反义核酸与RNAiPPT演示课件.ppt
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1、RNA干扰RNA interference,RNAi1J生物技术史上革命性事件核酸结构与功能的揭示核酸结构与功能的揭示1PCR技术技术2重组重组DNA技术技术3RNAi和反义技术和反义技术42概述RNA干扰(干扰(RNA interference,RNAi)是指在进化是指在进化过程中高度保守的、由双链过程中高度保守的、由双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA)诱发的、同源)诱发的、同源mRNA高高效特异性降解的现象。效特异性降解的现象。3目前对目前对RNAi(RNA interference)的定义有很多种,不同的定义有很多种,不同的资料对其定义的侧重点也不尽相同,如果
2、将的资料对其定义的侧重点也不尽相同,如果将RNAi看作一种生物学现象,可以有以下定义:看作一种生物学现象,可以有以下定义:RNAi是有是有dsRNA参与指导的,以外源和内源参与指导的,以外源和内源mRNA为降解目标的转基因沉默现象。具有核苷酸序列特异为降解目标的转基因沉默现象。具有核苷酸序列特异性的自我防御机制,是一种当外源基因导入或病毒入性的自我防御机制,是一种当外源基因导入或病毒入侵后,细胞中与转基因或入侵病毒侵后,细胞中与转基因或入侵病毒RNA同源的基因发同源的基因发生共同基因沉默的现象。生共同基因沉默的现象。4如果将其作为一门生物技术,则定义为如果将其作为一门生物技术,则定义为:RNA
3、i是指体外人工合成的或体内的双链是指体外人工合成的或体内的双链RNA(dsRNA)在细胞内特异性的将与之同源的)在细胞内特异性的将与之同源的 mRNA降解成降解成21nt23nt 的小片段,使相应的基因沉的小片段,使相应的基因沉默。默。RNAi是将与靶基因的是将与靶基因的mRNA 同源互补的双链同源互补的双链RNA(dsRNA)导入细胞导入细胞,能特异性地降解该能特异性地降解该mRNA,从从而产生相应的功能表型缺失而产生相应的功能表型缺失,属于属于转录后水平的基因沉转录后水平的基因沉默默(post-transcriptional gene silence,PTGS)。5发现过程共抑制现象的发现
4、共抑制现象的发现 u RNAi研究的早期线索来自于美国和荷兰的两个研究的早期线索来自于美国和荷兰的两个转基因植物实验组转基因植物实验组,约根森(约根森(Jorgensen)研究小组)研究小组,在对矮牵牛在对矮牵牛(petunias)进行的研究中有个奇怪的发进行的研究中有个奇怪的发现现:u 他们设想将更多的色素基因注入矮脚牵牛植物他们设想将更多的色素基因注入矮脚牵牛植物体中,试图加深花朵的紫颜色,而结果出其预料,体中,试图加深花朵的紫颜色,而结果出其预料,转基因的植株不仅没有新基因表达,反而使原有的转基因的植株不仅没有新基因表达,反而使原有的色素基因也受到了抑制。色素基因也受到了抑制。6加入 c
5、halcone synthase基因 or转基因7发现过程Jorgensen 将这种现象命名为将这种现象命名为 共抑制共抑制(cosuppression)因为导入的基因和其相似的内源基因同因为导入的基因和其相似的内源基因同时都被抑制。时都被抑制。8发现过程发现过程Quelling现象现象 并非只有植物学家才注意到了这种意外的现象。并非只有植物学家才注意到了这种意外的现象。1994年意大利的意大利的Cogoni等等,将外源类胡萝卜素基因将外源类胡萝卜素基因导入链孢霉导入链孢霉(Neurosporacrassa),结果转化细胞中内结果转化细胞中内源性的类胡萝卜素基因也受到了抑制。而在真菌转源性的类
6、胡萝卜素基因也受到了抑制。而在真菌转基因实验中这种共抑制现象被称基因实验中这种共抑制现象被称“quelling”(基基基基因压制)因压制)因压制)因压制)现象。现象。9发现过程J 95年康乃尔大学的研究人员年康乃尔大学的研究人员Guo(郭苏郭苏)和和kemphues在秀在秀丽线虫丽线虫(C.elegans)中用反义中用反义RNA 阻止一些基因的表达,给阻止一些基因的表达,给对照组用正义对照组用正义RNA不但不增加该基因的表达,反而产生与不但不增加该基因的表达,反而产生与反义反义RNA 同样的结果同样的结果特异性阻断该基因的表达,这个特异性阻断该基因的表达,这个奇怪的现象直到奇怪的现象直到3年后
7、年后1998才被解开。才被解开。J 1998年年Fire等发现将等发现将ds RNA注入秀丽线虫可显著抑制特注入秀丽线虫可显著抑制特定基因的表达,并证明了定基因的表达,并证明了Guo和和kemphues所发现的正义所发现的正义RNA的基因压制作用其实是转录时污染微量的基因压制作用其实是转录时污染微量dsRNA所造成所造成的。的。10线虫体内的RNAi线虫中RNAi效应的检测(左面)两条线虫表现为绿色荧光蛋白(GFP)表达类型品系,该品系含有一个普遍性表达的GFP报告基因重组质粒(带有核内定位信号位点)。(右面)喂食表达针对GFP的dsRNA的细菌后,整个虫体的GFP信号消失。11发现过程p将制
8、备的将制备的RNA高度纯化后发现,正义高度纯化后发现,正义RNA无基因抑无基因抑制作用,反义制作用,反义RNA的基因抑制作用也很微弱,而用的基因抑制作用也很微弱,而用纯化后的纯化后的dsRNA注入线虫,却能高效、特异地阻断注入线虫,却能高效、特异地阻断相应基因的表达。相应基因的表达。p实验证明双链实验证明双链RNA抑制基因的表达的效率比纯化后抑制基因的表达的效率比纯化后的反义的反义RNA至少高几个数量至少高几个数量,他们称此现象为,他们称此现象为ds RNA介导的介导的RNA干扰(干扰(RNAi)。)。12Effects of mex-3 RNA interference on levels
9、of the endogenous mRNA.Nomarski DIC micrographs show in situ hybridization of 4-cell stage embryos.(A)Negative control showing lack of staining in the absence of the hybridization probe.(B)Embryo from uninjected parent showing normal pattern of endogenous mex-3 RNA(purple staining).(C)Embryo from pa
10、rent injected with purified mex-3 antisense RNA.These embryos(and the parent animals)retain mex-3 mRNA,although levels may be somewhat less than wild type.(D)Late 4-cell stage embryo from a parent injected with dsRNA corresponding to mex-3;no mex-3 RNA is detected.(Templates used for interfering RNA
11、 and in situ probes were largely non-overlapping.)13RNA干扰的发现干扰的发现安德鲁安德鲁菲尔菲尔(AndrewZ.Fire)、克雷格、克雷格梅洛梅洛(Craig C.Mello)1998年发现了年发现了RNA干扰和基因沉默现象。干扰和基因沉默现象。其论文发表在其论文发表在1998年的年的NATRUE杂志上。杂志上。Fire A,Xu S,Montgomery MK,Kostas SA,Driver SE,Mello CC.Potent and specific genetic interference by double-stranded
12、RNA in Caenorhabditis elegans.Nature.1998 Feb 19;391(6669):806-811.14发现过程RNAi现象的普遍性现象的普遍性 随后陆续发现随后陆续发现RNAi也存在也存在于水稻、烟草、果蝇、小于水稻、烟草、果蝇、小鼠及人等几乎所有的真核鼠及人等几乎所有的真核生物中。生物中。RNAi能高效特能高效特异的阻断基因的表达,在异的阻断基因的表达,在线虫,果蝇体内,线虫,果蝇体内,RNAi能达到基因敲除的效果。能达到基因敲除的效果。152006年年10月月2日瑞典皇家科学院诺贝尔奖委员会日瑞典皇家科学院诺贝尔奖委员会宣布,将宣布,将2006年度诺贝尔
13、生理学或医学奖授予两年度诺贝尔生理学或医学奖授予两名美国科学安德鲁名美国科学安德鲁法尔和克雷格法尔和克雷格梅洛,以表彰梅洛,以表彰他们发现了他们发现了RNA干扰现象。法尔和梅洛将分享干扰现象。法尔和梅洛将分享一千万瑞典克朗的奖金一千万瑞典克朗的奖金(137万美元万美元)。RNA干扰获得干扰获得诺贝尔生理学或医学奖诺贝尔生理学或医学奖16安德鲁安德鲁安德鲁安德鲁 菲尔菲尔菲尔菲尔(AndrewZ.Fire)(AndrewZ.Fire)克雷格克雷格克雷格克雷格 梅洛梅洛梅洛梅洛(Craig C.Mello)(Craig C.Mello)麻省理工麻省理工麻省理工麻省理工 大学大学大学大学 哈弗大学哈
14、弗大学哈弗大学哈弗大学17目前普遍认为,共抑制、基因压制和目前普遍认为,共抑制、基因压制和RNAi很可能具有相同很可能具有相同的分子机制,都是通过的分子机制,都是通过dsRNA的介导而特异地降解靶的介导而特异地降解靶mRNA,抑制相应基因的表达。抑制相应基因的表达。实际上,法尔在接受诺贝尔奖网站采访时提到,第一个在实际上,法尔在接受诺贝尔奖网站采访时提到,第一个在线虫中观察到线虫中观察到(RNA干扰干扰)这种特别现象的是康奈尔大学研这种特别现象的是康奈尔大学研究生究生郭苏郭苏。1995年,从复旦大学毕业后赴美的郭苏在坎菲斯年,从复旦大学毕业后赴美的郭苏在坎菲斯(KennethKemphues)
15、指导下,试图阻断秀丽新小杆线虫的某个基因指导下,试图阻断秀丽新小杆线虫的某个基因时,意外地发现反义和正义这两种单链时,意外地发现反义和正义这两种单链RNA都阻断了该基都阻断了该基因的表达。因的表达。18但可惜的是,她和坎菲斯一直没能解释这个奇怪现象。直但可惜的是,她和坎菲斯一直没能解释这个奇怪现象。直到到3年后,当时在卡内基研究所供职的法尔和梅洛才揭开了年后,当时在卡内基研究所供职的法尔和梅洛才揭开了谜底:在郭苏的实验中,体外转录所得谜底:在郭苏的实验中,体外转录所得RNA污染了微量的污染了微量的双链双链RNA,而经过纯化的双链,而经过纯化的双链RNA能够高效率地阻断相应能够高效率地阻断相应基
16、因的表达。这就是基因的表达。这就是RNA干扰。干扰。郭苏目前在旧金山加州大学任职。她说:郭苏目前在旧金山加州大学任职。她说:“他们在我们工他们在我们工作的基础上,解释了我们那个让人迷惑的现象,是一个飞作的基础上,解释了我们那个让人迷惑的现象,是一个飞跃跃我和坎菲斯通过话,我们的工作在这个奖项中有所我和坎菲斯通过话,我们的工作在这个奖项中有所贡献,我们为此感到自豪,也都认为安德鲁贡献,我们为此感到自豪,也都认为安德鲁法尔和克雷格法尔和克雷格理应获奖。理应获奖。”19&在实验时,要认真观察每个现象,发现在实验时,要认真观察每个现象,发现怀疑并给予证明,不要被误导。怀疑并给予证明,不要被误导。202
17、122毕业于上海第二医科大学的徐思群是那篇毕业于上海第二医科大学的徐思群是那篇自然自然论论文的第二作者。自文的第二作者。自1992年起,从美国拿到硕士学位的年起,从美国拿到硕士学位的他在法尔实验室以研究技术员身份工作了他在法尔实验室以研究技术员身份工作了6年。但他扮年。但他扮演的角色不只是通常意义上负责实验室日常运作的演的角色不只是通常意义上负责实验室日常运作的“管家管家”。“一个科学实验成功的关键是实验设计和实验结果的分一个科学实验成功的关键是实验设计和实验结果的分析理解,这当然要归功于安迪和克雷格。我经常说我析理解,这当然要归功于安迪和克雷格。我经常说我是小人,因为小人动手,君子动口和动脑
18、我不过是是小人,因为小人动手,君子动口和动脑,我不过是把他们的实验意图比较完整地在实验台上体现出来。把他们的实验意图比较完整地在实验台上体现出来。”徐思群说。徐思群说。23u法尔和梅洛等人的研究发表以后,激发法尔和梅洛等人的研究发表以后,激发了全球研究人员对了全球研究人员对RNA干扰领域的兴趣。干扰领域的兴趣。u2001年和年和2002年,美国年,美国科学科学杂志连续杂志连续将将RNA干扰列入年度十大科学进展干扰列入年度十大科学进展。24 转录水平的基因沉默(Transcriptional Gene Silencing,TGS)转录后水平的基因沉默(Post-transcriptional
19、Gene Silencing,PTGS)TGS是指转基因在细胞核内RNA 合成受到了阻止而导致基因沉默。PTGS 则是指转基因能够在细胞核里被稳定地转录,但在细胞质里却无相应的mRNA 存在这一现象。基因沉默RNA干扰的分子机制干扰的分子机制 J基因沉默基因沉默25RNA干扰的分子机制干扰的分子机制 1.dsRNA的产生的产生:内源性内源性:p包括细胞内源性基因的双向表达包括细胞内源性基因的双向表达;p具有反向重复序列的细胞内源性基因表达产具有反向重复序列的细胞内源性基因表达产生的短发夹生的短发夹RNA(short hairpin RNA,shRN A)等等26外源性外源性:p以转基因表达的以
20、转基因表达的mRNA 为模板,通过异常聚合作为模板,通过异常聚合作用形成用形成dsRNA;p真核生物基因组中的转座子在复制表达过程真核生物基因组中的转座子在复制表达过程 中产生中产生的的dsRNA;pRNA病毒基因组或病毒感染复制过程中产生的病毒基因组或病毒感染复制过程中产生的dsRNA中间产物中间产物;p采采 用化学合成的用化学合成的dsRNA;或用质粒或病毒载体表达或用质粒或病毒载体表达所需的所需的dsRNA等等 27siRNA制备方法制备方法化学合成化学合成体外转录法合成体外转录法合成siRNAsiRNA表达载体表达载体siRNA表达框架表达框架28siRNA设计的原则设计的原则siRN
21、A双链设计时,一般在靶双链设计时,一般在靶mRNA起始密码下游起始密码下游100200 bp至翻译终止密码上游至翻译终止密码上游50100 bp的范围内搜寻的范围内搜寻AA序列,并记录每个序列,并记录每个AA 3 端相邻端相邻19个核苷酸作为候选个核苷酸作为候选siRNA靶位点。靶位点。29建议设计的建议设计的siRNA不要针对不要针对mRNA的的5 和和3 端非编码区端非编码区(untranslated regions,UTRs),因为这些区域有丰富的,因为这些区域有丰富的调控蛋白结合位点,而调控蛋白结合位点,而UTR结合蛋白或者翻译起始复结合蛋白或者翻译起始复合物可能会影响合物可能会影响s
22、iRNP(siRNA protein complex,核酸,核酸内切酶复合物内切酶复合物)结合结合mRNA,从而影响,从而影响siRNA干扰的效干扰的效果果。最后还应将候选最后还应将候选siRNA序列在序列在GenBank进行进行BLAST检检索,与非同源基因具有索,与非同源基因具有3个或个或3个以上碱基相异的序列个以上碱基相异的序列方可选用。方可选用。30化学合成化学合成早期早期RNAi实验中,实验中,dsRNA或或siRNA均由化学法所均由化学法所合成。化学合成的合成。化学合成的siRNA纯度高,合成量不受限纯度高,合成量不受限制,且还可对制,且还可对siRNA进行标记,方便对其跟踪,进行
23、标记,方便对其跟踪,但该方法价格昂贵,不适用于但该方法价格昂贵,不适用于siRNA序列的筛选序列的筛选和长期基因沉默实验。和长期基因沉默实验。31体外转录法合成体外转录法合成siRNA较为经济。根据较为经济。根据siRNA序列序列合成相应合成相应DNA Oligo模板,再利用模板,再利用T7 RNA聚合酶进聚合酶进行体外转录,分别获得行体外转录,分别获得siRNA的正义链和反义链,的正义链和反义链,然后将其退火、纯化即可得到能直接导入细胞的然后将其退火、纯化即可得到能直接导入细胞的siRNA。体外转录法最大缺点是体外转录法最大缺点是siRNA合成量受限制,不过合成量受限制,不过其价格较低,毒性
24、小,稳定性好,效率高。其价格较低,毒性小,稳定性好,效率高。体外转录法合成体外转录法合成siRNA32Construction of siRNA by T7 RNA polymerase-mediated in vitro transcription.33siRNA表达载体表达载体体外合成体外合成siRNA,不宜进行长期基因沉默研究。借助,不宜进行长期基因沉默研究。借助表达质粒或病毒载体在细胞内产生表达质粒或病毒载体在细胞内产生siRNA,使研究者,使研究者无需直接操作无需直接操作RNA就可达到长期抑制靶基因表达的目就可达到长期抑制靶基因表达的目的,且载体上的抗性标记有助于快速筛选出阳性克隆,
25、的,且载体上的抗性标记有助于快速筛选出阳性克隆,这将具有更为广阔的应用前景。这将具有更为广阔的应用前景。34短发夹短发夹RNA(shRNA)shRNA表达质粒多采用表达质粒多采用RNA聚合酶聚合酶 启动子启动子(pol)。pol 在哺乳动物细胞内引导非编码小在哺乳动物细胞内引导非编码小RNA的转录,转录产物无的转录,转录产物无poly(A)尾,且在转录过程尾,且在转录过程中遇到连续中遇到连续45个个U时转录终止。时转录终止。此载体最后转录出的产物是经折叠形成的发夹状小此载体最后转录出的产物是经折叠形成的发夹状小RNA (small hairpin RNA,shRNA);shRNA在细在细胞内被
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