用 负向调节负向调节 正向调节正向调节负向调节负向调节（一）乳糖操纵子学说（一）乳糖操纵子学

12、说大肠杆菌的乳酸代谢由三种酶完成大肠杆菌的乳酸代谢由三种酶完成-半乳糖苷半乳糖苷酶酶半乳糖苷渗透半乳糖苷渗透酶酶半乳糖苷乙半乳糖苷乙酰化化酶酶操纵子（操纵子（operon）几个结构基因（几个结构基因（Z）调节基因调节基因(i)操纵基因（操纵基因（o）启动子（启动子（p）（1）在无乳糖情况下，调节基因编码的阻遏蛋白可以和）在无乳糖情况下，调节基因编码的阻遏蛋白可以和操纵基因特异性结合，使操纵基因特异性结合，使RNA多聚酶不能结合半乳糖多聚酶不能结合半乳糖苷酶基因启动子上而无法转录，结构基因就被转录。苷酶基因启动子上而无法转录，结构基因就被转录。（2）当作为诱导物的乳糖存在时，乳糖能与阻遏蛋白特）

13、当作为诱导物的乳糖存在时，乳糖能与阻遏蛋白特意地结合而改变阻遏蛋白的构象，使阻遏蛋白不能与意地结合而改变阻遏蛋白的构象，使阻遏蛋白不能与操纵基因结合，因而，解除了对结构基因表达的抑制，操纵基因结合，因而，解除了对结构基因表达的抑制，于是于是-半乳糖苷半乳糖苷酶酶、半乳糖苷渗透、半乳糖苷渗透酶酶、半乳糖苷乙、半乳糖苷乙酰化化酶酶等基因被等基因被转录，进而翻而翻译。结构基因的调控有正调控和负调控两类结构基因的调控有正调控和负调控两类没有调节蛋白时操纵子内的结构基因是开启没有调节蛋白时操纵子内的结构基因是开启的，而调节蛋白出现后结构基因被关闭。这的，而调节蛋白出现后结构基因被关闭。这样的调控称为负调

14、控，如乳糖操纵子。样的调控称为负调控，如乳糖操纵子。没有调节蛋白时结构基因是关闭的，而出现没有调节蛋白时结构基因是关闭的，而出现调节蛋白后结构基因的转录开启，称为正调调节蛋白后结构基因的转录开启，称为正调控，如阿拉伯糖操纵子。控，如阿拉伯糖操纵子。（二）（二）Britten-Davidson模型模型该模型主要假定基因表达得分调节是通过控制系统来调节的。该模型主要假定基因表达得分调节是通过控制系统来调节的。新的补充和修改新的补充和修改一个特定的激活蛋白可以控制含有相应接受位点的许多结构一个特定的激活蛋白可以控制含有相应接受位点的许多结构基因的表达，即可以控制一组基因的表达。基因的表达，即可以控制

15、一组基因的表达。一个结构基因拥有不同的几个接受位点，每个接受位点受一一个结构基因拥有不同的几个接受位点，每个接受位点受一个特异性的激活因子识别，这样它可以作为不同组的成员而个特异性的激活因子识别，这样它可以作为不同组的成员而在不同的情况下表达在不同的情况下表达基因表达的调节可以通过感应位点控制不同的集成基因而达基因表达的调节可以通过感应位点控制不同的集成基因而达到。到。正向调节正向调节原核生物基因表达的调节原核生物基因表达的调节主要在转录水平主要在转录水平真核基因生物调节真核基因生物调节多层次多层次复杂性复杂性第二节第二节 分子生物学研究的主要方法分子生物学研究的主要方法一、分子克隆的材料与方

16、法一、分子克隆的材料与方法分子克隆：分子克隆：意为意为“无性克隆无性克隆”是是DNA分子的分子的无性繁殖技术。无性繁殖技术。（一）限制性内切酶（一）限制性内切酶是一类能识别双链是一类能识别双链DNA分子中特异核苷酸序列的分子中特异核苷酸序列的DNA 水解酶。水解酶。三种限速酶三种限速酶型、型、型、型、型型型限制性内切酶具有以下几个特征型限制性内切酶具有以下几个特征特定的识别序列，特定的识别序列，46个碱基对个碱基对在识别序列内固定位置切割，切割后在识别序列内固定位置切割，切割后5 端磷酸基因，端磷酸基因，3-端羟基基团端羟基基团切割后形成粘性或平齐末端切割后形成粘性或平齐末端（二）（二）DNA

17、连接酶连接酶催化催化DNA中相邻中相邻3羟基和羟基和5 磷酸基团之间形磷酸基团之间形成成3，5 磷酸二酯键。磷酸二酯键。T4 DNA 连接酶连接酶大肠杆菌连接酶大肠杆菌连接酶（三）质（三）质 粒粒概念概念细胞内独立于染色体外的环状细胞内独立于染色体外的环状DNA，能自我复制，能自我复制，在细胞分裂时可伴随染色体分配至子细胞中。在细胞分裂时可伴随染色体分配至子细胞中。特点特点其上基因可借助宿主细胞的转录、翻译系统得以其上基因可借助宿主细胞的转录、翻译系统得以表达表达分子分子200050000bpTpGEM-TVector(3003bp)AmprlacZoriXmnI 1994ScaI 1875N

18、aeI2695ApaIAatIISphIBstZINcoISacIIT7SpeINotIBstZIPstISaLINdeISacIBstXINsiISP6T 1 start14202631374655626273758294103112126 pGEM-T vector mapXhoISmaIXhoISmaIXhoISmaIpCIpCIA-PpGEM-T/A-P A-P fragmentSub-cloning construction of recombinant pCIA-P insertion of A-P DNA fragment into plasmid pCIXhoISmaIT4 L

19、igaseA-P fragment分子克隆中，分子克隆中，构建质粒的特点构建质粒的特点OriOri区区质粒复制的起点质粒复制的起点ParPar区区保证细胞分裂过程中，质粒能均匀分配保证细胞分裂过程中，质粒能均匀分配至子细胞至子细胞多克隆区多克隆区人为构建，便于克隆操作。人为构建，便于克隆操作。含有多个单一限制性内切酶酶切点。含有多个单一限制性内切酶酶切点。选择因子选择因子含特定基因，如耐抗生素基因或含特定基因，如耐抗生素基因或-半乳糖半乳糖苷酶基因（苷酶基因（lacZlacZ），使克隆后便于挑选。，使克隆后便于挑选。有的质粒载体在其基因组中含有一个大肠杆菌有的质粒载体在其基因组中含有一个大肠杆

20、菌的的lacZ区段，此区段含有编码区段，此区段含有编码-半乳糖苷半乳糖苷酶酶基基因因lacZ。在诱导物。在诱导物IPTG（异丙基硫代半乳糖苷）（异丙基硫代半乳糖苷）的存在下，的存在下，-半乳糖苷半乳糖苷酶酶能作用能作用X-gal（5-溴溴-4-氯-3吲哚-D-半乳糖苷）形成半乳糖苷）形成蓝色化合物色化合物5-溴溴-4-氯靛靛蓝。当当这种种质粒粒转化无化无lacZ基因的大肠杆菌时，由基因的大肠杆菌时，由于质粒，由于于质粒，由于.(四四)噬菌体噬菌体概念概念是侵染细菌、螺旋体、真菌等的病毒。是侵染细菌、螺旋体、真菌等的病毒。结构结构温和噬菌体和毒性噬菌体温和噬菌体和毒性噬菌体噬菌斑噬菌斑是分子生物

21、学中重要的是分子生物学中重要的DNA载体载体目前广泛使用的噬菌体有目前广泛使用的噬菌体有-噬菌体，噬菌体，M13噬菌体，噬菌体，野生的野生的-噬菌体噬菌体线状双状双链DNA分子分子在分子两端各有在分子两端各有12个碱基的个碱基的单链互互补粘性末端粘性末端当当-噬菌体噬菌体DNA被注入寄生菌被注入寄生菌细胞后，会迅速通胞后，会迅速通过黏性末端的互黏性末端的互补作用形成双作用形成双链环状状DNA。这种由黏性末端形成的双种由黏性末端形成的双链区段，称区段，称为COS位点。位点。-噬菌体噬菌体DNA包含包含约61个基因，其中一半参与了噬个基因，其中一半参与了噬菌体生命活菌体生命活动，这类基因称基因称为

22、噬菌体必要基因噬菌体必要基因另一部分基因，当它另一部分基因，当它们被外源基因取代后，并不影被外源基因取代后，并不影响噬菌体的生命功能，响噬菌体的生命功能，这类基因称基因称为非必要基因。非必要基因。野生型野生型-噬菌体本身不适合于作噬菌体本身不适合于作为载体，需要体，需要进行改行改造。造。改造后的改造后的-噬菌体噬菌体载体具有体具有在噬菌体非必要基因区制造多个在噬菌体非必要基因区制造多个单一的限制性内切一的限制性内切酶酶区，以便外源性区，以便外源性DNA片段的插入或取代。片段的插入或取代。引引进某些突某些突变以改以改变噬菌斑的噬菌斑的颜色或形色或形态，以便重，以便重组体的体的检出，如出，如-半

23、乳糖苷半乳糖苷酶酶基因区等。基因区等。通通过某些基因突某些基因突变形成安全形成安全载体，以便利用生物学体，以便利用生物学防防护等。等。（五）转化、转染、转导（五）转化、转染、转导转化转化是指受体菌捕获和表达质粒载体是指受体菌捕获和表达质粒载体DNA分子的生命过程。分子的生命过程。细菌种属及细胞壁结构的差异，转化条件和过程均不一样。细菌种属及细胞壁结构的差异，转化条件和过程均不一样。感受态。感受态。即使同一菌属中，各菌株达到感受态的的条件和时机也存即使同一菌属中，各菌株达到感受态的的条件和时机也存在差别。在差别。氯化钙处理大肠杆菌以提高细胞膜的通透性。氯化钙处理大肠杆菌以提高细胞膜的通透性。转染

24、转染专指受体菌捕获和表达噬菌体专指受体菌捕获和表达噬菌体DNA分子的过程。分子的过程。转导转导是利用噬菌体颗粒为媒介，将外是利用噬菌体颗粒为媒介，将外源源DNA转移至受体菌并得到表达转移至受体菌并得到表达的生命过程。的生命过程。二、分子克隆的主要步骤二、分子克隆的主要步骤1.基因文库的建立基因文库的建立变链菌变链菌gtf基因基因染色体切成一定长度的染色体切成一定长度的DNA片段片段DNA连接酶整合至载体（质粒或噬菌体）连接酶整合至载体（质粒或噬菌体）载体转化至大肠杆菌载体转化至大肠杆菌每一个转化的大肠杆菌含有一个重组质粒，因此就含每一个转化的大肠杆菌含有一个重组质粒，因此就含数万段重组质粒，因

25、此就含有数万段个、变链菌数万段重组质粒，因此就含有数万段个、变链菌DNA。这数万段随机的变链菌这数万段随机的变链菌DNA片段，应该包括该变链菌片段，应该包括该变链菌整个染色体。这个大肠杆菌集合体因为含有整个变链整个染色体。这个大肠杆菌集合体因为含有整个变链菌染色体而被称为变链菌的基因文库。菌染色体而被称为变链菌的基因文库。2.目的基因的筛选目的基因的筛选核酸杂交核酸杂交免疫学检测免疫学检测3.目的基因的分析目的基因的分析DNA序列序列启动子分析启动子分析推测蛋白质一级结构推测蛋白质一级结构推测蛋白质二级结构推测蛋白质二级结构三、特异性核酸的检测三、特异性核酸的检测（一）核酸分子杂交（一）核酸分

26、子杂交1.原理：原理：在一定条件下（温度、在一定条件下（温度、pH值等）值等）DNA双股螺旋可解开并分离双股螺旋可解开并分离在一定条件下，两股游离的互补的在一定条件下，两股游离的互补的核苷酸可自行配对形成双股核苷酸可自行配对形成双股2.核酸分子杂交的技术过程核酸分子杂交的技术过程（1）探针的制备）探针的制备（2）待测核酸的处理）待测核酸的处理（3）核酸杂交的类型）核酸杂交的类型点杂交点杂交Southern Blot（1）斑点杂交）斑点杂交目标序列的存在目标序列的存在目标序列的量目标序列的量（2）Southern Blot电泳、转移、杂交电泳、转移、杂交确定分子量确定分子量（二）聚合酶链反应（二

27、聚合酶链反应PCR1.PCR 原理原理2.用于用于PCR的的DNA多聚酶多聚酶3.PCR中的其他因素中的其他因素4.PCR应用应用DNA电泳电泳可分离不同分子量的可分离不同分子量的DNA Ladder 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Ladder 对临床菌株的第二次对临床菌株的第二次PCR 扩增产物电泳图谱分析扩增产物电泳图谱分析 Lane 17:临床菌株临床菌株S.sobrinus;Lane 814:临床菌株临床菌株 S.mutans.(Kb)2.01.00.250.10.750.5MW与龋病相关微生物的定量检测方法与龋病相关微生物的定量检测方法细菌形态细

28、菌形态生化反应生化反应免疫反应免疫反应分子生物学方法分子生物学方法 -分子探针杂交分子探针杂交 -RFLP -PCR唾液在与龋病相关微生物检测中的应用唾液在与龋病相关微生物检测中的应用在人类口腔中检出率很高在人类口腔中检出率很高茸毛链球菌可能比变形链球菌与龋损茸毛链球菌可能比变形链球菌与龋损活跃性之间的关系更密切活跃性之间的关系更密切变形链球菌和茸毛链球菌变形链球菌和茸毛链球菌唾液在与龋病相关微生物检测中的应用唾液在与龋病相关微生物检测中的应用套式套式PCR快速检测人类唾液中变形链快速检测人类唾液中变形链球菌和茸毛链球菌球菌和茸毛链球菌.谭海平，边专，樊明文，陈智，范兵.中华口腔医学杂志，20

29、03，38：223-226唾液在与龋病相关微生物检测中的应用唾液在与龋病相关微生物检测中的应用套式套式PCR(Nested PCR)5 3 TemplateOuter primer2Outer primer1The first PCR5 3 Inter primer2Inter primer 1Next templateThe second PCR 5 3 The second PCR product本套式本套式PCR的引物是分别根据变形链球菌的引物是分别根据变形链球菌gtfB基因基因和茸毛链球菌和茸毛链球菌gtfI基因设计的内、外两套引物基因设计的内、外两套引物（outer primer,i

30、nter primer）gtfB gene of S.mutansOuter primer thp4Outer primer thp3The first PCR Inter primer thp8Inter primer thp7Outer primer thp6gtfI gene of S.sobrinusOuter primer thp5The first PCRInter primer thp10Inter primer thp9The second PCRThe second PCR 抽提细菌染色体抽提细菌染色体DNA(Igarashi et al.1996)-细菌细菌 -唾液唾液PC

31、R反应过程反应过程 第一次第一次PCR反应反应 预变性预变性:94 4min 变性变性:94 1min 退火退火:51 1min 30cycles 延伸延伸:72 2min 最后延伸最后延伸:72 5min 第二次第二次PCR反应反应 a b c d e f g hLadder 1 2 3 4 5 6 7 8 选择外引物行第一次选择外引物行第一次PCR后扩增产物电泳图谱分析后扩增产物电泳图谱分析以变链菌组以变链菌组(Mutans Streptococci)染色体染色体 DNA为模板为模板 Lane 1:S.cricetus AHT;2.S.rattus BHT;3.S.mutans Ingbr

32、itt;4.S.sobrinus OMZ176;5.S.mutans LM-7;6.S.mutans OMZ175;7.S.sobrinus 6715;8.S.downei Mfe28.MW (Kb)2.0 1.0 0.25 0.1 0.75 0.5 a b c d e f g h Ladder 1 2 3 4 5 6 7 8 选择内引物行第二次选择内引物行第二次PCR后扩增产物电泳图谱分析后扩增产物电泳图谱分析 Lane 1:S.cricetus AHT;2.S.rattus BHT;3.S.mutans Ingbritt;4.S.sobrinus OMZ176;5.S.mutans LM-

33、7:6.S.mutans OMZ175;7.S.sobrinus 6715;8.S.downei Mfe28.Marker:DL2,000 Ladder MW (Kb)2.0 0.75 0.51.0 0.25 0.1 Ladder 1 2 3 4 5 6 第一次第一次PCR的灵敏度的灵敏度 变形链球菌变形链球菌S.mutans Ingbritt 的数量的数量 Lane1:108 CFU;Lane 2:107 CFU;Lane3:106CFU;Lane 4:105 CFUMW (Kb)2.00.75 0.51.0 0.25 2.0 0.5 Ladder 1 2 3 4 5 6 1.0 0.75

34、0.25MW(Kb)第二次第二次PCR的灵敏度的灵敏度 变形链球菌变形链球菌S.mutans Ingbritt 的数量的数量 Lane 1:104 CFU,Lane 2:103 CFU Ladder 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Ladder 对临床菌株的第二次对临床菌株的第二次PCR 扩增产物电泳图谱分析扩增产物电泳图谱分析 Lane 17:临床菌株临床菌株S.sobrinus;Lane 814:临床菌株临床菌株 S.mutans.(Kb)2.01.00.250.10.750.5MW Ladder 1 2 3 4 5 LadderMW 1.0(Kb)0.7

35、50.50.250.1 Ladder 1 2 3 4 5 LadderMW 2.0(Kb)1.00.250.10.750.5ABLane1.chromosomal DNA from S.mutans Ingbritt;2.chromosomal DNA from S.sobrinus 6715;3.saliva sample from subject A;4.saliva sample from subject B;5.saliva sample from subject C.利用利用PCR直接从唾液样本中检测变形链球菌直接从唾液样本中检测变形链球菌S.mutans和和茸毛链球菌茸毛链球菌S.sobrinus(图图A)利用外引物利用外引物(图图B)利用内引利用内引物物二、分子克隆的主要步骤二、分子克隆的主要步骤原核生物基因文库的建立原核生物基因文库的建立提取细胞提取细胞DNA限制性内切酶酶切限制性内切酶酶切DNA片段连接至质粒或噬菌体片段连接至质粒或噬菌体转化宿主细胞（大肠杆菌）转化宿主细胞（大肠杆菌）