输血科微柱凝集试验技术操作规程.docx

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1、输血科微柱凝集试验技术操作规程1、目的：规范实验室工作人员操作程序，确保实验过程及结果的准确性与可靠性。2、范围：本规程适用于本实验室微柱凝集试验操作。3、职责3.1工作人员应对微柱凝集试验技术操作熟悉掌握。4、程序4.1基本原理微柱凝集试验技术基于生物化学凝胶过滤技术、离心技术及免疫学抗原-抗体特异性反应。其本质是凝集反应，即红细胞抗原抗体在微柱腔的凝胶介质中发生肉眼可见的免疫凝集反应。4.2微柱凝胶卡的基本结构：凝胶微管分为反应腔、试剂或盐水层以及凝胶分离柱三部分。4.2.1反应腔凝胶微管上方为反应腔，可供加入红细胞悬液和血清，红细胞膜抗原与相应特异性抗体反应，发生直接凝集反应（IgM类抗

2、体）或通过孵育发生致敏反应（IgG类抗体）。反应腔下端的底孔很小，避免反应物在孵育的过程中流入下方的微柱。4.2.2试剂或盐水层在凝胶微柱中，有少量液体将反应腔和下端凝胶分离柱隔开。当检测在盐水介质发生反应的抗原-抗体时该液体可以是盐水或IgM抗体；当检测IgG类抗体时，该液体是抗人球蛋白试剂。当红细胞在离心力的作用下穿越该层时，红细胞与反应腔中的血清分离并与该层液体中的试剂反应。4.2.3凝胶分离柱凝胶卡的微管中填充了特定配比的葡聚糖凝胶，凝胶颗粒具有分子筛作用，用于分离凝集和不凝集的红细胞。反应物经离心后，与抗体结合发生凝集的红细胞因体积大不能通过凝胶间隙而留在凝胶上层或中间，为阳性反应；

3、未与抗体结合的游离红细胞因体积小，可通过凝胶间隙，沉于底部，为阴性反应。4.3分类和适用范围微柱凝胶依其胶中有无抗体及抗体性质分为中性胶、特异性胶和抗人球蛋白胶，分别用于不同的血型血清学实验。中性胶不含抗体，可用于ABO血型反定型试验、自身对照试验、。细胞对照试验、IgM类抗体和IgG类完全抗体的检测及效价的测定等。特异性胶中含有特异性血型抗体，可用于血型抗原的检测，如ABO血型的正定型试验、Rh系统抗原检测等。抗人球蛋白胶中含有抗人球蛋白，可用于IgG类不完全抗体的检测，如意外抗体的筛选和鉴定、交叉配血、新生儿溶血病检测等。1. 4基本操作程序（以国内国产市占率最高、中国输血大讲堂冠名商博讯

4、卡为例）4. 4.1准备工作1）微柱凝胶检测卡的准备：观察外观，如有干胶、杂质、气泡不可使用，之后将卡平衡至室温（1825C）,再用专用离心机离心5分钟。2）标本采集：用EDTA抗凝管采集被检对象脐带血或静脉血，制备成红细胞标本和血浆标本。3）血浆标本的处理:将被检者血液标本进行离心,采用3000rmin离心3min或3500rmin离心2min,将上清用吸管吸出置于干净试管中，并做好标记，该上清不得有絮状物或沉淀。4）红细胞标本的处理：将被检红细胞或试剂红细胞根据实验需要用生理盐水或低离子强度溶液配制成0.5%0.8%浓度的红细胞悬液。该悬液外观应为均匀淡红色，无絮状物和血块。5. 4.2操

5、作程序I）AB0、RhD血型鉴定（1）将微柱凝胶试剂卡做好唯一性标记。（2）将已知的Al型和B型红细胞0.5%0.8%浓度悬液加入第56管中，每管50L(3)将待检者血清/浆分别加入第56管中，每管50RL轻弹几下，使反应物混匀充分。(4)将待检者红细胞悬液分别加入第1-4管中，每管50u1。(5)用专用离心机离心5分钟(900rpm2分钟,1500rpm3分钟)，取出，肉眼判定结果。2)抗体筛查(1)将微柱凝胶试剂卡的微管做好标记：Sl、S2、S3及自身对照。(2)各管加入相应抗筛细胞及受检者红细胞0.5%0.8%浓度悬液50UI(红细胞悬液用低离子溶液配制)。(3)各管加入受检血清浆50u

6、l。(4)轻弹几下，使反应物混匀充分，置37孵育器中15分钟。(5)用专用离心机离心5分钟(900rpm2分钟,1500rpm3分钟)，取出，肉眼判定结果。3)交叉配血(1)将微柱凝胶试剂卡的微管做好唯一性标记：主侧、次侧、自身对照。(2)主侧管加入供血者红细胞0.5%0.8%浓度悬液50Ul和受血者血浆50u1。(红细胞悬液用低离子溶液配制)(3)次侧管加入受血者红细胞0.5%0.8%浓度悬液50Ul和供血者血浆50R1。(红细胞悬液用低离子溶液配制)(4)轻弹几下，使反应物混匀充分，置37。C孵育器中15分钟。(5)用专用离心机离心5分钟(900rpm2分钟,1500rpm3分钟)，取出，

7、肉眼判定结果。4.4.3结果判读质控管为阴性时，试验结果有效。阳性结果：红细胞抗原与相应抗体在微柱凝胶中形成的特异性抗原-抗体复合物浮在凝胶表面或悬于胶中，表明被检者血清中含有对应其抗原的抗体或血细胞被致敏。阴性结果：红细胞完全沉降到微柱管尖底部，表明血清中无相应抗原免疫的抗体或红细胞没有被致敏。反应强度：特异性红细胞抗原抗体复合物完全位于胶表面，为强阳性反应；愈靠近胶底部颗粒愈小，反应愈弱。强度判读见下表：柱凝集技术结果评分标准反应强度分级评分外观及说明4+全凝9红细胞复合物(凝集)清楚地集中在凝胶载体表面3.5+4+w或3+s8凝块绝大部分集中在凝胶载体顶部，同时在上1/3也有少量散在凝块

8、3+3+7大部分红细胞复合物位于凝胶表面，散在凝块悬浮于顶部与中部之间2.5+3+w或2+s6凝块大部分位于凝胶中部，少部分位于凝胶中上部2+2+5凝块大部分集中在凝胶载体中部，同时在1/2也有少量散在凝块2+w2+w4凝块大部分集中在凝胶载体中部，同时在凝集层上、下也有少量散在凝块1.5+1+s3凝块大部分集中在凝胶载体中部，同时在凝胶下1/2也有少量散在凝块1+1+2凝块大部分集中在凝胶载体底部，同时在凝胶下1/2也有散在凝块W+/-1凝块绝大部分集中在凝胶载体底部，但凝集不平整，在凝胶下1/3有少量散在凝块OOO红细胞完全沉积在微柱凝胶尖底部完全溶血凝胶和液体无凝集或未凝集的红细胞，液体

9、出现透明清澈红色不完全溶血残留红细胞在胶表面、胶中或胶底部，液体出现透明清澈红色混合凝集红细胞复合物位于凝胶表面和凝胶底部W为弱凝集，S为强凝集4.5技术特点及注意事项4.5.1凝胶试验的技术特点：1）敏感：凝胶试验方法的敏感性较高，在凝胶试验中常能发现在其它试验方法中不易发现的问题。对临床血型标本检测的敏感性恰到好处。2）准确：结果清晰明确，可重复性强。操作技术要求较低，主要是简单的加样和结果判读，孵育和离心过程都有专用设备，其中人为改变的因素较少。3）简便：无需洗涤红细胞，对阴性结果不需确证试验。多分标本一次离心出结果，适用于临床大量标本的检测。单份标本多项指标一次离心出结果，简化了试验程

10、序。4）自动化：目前凝胶试验可以从加样到结果判读均自动化。5）结果可保存：凝胶试验结果可在冰箱保存数日，并且较易被拍成照片保存。6）标本用量少：标本用量为试管法的1/101/5,有利于新生儿及某些特殊血液病标本的检测。7）标准化：操作程序及结果判定等都易于规范化、标准化。8）安全：操作程序简化及规范化可以减少与血液标本接触的机会，减少医源性感染机会。4.5.2注意事项D每日试验前，要先取出微柱凝胶卡平衡至室温。凝胶卡使用前要先离心，封口已损坏，管内有气泡和干涸现象时不可使用。2）凝胶卡应在18-22保存，不可长期保存在4（也有特例如Sanquin卡），在此温度下，管中液体蒸发凝集于封口铝箔下部

11、胶易干涸。3）试验中要设阴性对照，阴性对照管为阳性时，要用生理盐水洗涤细胞，再做试验。4）血清标本必须充分去除纤维蛋白，否则易出现假阳性反应。5）红细胞标本必须为抗凝血并且不能被细菌污染，否则易出现假阳性反应。尽可能应用当日采集的新鲜血做试验。如不得不用过夜血或陈旧血,则必须首先用该标本做阴性对照试验，以确保试验结果可靠。6）在试验中要充分考虑温度因素，温度低时易出现假阳性反应。如室温低于20,离心机未调整温度，即使已经37孵育过，在离心时试剂卡温度会下降，影响检测结果。7）应用微柱凝胶卡做直接抗人球蛋白试验时，要用EDTA抗凝血液标本，该标本不能放入4CT0C冰箱保存，以避免红细胞在病人体

12、外致敏所致假阳性反应。8）做血型鉴定时，反定管最好先于正定管加样，以便标准细胞与血清/浆充分反应。一般先加细胞后加血清。9）若结果为土或1+需进一步分析，可能为亚型或弱化抗原。10）若出现溶血现象，提示为红细胞抗原-抗体阳性反应，也不排除其他原因所致溶血，故对此标本一定认真分析，并向上级主管技术人员报告并讨论其原因。4.5.3可能出现的问题1）假阳性反应血清中的纤维蛋白原未完全除去，在凝胶中形成纤维蛋白，阻碍红细胞沉降而呈假阳性反应。抗凝剂不足或不含抗凝剂的血浆标本，如血袋上的连接管中的标本，其中可能无抗凝剂，离心后的上清中含纤维蛋白原，用来做反定型会出现假阳性反应。红细胞标本被细菌污染，也易

13、出现假阳性反应。陈旧血标本中破碎的红细胞膜浮于胶中或胶面呈弱阳性。实验室温度低时，因凝胶颗粒活动性减少，单个红细胞穿过困难，易出现假阳性结果。用未抗凝或抗凝不充分的红细胞标本制备的细胞悬液做直接抗人球蛋白试验时，在体外人血清中补体可吸附到已经凝集的红细胞上，即使把凝块打散制成细胞悬液，其细胞表面仍结合有补体，会呈现假阳性结果。2）假阴性反应抗原或抗体过少过弱。抗原抗体比例不合适，如前带或后带现象。离心力过大，使弱阳性变为阴性。人为实验操作错误，如未加入抗体。3）溶血反应人为实验操作错误或标本有问题：如反应液是低渗溶液、温度过冷或过热、标本被细菌污染、采血针头太细或采血速度过快以及其它可使红细胞

14、破坏的理化因素。红细胞抗原-抗体溶血性反应：红细胞抗原与特异性抗体结合,激活补体，作用于细胞膜，使之破裂、溶血；红细胞抗原与特异性抗体结合，未激活补体，但受到血清中其它因子作用而发生溶血。4）混合反应一般指反应格局为阴性阳性同时存在的情况，其反应体系中同时存在两种或两种以上抗原性不同的红细胞。不同抗原性红细胞的混合标本：如标本中同时有A型血和O型血。多凝集红细胞：如T/Tn。ABo亚型红细胞：如A3型。5）类混合反应指反应格局类似混合反应，但并不是因为反应体系中存在两种或两种以上抗原性不同的红细胞所致。抗体量少，而相应红细胞抗原量过多。假阳性反应：标本染菌（获得性B）、血清中残存纤维蛋白原、凝

15、胶卡质量不合格、红细胞膜破碎等其它可能出现假阳性反应的原So4.6应用及局限性1990年，Y.Lapierre发表文章介绍了微柱凝胶免疫实验技术，这是人类红细胞血型血清学检测方法发展的里程碑。该技术解决了传统的试管法对不完全抗体检测繁琐费时的问题，并且对血型检测的敏感性恰到好处，适用于临床大量标本的检测。该技术发展到今天，不仅可以应用于红细胞抗原抗体检测，而且还能够应用于血小板、白细胞等血液细胞，以及细菌、病毒等微生物的抗原抗体与肿瘤标志物的检测。但是，微柱凝集试验技术也有一定的局限性，并不能完全取代传统的血型血清学试验方法。例如，当血清/血浆中存在蛋白凝集或冷凝集素时，最好应用经典抗人球蛋白法（试管法）进行抗筛和交叉配血。对ABO疑难血型的血清学鉴定，也最好应用传统的试管法。另外，对健康体检者或献血员的血型初筛检测，应用试管法等传统盐水凝集实验方法非常方便、经济、高效。总之，微柱凝集试验技术有其自身的优越性，也有一定的局限性，在日常检测工作中，要与其他传统血型血清学检测方法结合起来应用。