电泳分离PPT课件.ppt

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1、第七节第七节 电泳分离电泳分离l l 电泳电泳（electrophoresis,EPelectrophoresis,EP）：l l 指带电粒子在电场中向着与其所带电指带电粒子在电场中向着与其所带电荷性质相反的电极方向移动的过程。荷性质相反的电极方向移动的过程。l l 电电泳泳技技术术是是根根据据各各种种带带电电粒粒子子在在电电场场中中迁迁移移速速度度的的不不同同而而对对物物质质进进行行分分离离的的实实验技术验技术。1 1一、电泳的基本理论一、电泳的基本理论 1.1.原理原理:在一定在一定在一定在一定pHpHpHpH条件下（用条件下（用条件下（用条件下（用bufferbufferbufferbu

2、ffer），），），），不同大小、不同大小、不同大小、不同大小、形状的带电颗粒在电场中的移动速度不同（用形状的带电颗粒在电场中的移动速度不同（用形状的带电颗粒在电场中的移动速度不同（用形状的带电颗粒在电场中的移动速度不同（用迁移率表示），各自集中到特定的位置上而形迁移率表示），各自集中到特定的位置上而形迁移率表示），各自集中到特定的位置上而形迁移率表示），各自集中到特定的位置上而形成紧密的泳动带。成紧密的泳动带。成紧密的泳动带。成紧密的泳动带。+2 2 迁移率与迁移率与内在特性内在特性和和外界条件外界条件有关有关内在特性内在特性：颗粒性质（净电荷量，颗粒大小、形状）：颗粒性质（净电荷量，颗粒大

3、小、形状）外界条件外界条件：电场强度、溶液性质、支持体特性：电场强度、溶液性质、支持体特性带电粒子在单位时间内移动的距离称为带电粒子在单位时间内移动的距离称为电泳迁移率电泳迁移率。移动速度移动速度移动速度移动速度(V)(V)(V)(V)是电场是电场是电场是电场(E)(E)(E)(E)和迁移率和迁移率和迁移率和迁移率(m)(m)(m)(m)的乘积，的乘积，的乘积，的乘积，即：即：即：即：V V V VmEmEmEmE3 3影响迁移率的因素：影响迁移率的因素：1）颗粒性质：）颗粒性质：Q越大、越大、r 越小、形状越接近球形，越小、形状越接近球形，v 越快。越快。2）电场强度：）电场强度：每厘米距离

4、的电压差，每厘米距离的电压差，E越高，越高，v越快。越快。常压电泳常压电泳 E：210V/cm 电压：电压：100500V，大分子物质分离大分子物质分离 高压电泳高压电泳 E：20200V/cm 电压电压 500V，小分子物质分离小分子物质分离3）溶液性质：）溶液性质：pH值：值：影响粒子所带净电荷量的多少，影响粒子所带净电荷量的多少，离离pI越远，越远，v越快。越快。（用（用buffer保持恒定）保持恒定）离子强度：离子强度越高，离子强度：离子强度越高，v 越低。越低。通常，缓冲液离子强度在通常，缓冲液离子强度在0.02-0.2之间。之间。4）电渗：）电渗：在电场中，液体对于固体支持物的相对

5、移动。在电场中，液体对于固体支持物的相对移动。应避免用高电渗物质作支持介质。应避免用高电渗物质作支持介质。4 4l l自由界面电泳：自由界面电泳：又称移动界面电泳又称移动界面电泳（moving moving boundary electrophoresis,MBEPboundary electrophoresis,MBEP），指在没指在没有支持介质的溶液中进行的电泳。有支持介质的溶液中进行的电泳。l l区带电泳区带电泳:（zone electrophoresis,ZEPzone electrophoresis,ZEP）指指有支持介质的电泳，待分离物质在支持介质上有支持介质的电泳，待分离物质在支

6、持介质上分离成若干区带。分离成若干区带。支持介质的作用支持介质的作用:防止电泳过程中的对流防止电泳过程中的对流和扩散。和扩散。2.电泳的分类电泳的分类5 5按按支持介质种类支持介质种类的不同，区带电泳可分为：的不同，区带电泳可分为：纸电泳纸电泳：用滤纸作为支持介质，多用于核苷酸的用滤纸作为支持介质，多用于核苷酸的用滤纸作为支持介质，多用于核苷酸的用滤纸作为支持介质，多用于核苷酸的定性定量分析。定性定量分析。定性定量分析。定性定量分析。醋酸纤维素薄膜电泳醋酸纤维素薄膜电泳：医学上，常用于分析血：医学上，常用于分析血：医学上，常用于分析血：医学上，常用于分析血清蛋白、胎盘球蛋白，优点是简便迅速，便

7、于保存清蛋白、胎盘球蛋白，优点是简便迅速，便于保存清蛋白、胎盘球蛋白，优点是简便迅速，便于保存清蛋白、胎盘球蛋白，优点是简便迅速，便于保存照相，比纸电泳分辨率高。照相，比纸电泳分辨率高。照相，比纸电泳分辨率高。照相，比纸电泳分辨率高。vv以上两种类型的电泳，由于介质的孔径度以上两种类型的电泳，由于介质的孔径度大，没有分子筛效应，主要靠被分离物的大，没有分子筛效应，主要靠被分离物的电荷多少进行分离。电荷多少进行分离。6 6琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶电电泳泳：从从琼琼脂脂中中精精制制分分离离出出的的胶胶状状多多糖，糖，一般用于核酸的分离分析。一般用于核酸的分离分析。（1）琼脂糖凝胶孔径较小，具有分子筛效

8、应；）琼脂糖凝胶孔径较小，具有分子筛效应；（2）机械强度高：可以在浓度）机械强度高：可以在浓度1%以下使用；以下使用；（3）无毒；）无毒；（4）染色、脱色程序简单，背景色较低；）染色、脱色程序简单，背景色较低；（5）热可逆性；）热可逆性；（6）生物中性：一般不与生物材料结合。）生物中性：一般不与生物材料结合。聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳：可可用用于于核核酸酸和和蛋蛋白白质质的的分分离离、纯纯化化及及检检测测。分分辨辨率率较高。较高。聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺和和琼琼脂脂糖糖是是目目前前实实验验室室最最常常用用的的两两种种支支持持介质。介质。7 7 3.电泳常用设备电泳常用设备（1）电泳仪）电

9、泳仪：为电泳提供稳定直流电源的装置为电泳提供稳定直流电源的装置。常压电泳仪常压电泳仪（600V600V）高压电泳仪高压电泳仪（3000V3000V）超高压电泳仪超高压电泳仪（30000V30000V50000V50000V）（2 2）电泳槽：电泳槽：自由界面电泳槽自由界面电泳槽 管状电泳槽管状电泳槽 板状电泳槽板状电泳槽（3 3）附属设备：）附属设备：外循环恒温系统外循环恒温系统:高电压会产生高热，需冷却。高电压会产生高热，需冷却。灌胶模具：制胶，玻璃板和梳子。灌胶模具：制胶，玻璃板和梳子。8 89 910101111二、聚丙烯酰胺凝胶电泳二、聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳（聚丙烯酰胺

10、凝胶电泳（polyacrylamidepolyacrylamide gel electrophoresisgel electrophoresis，PAGEPAGE）是以是以聚丙烯酰聚丙烯酰胺凝胶胺凝胶作为支持介质的一种电泳方法。作为支持介质的一种电泳方法。1212 1.原理原理 聚丙烯酰胺凝胶是由聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体丙烯酰胺单体（acrylamideacrylamide，简称简称AcrAcr）和交联剂和交联剂N N，N N-甲叉双丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺（methylanemethylane bisacrylamidebisacrylamide，简称简称BisBis）在在催化剂催化剂和

11、和加速剂加速剂作用下聚合的。作用下聚合的。1313CHCH2 2=CH=CHC=OC=ONHNH2 2CHCH2 2=CH=CH C=OC=O NH NH CH CH2 2 NH NH C=O C=O CH CH2 2=CH=CH-CH-CH2 2-CH-CH-CHCH2 2-CH-CH-n nCHCH2 2-CH-CH-C=O C=O C=O C=O C=O C=O NH NH2 2 NHNH2 2 NH NH CH CH2 2 NH NH C=O C=O-CH-CH2 2-CH-CH-CHCH2 2-CH-CH-n nCHCH2 2-CH-CH-C=O C=O C=O C=O NH NH

12、NH NH2 2丙烯酰胺丙烯酰胺N,NN,N-甲叉双丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺14141515（1）催化剂和加速剂的浓度：）催化剂和加速剂的浓度：浓度小易导致聚合速度慢；浓浓度小易导致聚合速度慢；浓度过大则易导致电泳时的烧胶以及电泳带的畸变；一般控制使度过大则易导致电泳时的烧胶以及电泳带的畸变；一般控制使聚合过程在聚合过程在4060分钟内完成。分钟内完成。（2）系统）系统pH值：值：酸性条件、碱性条件均可，但仍然存在一酸性条件、碱性条件均可，但仍然存在一个最佳个最佳pH值，以获得最佳的聚合结果。值，以获得最佳的聚合结果。（3）温度：）温度：低温下聚合导致凝胶变脆和混浊，适当提高

13、温度低温下聚合导致凝胶变脆和混浊，适当提高温度可以使凝胶透明而有弹性。可以使凝胶透明而有弹性。（4）分子氧：）分子氧：分子氧的存在会阻碍凝胶的化学聚合；抽气。分子氧的存在会阻碍凝胶的化学聚合；抽气。（5）系统纯度：）系统纯度：金属离子会影响凝胶的聚合。金属离子会影响凝胶的聚合。v 影响丙烯酰胺聚合的主要因素影响丙烯酰胺聚合的主要因素1616 聚丙烯酰胺凝胶聚合的催化体系有两种：聚丙烯酰胺凝胶聚合的催化体系有两种：1 1）化学催化系统：）化学催化系统：AP-TEMEDAP-TEMED 催化剂：催化剂：过硫酸铵过硫酸铵（ammonium ammonium persulfatepersulfate，

14、APAP）加速剂：加速剂：TEMEDTEMED（N N，N N，N N，N N-四甲基乙二胺）四甲基乙二胺）2 2）光催化系统：核黄素光）光催化系统：核黄素光 催化剂催化剂:核黄素（维生素核黄素（维生素B B2 2）引发剂引发剂:光光 TEMEDTEMED的存在，可加速聚合。的存在，可加速聚合。.1717聚丙烯酰胺凝胶：聚丙烯酰胺凝胶：丙烯酰胺丙烯酰胺N,NN,N甲叉双丙烯酰胺聚合而成甲叉双丙烯酰胺聚合而成1818 凝胶的机械强度、弹性和透明度、粘着度取凝胶的机械强度、弹性和透明度、粘着度取凝胶的机械强度、弹性和透明度、粘着度取凝胶的机械强度、弹性和透明度、粘着度取决于凝胶总浓度（决于凝胶总浓

15、度（决于凝胶总浓度（决于凝胶总浓度（T T T T）和交联度（和交联度（和交联度（和交联度（C C C C）。）。）。）。T=T=T=T=C=C=C=C=凝胶浓度越大（小），孔径越小（大），可分凝胶浓度越大（小），孔径越小（大），可分凝胶浓度越大（小），孔径越小（大），可分凝胶浓度越大（小），孔径越小（大），可分离分子量较小（大）的颗粒离分子量较小（大）的颗粒离分子量较小（大）的颗粒离分子量较小（大）的颗粒。AcrAcr与与与与BisBis的质量比应在的质量比应在的质量比应在的质量比应在3030左右左右左右左右。凝胶浓度和交联度与孔径大小的关系凝胶浓度和交联度与孔径大小的关系Acr（g）+Bi

16、s（g）V（ml）X100%Acr（g）+Bis（g）Bis（g）X100%1919样品样品分子量（分子量（Da）适宜的凝胶浓度（）适宜的凝胶浓度（）蛋白质蛋白质510520301520101551025聚丙烯酰胺凝胶浓度参考表聚丙烯酰胺凝胶浓度参考表20202.分离效应分离效应 PAGEPAGE根据其有无浓缩效应，分为：根据其有无浓缩效应，分为：连续电泳（连续电泳（continuous electrophoresis）采用相同孔径的凝胶和相同的缓冲系统采用相同孔径的凝胶和相同的缓冲系统不连续电泳（不连续电泳（discontinuous electrophoresis）采用不同孔径的凝胶和不同

17、缓冲体系采用不同孔径的凝胶和不同缓冲体系 电荷效应电荷效应不连续不连续PAGE PAGE 分子筛效应分子筛效应 浓缩效应浓缩效应 连续连续PAGEPAGE21211）电荷效应电荷效应:分离胶中，蛋白质表面净电荷不同，迁移率不同。分离胶中，蛋白质表面净电荷不同，迁移率不同。2）分分子子筛筛效效应应：大大小小和和形形状状不不同同的的样样品品分分子子通通过过一一定定孔孔径径的的分离胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率。分离胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率。3 3）浓浓缩缩效效应应：使使样样品品在在浓浓缩缩胶胶中中被被浓浓缩缩成成一一条条窄窄带带，然然后后再再进进入分离胶进行分离。入分

18、离胶进行分离。在直流电场作用下电泳情在直流电场作用下电泳情况示意图况示意图图中图中A，B，C均为均为阴阴离子离子分子量大小依次为分子量大小依次为MA=MBMC，所带电荷量相同所带电荷量相同QA=QB=QC。2222不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳系统的不连续性表现在以下几个方面：系统的不连续性表现在以下几个方面：系统的不连续性表现在以下几个方面：系统的不连续性表现在以下几个方面：1.1.凝胶由上、下两层凝胶组成，两层凝胶凝胶由上、下两层凝胶组成，两层凝胶凝胶由上、下两层凝胶组成，两层凝胶凝胶由上、下两层凝胶组成，两层凝胶的孔径不同，上层为大孔径的浓缩胶，的孔径不同，上层为大孔径

19、的浓缩胶，的孔径不同，上层为大孔径的浓缩胶，的孔径不同，上层为大孔径的浓缩胶，下层为小孔径的分离胶。下层为小孔径的分离胶。下层为小孔径的分离胶。下层为小孔径的分离胶。2.2.缓冲液离子组成及各层凝胶的缓冲液离子组成及各层凝胶的缓冲液离子组成及各层凝胶的缓冲液离子组成及各层凝胶的pHpHpHpH不同。不同。不同。不同。电极缓冲液为电极缓冲液为电极缓冲液为电极缓冲液为pH8.3pH8.3pH8.3pH8.3的的的的TrisTrisTrisTris-甘氨酸缓冲甘氨酸缓冲甘氨酸缓冲甘氨酸缓冲液，浓缩胶为液，浓缩胶为液，浓缩胶为液，浓缩胶为pH6.7pH6.7pH6.7pH6.7的的的的Tris-HCl

20、Tris-HClTris-HClTris-HCl缓冲液，缓冲液，缓冲液，缓冲液，而分离胶为而分离胶为而分离胶为而分离胶为pH8.9pH8.9pH8.9pH8.9的的的的Tris-HClTris-HClTris-HClTris-HCl缓冲液。缓冲液。缓冲液。缓冲液。3.3.在电场中形成不连续的电位梯度。在电场中形成不连续的电位梯度。在电场中形成不连续的电位梯度。在电场中形成不连续的电位梯度。因此，在这样一个不连续的系统里，因此，在这样一个不连续的系统里，因此，在这样一个不连续的系统里，因此，在这样一个不连续的系统里，存在三种物理效应，即存在三种物理效应，即存在三种物理效应，即存在三种物理效应，即

21、样品的浓缩效应，样品的浓缩效应，样品的浓缩效应，样品的浓缩效应，凝胶的分子筛效应和电荷效应凝胶的分子筛效应和电荷效应凝胶的分子筛效应和电荷效应凝胶的分子筛效应和电荷效应，提高了，提高了，提高了，提高了分辨率。分辨率。分辨率。分辨率。8.38.38.96.72323三、三、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE）简称简称SDS PAGE。是目前测定蛋白质亚基相对分子量是目前测定蛋白质亚基相对分

22、子量（relative molecular mass,relative molecular mass,MrMr）的一种最好的一种最好的办法的办法。2424 SDS-PAGE separates proteins by MW25251.1.原理：原理：SDS是一种阴离子去污剂，带有大量负电荷，与蛋白是一种阴离子去污剂，带有大量负电荷，与蛋白质结合后使蛋白质所带负电荷大大超过了天然蛋白质原有质结合后使蛋白质所带负电荷大大超过了天然蛋白质原有的负电荷，因而消除或掩盖了不同种类蛋白质间原有电荷的负电荷，因而消除或掩盖了不同种类蛋白质间原有电荷的差异。的差异。SDSSDS破坏蛋白质氢键、疏水键，巯基乙醇

23、使二硫键打开，破坏蛋白质氢键、疏水键，巯基乙醇使二硫键打开，引起蛋白质构象改变，使蛋白质引起蛋白质构象改变，使蛋白质SDSSDS复合物形状近似椭复合物形状近似椭圆形，短轴相同（圆形，短轴相同（1.8nm1.8nm），），长轴与蛋白质分子量成正比。长轴与蛋白质分子量成正比。因此，因此，蛋白质蛋白质SDSSDS复合物复合物(SDS-denatured protein)在在凝胶中的迁移率不受蛋白质原有电荷和形状的影响，只与凝胶中的迁移率不受蛋白质原有电荷和形状的影响，只与椭圆棒长度（蛋白质分子量）有关。椭圆棒长度（蛋白质分子量）有关。2626 两者关系：两者关系：蛋白质的迁移率与分子量的对蛋白质的迁

24、移率与分子量的对数呈线性关系，符合下式：数呈线性关系，符合下式：logMlogMW W=C-=C-bmbmM MW W：分子量；分子量；m m：迁移率；：迁移率；C C、b b均为常数均为常数 将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据其相对迁移率即质在相同条件下进行电泳，根据其相对迁移率即可在标准曲线上求得分子量。可在标准曲线上求得分子量。2727282829292.操作：操作：（SDS-PAGE及及PAGE，即变性及非变性）即变性及非变性）1）制胶制

25、胶:（变性：（变性：buffer 中加中加0.4%SDS）a.分离胶：根据待分离样品的分子大小选择一定浓度分离胶：根据待分离样品的分子大小选择一定浓度的分离胶（查表），配制分离胶溶液：的分离胶（查表），配制分离胶溶液：Acr:Bis=29:1，分离胶分离胶buffer,TEMED,AP,水水 迅速倒胶，加水使液面平坦，室温迅速倒胶，加水使液面平坦，室温0.5h聚合完全。聚合完全。b.浓缩胶：用浓缩胶浓缩胶：用浓缩胶buffer。插上梳子。插上梳子。30302）样品制备：样品制备：a.PAGE:样品样品缓冲液（蔗糖或甘油指样品样品缓冲液（蔗糖或甘油指示剂溴酚蓝）示剂溴酚蓝）b.SDS-PAGE:

26、样品样品缓冲液（样品样品缓冲液（SDS，甘油，甘油，巯基乙醇，溴酚蓝），煮沸巯基乙醇，溴酚蓝），煮沸25min，以除去亚稳以除去亚稳态聚合。态聚合。3）加样及电泳：加样及电泳：SDS-PAGE:电极电极buffer中加中加0.1%SDS，溴酚蓝溴酚蓝距下端距下端1cm时停止电泳。时停止电泳。31314）固定及）固定及染色染色a.a.固定固定：将凝胶浸于：将凝胶浸于7 7乙酸或乙酸或12.512.5三氯乙三氯乙 酸（酸（TCATCA）中固定蛋白质组分。）中固定蛋白质组分。b.b.染色染色：考马斯亮蓝染色法考马斯亮蓝染色法 银染法银染法（灵敏度比（灵敏度比前者前者高高100100倍）倍）其它的染色

27、方法：氨基黑、阿尔辛蓝，其它的染色方法：氨基黑、阿尔辛蓝，过碘酸过碘酸SchiffSchiff试剂（糖蛋白）。试剂（糖蛋白）。32323333四、等电聚焦四、等电聚焦(isoelectric focusing，IEF)l 利用蛋白利用蛋白质质具有不同等具有不同等电点电点的特性的特性，以以聚丙烯酰胺为电泳支持物，在其中加入聚丙烯酰胺为电泳支持物，在其中加入载体载体两性电解质两性电解质（商品名：（商品名：Ampholine，一一种种含有含有各各种连续种连续 pI 的小分子混合物的小分子混合物）的电泳方法称的电泳方法称聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺等电聚焦电泳（等电聚焦电泳（IEF-PAGE）。）。3434

28、原理原理 两性电解质载体在电场作用下，按各自两性电解质载体在电场作用下，按各自pIpI形成从阳极到阴极逐渐增加的平滑和连续的形成从阳极到阴极逐渐增加的平滑和连续的pHpH梯度。蛋白质在此梯度。蛋白质在此pHpH梯度凝胶中泳动，当迁移梯度凝胶中泳动，当迁移至至pHpH值等于值等于pIpI处时不再泳动，被浓缩成狭窄的处时不再泳动，被浓缩成狭窄的区带。区带。3535优点：l l分辨率高；分辨率高；l l电泳时间延长，区带越来越窄；电泳时间延长，区带越来越窄；l l样品可以加在电泳系统的任何部位；样品可以加在电泳系统的任何部位；l l浓度很低的样品也可以进行分离；浓度很低的样品也可以进行分离；l l可

29、用于准确测定蛋白质或其他两性电解质可用于准确测定蛋白质或其他两性电解质的等电点。的等电点。3636缺点：l l电泳过程要求使用无盐溶液，可能会使某电泳过程要求使用无盐溶液，可能会使某些在无盐溶液中溶解度较低的蛋白质产生些在无盐溶液中溶解度较低的蛋白质产生沉淀；沉淀；l l电泳后样品中各组分都聚焦到各自的等电电泳后样品中各组分都聚焦到各自的等电点，对某些在等电点时溶解度较低或可能点，对某些在等电点时溶解度较低或可能变性的组分不适用。变性的组分不适用。3737两性电解质载体两性电解质载体(carrier(carrier ampholytesampholytes)(1)(1)易溶于水，有足够的缓冲能

30、力易溶于水，有足够的缓冲能力以便保以便保 持稳定的持稳定的pHpH梯度。梯度。(2)(2)导电性能好导电性能好以保持电场强度的均匀性。以保持电场强度的均匀性。(3)(3)分子量小分子量小电泳后易分离除去。电泳后易分离除去。(4)(4)化学组成不同于蛋白质化学组成不同于蛋白质不干扰测定。不干扰测定。(5)(5)与样品中各组分不发生化学反应。与样品中各组分不发生化学反应。3838pH梯度的形成梯度的形成两性电解质在溶液中的行为可从两方面看，一方面溶液的两性电解质在溶液中的行为可从两方面看，一方面溶液的pHpH决定它带电荷的性质。如溶液是决定它带电荷的性质。如溶液是pH7pH7，对，对pIpI=9=

31、9的两性电解质来的两性电解质来说，是处于酸性环境，故带正电荷；但对说，是处于酸性环境，故带正电荷；但对pIpI=3=3的两性电解质来的两性电解质来说，却是处于碱性环境，故而带负电荷。所以，不同说，却是处于碱性环境，故而带负电荷。所以，不同pIpI的两性的两性电解质，在同一环境中带有不同性质和数量的电荷；电解质，在同一环境中带有不同性质和数量的电荷；另一方面，溶液中的两性电解质又破坏了水的解离平衡：使另一方面，溶液中的两性电解质又破坏了水的解离平衡：使溶液溶液pHpH有所改变。当某一两性电解质有所改变。当某一两性电解质pIpI较低，即较低，即释放质子释放质子(H+)(H+)能力较强，使溶液能力较

32、强，使溶液pHpH值下降，这类两性电解质称为酸性两性电值下降，这类两性电解质称为酸性两性电解质；反之，解质；反之，pIpI高的可使溶液高的可使溶液pHpH值上升，称为碱性两性电解质。值上升，称为碱性两性电解质。所以，在溶液中的两性电解质一方面受溶液所以，在溶液中的两性电解质一方面受溶液pHpH值的影响，决值的影响，决定其带电的性质；另一方面，它又影响周围环境定其带电的性质；另一方面，它又影响周围环境(水溶液水溶液)，使，使其其pHpH值有所改变。值有所改变。3939l l载体两性电解质是一系列多氨基多羧基的混合物，载体两性电解质是一系列多氨基多羧基的混合物，载体两性电解质是一系列多氨基多羧基的

33、混合物，载体两性电解质是一系列多氨基多羧基的混合物，其其其其pIpIpIpI分布在分布在分布在分布在3 3 3 311111111之间。在制备聚丙烯酰胺凝胶时，之间。在制备聚丙烯酰胺凝胶时，之间。在制备聚丙烯酰胺凝胶时，之间。在制备聚丙烯酰胺凝胶时，将其混溶其中。将其混溶其中。将其混溶其中。将其混溶其中。l l电泳时凝胶板正极的电极液是电泳时凝胶板正极的电极液是电泳时凝胶板正极的电极液是电泳时凝胶板正极的电极液是磷酸磷酸磷酸磷酸，负极是，负极是，负极是，负极是氢氧化氢氧化氢氧化氢氧化钠钠钠钠。l l正极是酸性环境，载体两性电解质都带正电荷，但正极是酸性环境，载体两性电解质都带正电荷，但正极是酸

34、性环境，载体两性电解质都带正电荷，但正极是酸性环境，载体两性电解质都带正电荷，但由于由于由于由于pIpIpIpI的不同，其所带正电荷数量就有所差异电泳的不同，其所带正电荷数量就有所差异电泳的不同，其所带正电荷数量就有所差异电泳的不同，其所带正电荷数量就有所差异电泳时向负极泳动的速度也就因此不同。同理，负极是时向负极泳动的速度也就因此不同。同理，负极是时向负极泳动的速度也就因此不同。同理，负极是时向负极泳动的速度也就因此不同。同理，负极是碱性环境，载体两性电解质带有数量不等的负电荷，碱性环境，载体两性电解质带有数量不等的负电荷，碱性环境，载体两性电解质带有数量不等的负电荷，碱性环境，载体两性电解

35、质带有数量不等的负电荷，以不同速度向正极泳动。以不同速度向正极泳动。以不同速度向正极泳动。以不同速度向正极泳动。l l根据两性电解质的特性，在泳动过程中又不断地与根据两性电解质的特性，在泳动过程中又不断地与根据两性电解质的特性，在泳动过程中又不断地与根据两性电解质的特性，在泳动过程中又不断地与溶液交换质子，改变了溶液的溶液交换质子，改变了溶液的溶液交换质子，改变了溶液的溶液交换质子，改变了溶液的pHpHpHpH。当达到平衡时，。当达到平衡时，。当达到平衡时，。当达到平衡时，即得失质子相等，不再出现质子的交换时，载体两即得失质子相等，不再出现质子的交换时，载体两即得失质子相等，不再出现质子的交换

36、时，载体两即得失质子相等，不再出现质子的交换时，载体两性电解质到达等电点并各处于自己的性电解质到达等电点并各处于自己的性电解质到达等电点并各处于自己的性电解质到达等电点并各处于自己的pIpIpIpI区域，区域，区域，区域，pIpIpIpI即即即即是指溶液的是指溶液的是指溶液的是指溶液的pHpHpHpH值。值。值。值。l l所以，溶液也因此呈现不同的所以，溶液也因此呈现不同的所以，溶液也因此呈现不同的所以，溶液也因此呈现不同的pHpHpHpH，随载体两性电解，随载体两性电解，随载体两性电解，随载体两性电解质的质的质的质的pIpIpIpI梯度而形成梯度而形成梯度而形成梯度而形成pHpHpHpH梯度

37、梯度。梯度。梯度。4040等电聚焦电泳等电聚焦电泳414142422.操作：操作：1）凝胶凝胶 配制：配制：凝胶浓度凝胶浓度T为为57.5（C=3%左右）左右）2）加样：加样：任意位置任意位置 43433）电泳：电泳：要求开始电泳时恒压要求开始电泳时恒压60V60V，15min15min，目的在于使小分，目的在于使小分子的，泳动快的载体两性电解质可在短时间内形成一个粗略的子的，泳动快的载体两性电解质可在短时间内形成一个粗略的pHpH梯度。此后，恒流为梯度。此后，恒流为8mA8mA，是为了避免电泳开始时介质中带电颗，是为了避免电泳开始时介质中带电颗粒较多，电泳电流过高而破坏凝胶。当各种蛋白质逐

38、渐泳动到各粒较多，电泳电流过高而破坏凝胶。当各种蛋白质逐渐泳动到各自等电点位置时，带电颗粒逐渐减少，出现电阻增大，电压随之自等电点位置时，带电颗粒逐渐减少，出现电阻增大，电压随之增高现象。当电压升到增高现象。当电压升到550V550V时，带电颗粒已大为减少，电流不再时，带电颗粒已大为减少，电流不再偏高，故恒压到偏高，故恒压到580V580V，继续电泳，继续电泳120min120min后，蛋白质颗粒慢慢地集后，蛋白质颗粒慢慢地集中到它等电点位置。电流接近于零时，蛋白质颗粒不再泳动，电中到它等电点位置。电流接近于零时，蛋白质颗粒不再泳动，电泳也到此结束。泳也到此结束。4）固定及染色：固定及染色：T

39、CA固定，考马斯亮蓝染色。固定，考马斯亮蓝染色。44445）等电点测定：等电点测定：Marker与未知样与未知样品同时电泳染色后，品同时电泳染色后，以以pH值为纵轴，距阴值为纵轴，距阴极距离为横轴，做极距离为横轴，做pH梯度标准曲线，据未梯度标准曲线，据未知蛋白迁移距离可推知蛋白迁移距离可推知知pI。IEF-PAGEIEF-PAGEIEF-PAGEIEF-PAGE测定蛋白质测定蛋白质测定蛋白质测定蛋白质pIpIpIpI45453.应用：应用：蛋白质的分离纯化蛋白质的分离纯化测等电点测等电点4646第一相：第一相：等电聚焦等电聚焦第二相：第二相：SDSPAGE目的：为了获得更详细的蛋白质组分信息

40、目的：为了获得更详细的蛋白质组分信息。目前已经广泛应用于蛋白质组研究中目前已经广泛应用于蛋白质组研究中双相电泳双相电泳47474848（1 1）在在没没有有电电场场时时，载载体体两两性性电电解解质质的的pHpH值值是是该该溶溶液液pHpH范范围围的的平平均均值值，所所有有载载体体两两性电解质分子都荷电。性电解质分子都荷电。（2 2）当当引引入入电电场场时时，载载体体两两性性电电解解质质分分子子将将向向阴阴极极或或阳阳极极迁迁移移，带带有有最最低低等等电电点点的的分分子子（荷荷最最多多负负电电）将将最最快快地地向向阳阳极极移移动动；当当它它达达到到净净电电荷荷为为0 0的的位位置置时时才才停停

41、止止，这这个个位位置置靠靠近近阳阳极极，由由于于它它具具有有高高的的缓缓冲冲能能力力，使环境溶液的使环境溶液的pHpH等于分子本身的等于分子本身的pIpI。（3 3）其其次次，一一些些低低pIpI的的载载体体两两性性电电解解质质（荷荷其其次次多多的的负负电电）也也向向阳阳极极移移动动，直直到到它它的的净净电电荷荷减减少少到到0 0才才停停止止。同同样样的的，其其周周围围环环境境溶溶液液pHpH值值也也等等于于它它本本身身的的pIpI。依依次次类类推推，所所有有的的载载体体两两性性电电解解质质分分子子将将分分别别在在阳阳极极、阴阴极极之之间间到到达达它它们们自自己己的的位位置置，从从而而给给出出一一个个pHpH梯度。梯度。pH梯度的形成梯度的形成4949