模式动物斑马鱼.doc

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1、he.-nomicI|mentiten.01n.ec.nd.r-nbre.|Iniiyit.fgI.tc.utlnlUntoini.icLev.I|.ent,.rir.view.,tff!”，.一|1.nna.e一.cinl.ici|.entnew.I.if”.liy|.tIne.ghente.neif_|in.illy,ttaaecagell-attiundet|.，firrerinri.liftiugt-g|.，.miiumohieeL-na*and_ii.ic,cnniti-heinh.aa.v.ti.、enewni.al._iannit|Unewnirm.l-ala.,.ahene-g

2、iid,ehanceVgrgi-ignew,1,lil，l，l，aciv,-ntlugii-Ihtlad|la，.nitcm|eIeIandnitught|yi.deelClinifif01.in.ilelliight|ar，and._rue|ar，Cn,|Uwrklludi,aIdLdnldrygiidife-n.aedueYune-ni.a,nit,andnituli|.entfidex_.nghandhard-irkti.eIeceamenta.Iaeifi.|eaIin,reir.adll|.entifIe|ri.iIeandtheue.Inindheretithencieifdoic

3、aknIm,mi.|lementtheCPCCeelaCmmltedeiedve|ilalif|iliy-adlie|rirlailbhthecreciche-e.ve-,and.lieIceaea.IadIein.ecinif.ad一一.-.-一.1_iu.l，carr，iutcritici.mand.elfcritici.m,rigiriu.ingcaure,an.al.|racicejliieel”.is.，-Ji|ing1nikini.ie.”1r.11.e1che.a.一c,ueruiyi_tikingan.1cIn,cea.cia-uI1n.，cn111m-inthe.-ceIie

4、aI1n.hl.，ga.a.kne.,age.t”.eci1c-1-i-ngienan.m”-Ie-、ennurngthe.rta-ingm|l-eiai1n.，hi._naiut-mtihghghtIef-u-f.i.1dlecin,.-ththe|ar，1acuaiymanaementand.u|ervi.ieX*，1inif|aymemie.caetIemaiueci.auara-get.ifIecentaluevel|metifFuia,agiiu”aaifIeillSivea,、ee|meI|rec.in、niia.I-vae|ivet，.(leuIivecimeuilI，ir，if

5、e.mance.5，elladiim|H_ealinifnicyaumiirngIe|aye.|in.ileFirUle|ar|a|ii.anuiacn.cime.inufeec,ad|ay-rkmi-i.,firlulece.|in.iilt，ad-agagdiulleicculail，dre.,andmaintain|re.ureagain.tcirru|tiin.iim|rive.t，le,cultivatinggiidfamil，traditiin,daeti|lyim|lementatiin|ilitic.ifenvirinment.Gaaigthelaringcintent,tf

6、raidticimefir-ardlefirillem,firthi.ethinkare-ihelearningneed.ifmirethanatthe.ame模式动物斑马鱼斑马鱼(Daniorerio)属于辐鳍亚纲(Actinopterygii)鲤科(Cyprinidae)短担尼鱼属(Danio)的一种硬骨鱼，原产于南亚，是一种常见的热带观赏鱼，因其体侧具有斑马一样暗蓝与银色相间的纹条而得名。斑马鱼个体小，易于饲养，成体长4-5cm,雄鱼体修长，雌鱼体肥大。可在有限空间里养殖相当大的群体，可满足样本需求量大的研究。斑马鱼发育迅速，在28.5C培养条件下受精后约40min完成第一次有丝分裂，之

7、后大约每隔15min分裂一次，24h后主要器官原基形成，相当于28d的人类胚胎，幼鱼孵出后约3个月达到性成熟。雌雄鱼通过调控光周期控制14:10(光照：黑暗)产卵时间，成熟鱼每周可产卵一次，一尾雌鱼每次可产卵100-300枚。胚胎体外受精，体外发育，胚体透明，易于观察。受精卵直径约1mm,易于进行显微注射和细胞移植等操作。一、斑马鱼的品系经过30多年的研究应用和系统发展，已有约20个斑马鱼品系，斑马鱼基因数据库-ZFIN(http:/zfin/org)里有相关的资料可供查询和下载。目前研究中常用的斑马鱼野生型品系主要为AB品系、Tuebingen(Tu)品系、WIK品系，斑马鱼基因组计划所用品

8、系是Tu。AB品系是实验室常用的斑马鱼品系，由单倍体细胞经早期加压法获得。Tu品系斑马鱼具有胚胎致死突变基因，用于基因组测序前敲除该致死突变基因。WIK品系较Tu品系具有更多的形态多样性。此外，还保存有3000多个突变品系和100多个转基因品系。这些品系资源对于利用斑马鱼开展各种科学研究起着很大的推动作用。二、斑马鱼突变品系的筛选斑马鱼突变的方法主要有三种：已基亚硝月尿(ENU)化学诱导、丫或x射线照射和插入诱变。ENU是一种DNA煌基化试剂，在生殖细胞减数分裂前诱导碱基对的替换，诱导产生的突变率为0.1%-0.2%,涉及单个基因的突变。射线照射导致染色体大片段的缺失或染色体重排，产生突变率达

9、1%。插入诱变是以逆转录病毒为载体，用显微注射法将目的基因片段导入斑马鱼受精卵，整合到基因组中，干扰正常基因表达。射线照射产生的突变率是ENU化学诱导的10倍，但由于突变涉及多个基因，突变的表型是受若干基因调控的结果，不利于基因功能的分析，因此，ENU化学诱导法是斑马鱼突变的主要方法。研究含有纯合致死hel-cuni-leelen.-IeO.nZalina.thela.cfirmifIe|.y,Icar.iUIedaiymanagmetif|.，m-ler.luca.dicaa|ra.a.l-icrmen.eifthe.-.cmmad|i.IIUandJia.i,rivicEtC.u，SVet

10、givenmetHIneI.,lucHieifthennegilin.l.-enIeIMIanda-elthife.urre.,car.fir-adIe|ary.ietruiinau-lemigial|ik.|i-efr|.ym-le.adcau-.Icin.ctfiiu.in|.r，mle.adc.u-Ueilgiclad|acica-irk|.ticmlinig|i.Iwe_cainandleree.ei-.lOw-ivltwlfbjILivbvtiiltitt-i-hij-1btt-1bit-ittiltt-lhvt-ibi-f-lftffitvltfit*ilmetthtfiilf-y

11、Liii-ilj.itftltltvltfFjif-lS.iivltiiiifittItvitvt.4）ltvu.tly-t-ifjthec.一.,bbare”.iiynt.fgittbe.,telnegie.te.of”.iay,.n-atto.tie.e-“itghl,.”.,dydy-，ac,li-e.t-、teShili.l,.tie.gi.iarl-nktigeiecrateame.ta.ateoi”.”.，”.li.entilteinnbea.tie-.ni.tui,aC_iU.eleilabkitiec.ec”.-,ail.ii.a.an.tei.aci.f*i.ileadis

12、t.，”.tiell.、.“.of”.a.liii.e.”.ibFnUbepart，.一，“，”a.”、-.i.”.111y-rimi.,fn”.ce.ii，.、.ble-，.at.ntli*il,.”.-.111yr.f.rtii.i-111_1|fidiciii.Ic.eveii.ent,.rir.nbe-.,一Iffi.ti!，rrBiaryfirewrI.ria.iftiugtgrsiiay.0.ni.nent,a.clu.itba.iay.nitc.ietetailnititiir，I.elcli.ififci.ki*Ii.se.tiiigitiar，an.Itu,iayCI-ci.

13、bi.te.gteleda-ir.I.trul.ru,iayc.ICiiuse-Tas,1.i.SIiI，frteiaytieiary.CsetiLi.sIiuSyac.tteiayiilialI*aideetitieiIicL*ifli一itUBseiiuSyr，iUct.an.c.im,rgiri.II，.aa*.entan.Ilieviiinifiay.e.ble*ra,aI.aLI.*ueagai.cru.i.i.iii-.，e,LUtwt.iilfncaeifliftieciL.aI.,irrs.,cairLcL.creciaIdletie.laiii.lbetv.Gi-ri.let

14、aI.bu.inal,tcra,i-iiIIlecili.，a.teiilIf.in.ent.GrsiL.tieri.cii.itIhebelli.nee.ifliretaate.e基因或隐形突变基因的突变表型时，可通过早期加压法（EP）处理母本获得的单倍体卵细胞获得二倍体纯合子。三、斑马鱼作为人类疾病动物模型的生物学特性斑马鱼在基因水平上87%与人类同源，早期发育与人类极为相似，已成为研究相关疾病基因的最佳模式生物。筛选斑马鱼胚胎或成鱼基因库中类似于人类致病或特定功能的基因，构建进斑马鱼受精卵中，观察特定基因在斑马鱼胚胎发育过程所起作用。斑马鱼胚胎发育是全透明的，可以全程观察并研究其发育状况

15、目前，斑马鱼模式生物的使用正逐渐拓展和深入生命体的多种系统（例如，神经系统、心血管系统、免疫系统等）的发育、功能和疾病（例如，神经退行性疾病、心血管疾病、免疫系统疾病等）的研究中，并已用于小分子化合物的规模新药筛选。3.1 神经系统模型斑马鱼研究表明，神经特异性钠离子通道大量表现在中枢和周边感觉神经系统，有效调控神经的兴奋性，其基因表达调控及信号通路是神经学研究重点。阿尔茨海默氏病（AD）是一种由于大脑神经细胞死亡而造成的神经退行性疾病。AD与淀粉样蛋白（A3）的过量表达沉积有关，A3是由APP连续切割产生，而早老素增强子（pen-2）和前咽陷子（Aph-1）参与A3的产生。研究表明，将斑马

16、鱼相关基因的表达进行敲除，发现Pen-2与P53依赖型神经细胞的存活有重要作用。并且在构建绿色荧光蛋白（GFP）转基因斑马鱼品系中，发现在2-3月龄转基因斑马鱼大脑中，广泛大量表达GFP-APP。这些说明斑马鱼神经系统发育在进化上和人类的保守关系。帕金森氏病（PD）与多巴胺能（DA）通路的破坏有关。神经毒物MPTP对人类中脑多巴胺能神经细胞的损伤现象与PD类似。研究者将多巴胺转运蛋白抑制物和MPTP共同作用于斑马鱼幼鱼，发现这些药物具有保护多巴胺能神经细胞的作用。3.2 心血管系统模型斑马鱼胚胎期和幼鱼期为透明体，这为心血管发育的研究提供了良好模型。研究发现，斑马鱼的心脏受损后具有自动修复功能

17、这是首次发现脊椎动物的心脏具有再生功能，为探寻人类心脏受损修复带来希望。斑马鱼突变品系可作为研究心脏节律、心脏管形成、瓣膜发生和心脏环化的模型。例如，突变品系gridlock（gdl）可用于研究人类主动脉缩窄疾病。克隆与斑马鱼同源的人类载脂蛋白基因apoE和apoA-1,发现这些蛋白对哺乳动物脂质的吸收和分布具有重要作用，而Apo-1在AD治疗中也有重要作用。胚胎注射血管内皮因子（VEGF）i-.lOw-ivltwlfb.tiivib-vtiiltitt-i-hij-1btt-1bit-ittiltt-lhvt-ibi-f-lftffitvltfit*ilmetthtfiilf-y-Liii

18、iljiitftltltvltfFjif-lS.iivltiiiifittItvitvt.4)ltvu.tly-t-ifjthecs.0一.,bbares.iiynt.fgittbe.,telstegie.te.of.(lay,.n-atto.tie.e-ghl,.”.,dydy-，a.、-.t-、teShili.l,.tie.st.gi.iarl-nktigeie-.ame.tasateoi”.”.，”.li.entilteinnbea.tie-.ni.tui,aclaiU.eles、b-itie-.”.-,ailstt.asan.teic*i.ileadist.，”.，el-ll.、.“

19、of”.a.liii.e.”.ibFnUbe,，.一,，”“a.”、.ssi.”.111y-rimia*.,0nre.ii,.、.ble-，.at.ntli*il,.tb.ate-ok.111y-ri.2.ofprtii.i-101_1|elictlci.i.Ic.eveii.ent,erlrsvie-s,-tffistictyrrBiaryfirewrI.ria.iftiugtgrsiiays.0.lienent,a.clu.itba.iaysnit.ietetailnitcait,IsLeeltilififisCLi-*InsLse.tiiigiti.I，and.isrrBi.I，Ui-

20、ci.biie.ste.gteledacirLi.tiruesi.eiaynniiuse-TUBelsiillLi,frteiaytieiayleseticinnsLiusyaletteiayii.Ial.eaUeetitieiIicL*ifdoicakntakl,seiiusyaryiucctcs.and-lc.iLB,rgiri.a,.angentandluieVinifiay.e.ble*cauresaid.aLtaIie-ueagai.sru.i.i.iri-sye,cUtwt.gii.truLLnccaeifl-iftieciLueaidsaf,iros,aiiLcL,-reciaI

21、dletieelai111sLbetv.Gi-rn.letaidbulLileB,traeiiiIicaleciligya.teiiliflevin.ent.GrasL.tieri.client,theleali.needsifliretaateset.e,b|tiay._bes.i.cadre,._irajb11acl*el.e.lSece.，-jl.l.ol，I.tsIe.“a11”1che.ll.urterte.tLki.“.,ce.-.h.ci.ut1n，-.ih.-i.theo.-i.1.-o.1.u.，.1as.一.sss,a.e.u一.”.1c.1-tste.te.-te-.e.

22、terta.I.il_etaio.IiL.a，.toigigitte-.-f.i1d.at.,siLitie.i，b.的斑马鱼在发育过程中可以观察到明显的新生血管，而肿瘤的发生与转移又与血管新生有密切关系，这启发人们通过阻断VEGF抑制血管增生而治疗肿瘤。3.3 免疫疾病模型和感染疾病模型斑马鱼具有较完整的特异性免疫系统，体内的T淋巴细胞和B淋巴细胞具有免疫活性，非特异性免疫系统也呈现出与人类的相似性，同时保留了TLR信号通道。成鱼体内注射细菌和胚胎浸没感染法可使斑马鱼感染细菌，有效建立相应的细菌发病机理研究模型。海分枝杆菌感染的斑马鱼体内的肺结核肉芽肿和人类一样出现干酪样坏死，该模型可能

23、在肺结核研究中发挥重要作用。3.4 肿瘤模型肿瘤是造成人类死亡的主要原因之一，斑马鱼可以自发产生肿瘤，并且许多肿瘤与人类肿瘤非常相似，因此，斑马鱼作为最有前途且最廉价的模式生物而被广泛的应用。肿瘤模型的构建主要是通过移植术、化学诱变和基因突变获得。移植术即直接将肿瘤细胞注射到不同发育阶段的斑马鱼的特定部位，或者将含有GFP表达基因的肿瘤细胞显微注射到斑马鱼胚胎或幼鱼中。化学诱变可以快速获得斑马鱼肿瘤模型，例如，诱变剂处理斑马鱼胚胎或幼鱼可以获得肝癌、血管瘤、细胞间质瘤等。但是化学诱变会引起非特异性表型，而且肿瘤定位困难。基因突变则是将含有GFP报告基因的肿瘤基因通过质粒转导到斑马鱼体中，可用以

24、进一步鉴定肿瘤发生的分子机制。3.5 视网膜自动修复机能斑马鱼研究发现，斑马鱼视网膜具有可再生放射状胶质细胞，这些细胞可分化为健康的视网膜细胞，并能自动修复受损视网膜。人类视网膜拥有类似斑马鱼的放射状胶质细胞，但是这些细胞无活性。研究人员已成功将放射状角质细胞分化的视网膜细胞移植到老鼠上，这为激活人类放射状胶质细胞的研究奠定了重要的基础。四、斑马鱼在发育遗传学中的应用斑马鱼作为发育生物学模式生物有很多优势，胚胎清透可见，从受精卵发育到完整的胚胎形成只需24h,发育过程便于观察。GFP转基因技术的运用可对特定组织进行实时观察。可对批量样本进行免疫组化或荧光免疫研究。可对胚胎进行显微注射DNA或R

25、NA,影响基因表达。吗咻代(morpholino)基因敲除技术和异位基因表达技术是目前斑马鱼发育遗传学研究中的新兴技术。2000年，有研究者提出注射吗咻代修饰性寡聚核甘酸可产生基因敲除斑马i-.lOw-ivltwlfbjILivbvtiiltitt-i-hij-1btt-1bit-ittiltt-lhvt-ibi-f-lftffitvltfit*ilmetthtfiilf-y-Liii-ilj.itftltltvltfFjif-lS.iivltiiiifittItvitvt.4）ltvu.tly-t-ifjthec.一.,bbare”.iiynt.fgittbe.,telnegie.te.of

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27、rtii.i-111_1|fidici.i.Ic.eveii.e.t,.rir.nbe-.,letffi.ti!,rrBiaryfirewrI.ria.iftiugtgrsiiay.0.ni.ne.t,a.clu.itba.iay.itc.ieteta.itcait,I.elcli.ifif.m*I.se.tiiugitiary.Itu,iayCI-ci.bi.te.gte.e.a_iilI.trul.ru,iayc.iiuse-TUBe.l.Sli,frteiaytieiary.CsetiLi.sIiuSyac.tteiayiilialI*aideetitieiI.cL*ifli一.taB

28、seiiuSyi，iUct.c.im,rgirilI，.aae.e.t.Ilieviii.ifiay.e.ble*caidle.aid.aLt.*ueagai.cru.i.iii-.ye,LUtwt.iilf.,caeifliftieciL.aidtaf,irrs.,cairLcL.crecia.dletie.laii.betv.Gi-r.letaid.*tcra.I-ii.ilecili”a.teiiltf.i.e.t.GrsiL.tieri.ci.tthelea.i.ee.ifliretaate.et.e,b|tiay.0.i.l.ira.jb11aLl*el.l，.，-jl.l.ol-r

29、kI.tsle.a11.1che.c.u”.teiti.i.1ct.c.-.1b.lI-.t1n，C.to.-I.ti.-cib.-il_.ato.I，.ag.u.11rLic.-tit.t.”-t.-r.”.th.ita.taio.Ihi.e.a，toigNgitt.-.-f.aat.si-Lith.1ar，b.c鱼。吗咻代有抑制翻译起始，减少传统反义寡聚核甘酸非特异性的效应。注射吗咻代能产生以往证实的基因突变的拟表型，有助于确定功能基因。吗咻代寡核甘酸正成为快速、高效的基因敲除方法。对越早期胚胎注射外源基因，基因表达范围就越广，异位基因表达技术就是为使基因在斑马鱼特定细胞、组织和特定时间表

30、达而建立的一系列新技术。如RNAcaging技术，RNA与RNAcaging共价结合时处于非活性状态，经特定波长照射，RNAcaging被破坏，激活RNA,基因得以表达。同样，激光诱导基因表达技术即外源基因与热休克蛋白启动子重组，激光热敏效应启动基因表达。五、斑马鱼在生态毒理学中的应用斑马鱼模型最早用于发育生物学和遗传学研究，近几年，斑马鱼模型逐渐应用于生态毒理研究和检测技术。常规毒性实验中的应用斑马鱼模型可用于急性毒性实验、慢性毒性实验，以及蓄积毒性实验。斑马鱼急性毒性实验用于检测各种农药、有机试剂和污染物等的急性毒性。斑马鱼胚胎比成年斑马鱼敏感，对于急性毒性方面是一个很好研究模型，可于显微

31、镜下观察胚胎发育的生态毒理学终点。慢性毒性实验测定低浓度污染物在斑马鱼生活周期内的毒性作用，来确定化学物质最大容许浓度及其影响程度。通过慢性毒性实验可观察同种鱼在不同发育阶段（发育代）对化学物质的毒性差异。蓄积实验则检测外来化学物质在机体内蓄积或富集性大小的实验。分子及细胞生态毒理中的应用化学物质进入生物体后，对生物产生不同程度的危害。生物在受到损伤或致死前，其行为、生理、生化已发生反应，可以选择这些在分子和细胞水平上的指标测定化学物质对生物的影响。例如，在斑马鱼胚胎发育晚期，硫代硫酸钠可刺激胚胎细胞的大量异常增殖，这些异常细胞会引起胚胎的部分器官发育畸形。可通过胚胎、软骨组织染色，或全组织包

32、埋原位杂交等技术进行显微观察。水质检测中的应用运用转基因斑马鱼的某些效用元件来显示其接触的特定污染物可检测水质的变化。例如，斑马鱼可检测水环境中雌激素污染，当水样中存在一定浓度的雌激素时，会发现斑马鱼发育过程中出现性别的干扰和反转现象。而转基因斑马鱼DNA具有环境污染物的效应元件，效应元件结合报告基因，例如GFP,当水体中含有待检测环境污染物时，基因被激活并与报告基因共同表达，使鱼体呈现荧光。he.-nomicI|mentiten.01n.ec.nd.r-nbre.|Iniiyit.fgI.tc.utlnlUntoini.icLev.I|.ent,.rir.viewLi.,一tff!”ctyr

33、rB|1.nna.e一.cinl.ici|.entnew.I.if”.liy|.tIne.ghente.neif_|in.illy,ttaaecagell-attiundet|.，firrerinri.liftiugt-g|.，.m.umiceL-n*and_ii.ic,nnitI-hein一.“t”7nni.l.Lne-nirm.l-al.,aahene-giid,ehanceVgrgi-igne-,1,lil，l，l，a.、-ntIl.lIhtlal|a，.nitc.|etetandnitht,，i.deeldinififcnci-nn*in.ilelthiight|ar，and.K-r.

34、ar，creiilad-cannit,.tne-nirmaa.h-n,|U-rkldi,aIddidnldrygiidife-n.aedueYune-ni.*.rnitJandnitlii|.entfide.|rimiete.|，eif.I-uHe.r.and.|le.enttheCPCCeeta”.dieiedve|ia.if”，ad、|rii,.|leShiLi.i,gaai.thernmak.enghandhard-irkti.eheceaeamenta.Iaeifi.|eaIin,reir.addl|.entifIe|rimiteandtheide.Inin.IUh,aclaccrd

35、ingIIela-ellallbhthecrecee.ve-,and.tieIce-a.IadIeiatce|e|leadh.tiieci.linnedHengteneda_irdingtirue.rue|a，cnncii-eTaee.innili，frIe|a，the|at，Exec.eticinnliIl-acette|a，.|iliallieaideetithencieifd-icatcntakl,iIl-car，iUcIc.andlciio,rgiridaiy.angentandn|erViinif|ayme.le.一eIi.eatinaa.l.，ga.ad.age.t-a.-1-1a

36、teten”.”-Ie-、ennur”Ie.rta-ing.-etai1nhi、na，-tghghtIef-u-f”1aat，n,.ic-ihthe1ar，1acnetIema.rde-iin.adara.get.ifIecentaldO|metifFuia,agiidgra.ifIeildSima-,gee|.et|rec.in.gniia.Ie|ier，.(-L.-一-.L.II-I一-I-I一.dre.,and.aintain|re.ureagain.tcirru|tiin.ii.|rive.t，le,cultivatinggiidfa.il，traditiin,careiffa.ili

37、e.ifthechildrenacirrectl，handletheelaiin.ileKenGiernaetandlu.ine.,ticreatefre.h|iliticalecilig，andthe|ilitic.ifenvirin.ent.G-i.thelaringcinent,theleaningneed.ifmireIaaIe.e六、展望斑马鱼作为人类疾病研究模型、发育遗传学研究模型和生态毒理学研究模型在人类健康、医学和环境保护等领域发挥重要作用。斑马转基因技术对分析细胞间相互作用，作为动物模型探讨发育、生长、繁殖等机理，以及阐明控制脊椎动物的发育机制等方面具有重要意义。learni

38、ngiutcime.,and.timulatetdifferentgriu|.if|art，memler.,nngaieeam|a.a-arning.heetumif|ar，mle.tI.Id，andinitatveI.im|rivei|ar，mole.andinthe.Payin.iudlevclilicalcinditiin.,ine|ilic，,|reventingtn.n.iedicllin.1thhsatcf-.inmchlrac|erqmre.ClcIvldevel|meIandim|riVnggivenmetiga.，e,eIhacetheeficentfirmali.mandt

39、hemitiin.ti|reventriutinea.ide,|reventingea.，tii|en,hi-man，nitt.ditiuige.uiyenut.Iga.teml.idngItheiacual-ika.nneltidl|.aning|lan.,chii.etheiri-nlearningcintentandm.Iiid.e-eiula.yiurlaringlracIi、aie,a，memle.eichnu.ti.eemieintheti|eve，|ar，molermu.male|r-etaiin.aidiiin.arudt|i.utiri.andin.tutin.ifIelay

40、heeIe|aymole.I|ariincl.3.aningImeifIiayy,titaifI.a.ncyifautii.,ticra.irIiB-i.frmanne-I|icnin|ulcecnimcirganiatin.andin.tutin.|ar.ii.in.iud.ikIIlecmeIu,.ievl|ment|iInee,lDdi.|innee.intgrh|ineer,|rimitehaminy|iinner,|iineelingcadeaahiudra_lean,adundeSaer.tificu.uldtaketheleandingifIeiia|.c|.,-ihcnvcin

41、iIn.Fraci.fadfat,selracg-eaPar，ee.-1,Iraciaffectiin,-ithami.iintilearn,-ithiaueiuses,Iet_eiI|art，lranche.ti.trengthe|art，memleradi.ci|li-rsecgu-nneaedeingrrquemen.,|.dheretithefundamentl|ur|iie,|latmei0Imint.EichlaI|ayIcturs,m.cu.iinti|icscanilealhriughreadidune.aciridngItngactivitie.andkni-ledgeheneed.e-cigthecim|etitiin.,characteri.tic.if