人工染色体PPT课件.ppt
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1、第六章第六章人工染色体人工染色体vv生物体的许多重要性状牵涉到复杂的生理生生物体的许多重要性状牵涉到复杂的生理生化反应系列,受多基因或基因簇的控制,与化反应系列,受多基因或基因簇的控制,与成百至上万千碱基的成百至上万千碱基的DNA片段相关。片段相关。vv复杂基因组的物理作图和基因的定位克隆也复杂基因组的物理作图和基因的定位克隆也涉及到大片段涉及到大片段DNA的研究。的研究。vv因此,因此,提高载体的容纳量提高载体的容纳量一直是克隆载体的一直是克隆载体的重要发展方向之一。重要发展方向之一。vv随随着着脉脉冲冲电电泳泳技技术术的的发发展展以以及及基基因因组组研研究究的的日日益益深深入入,对对可可插
2、插入入大大片片段段DNA的的克克隆隆载载体体人工染色体人工染色体的研究取得了迅速的发展的研究取得了迅速的发展vv所所谓谓人人工工染染色色体体是是一一类类能能在在生生物物细细胞胞中中独立独立“稳定存在和遗传的人工重组稳定存在和遗传的人工重组DNA分子分子”。v酵母人工染色体载体(酵母人工染色体载体(yeastartificialchromosome,YAC,1000kb)v细菌人工染色体(细菌人工染色体(bacterialartificialchromosome,BAC,300kb)v哺乳类人工染色体(哺乳类人工染色体(MAC)vP1衍生人工染色体衍生人工染色体现正在研究的人工染色体现正在研究的
3、人工染色体总结一、一、YAC的基本序列元件的基本序列元件酵母染色体酵母染色体酵母染色体酵母染色体DNADNA自主复制顺序(自主复制顺序(自主复制顺序(自主复制顺序(ARSARS)酵母染色体的酵母染色体的酵母染色体的酵母染色体的着丝粒顺序(着丝粒顺序(着丝粒顺序(着丝粒顺序(CENCEN)酵母染色体的酵母染色体的酵母染色体的酵母染色体的端粒顺序(端粒顺序(端粒顺序(端粒顺序(TELTEL)第一节第一节 YAC酵母人工染色体酵母人工染色体vvYAC YAC 载载载载体体体体主主主主要要要要是是是是用用用用来来来来构构构构建建建建大大大大片片片片段段段段 DNA DNA 文文文文库库库库,特特特特别
4、别别别用用用用来来来来构构构构建建建建高高高高等等等等真真真真核核核核生生生生物物物物的的的的基基基基因因因因组组组组文文文文库库库库,并并并并不不不不用用用用作作作作常常常常规规规规的的的的基基基基因克隆。因克隆。因克隆。因克隆。正正正正常常常常酵酵酵酵母母母母人人人人工工工工染染染染色色色色体体体体含含含含有:有:有:有:*四膜虫端粒(四膜虫端粒(四膜虫端粒(四膜虫端粒(teltel)定定定定位位位位于于于于染染染染色色色色体体体体末末末末端端端端一一一一段段段段序序序序列列列列,用用用用于于于于保保保保护护护护线线线线状状状状的的的的 DNA DNA 不不不不被被被被胞胞胞胞内内内内的的
5、的的核核核核酸酸酸酸酶酶酶酶降解,形成稳定的结构降解,形成稳定的结构降解,形成稳定的结构降解,形成稳定的结构vv酵母自主复制序列(酵母自主复制序列(ARS)一一段段特特殊殊的的序序列列,含含有有酵酵母母菌菌中中DNA进进行双向复制所必需的信号。行双向复制所必需的信号。vv酵母着丝点酵母着丝点酵母着丝点酵母着丝点(CEN)(CEN)有有有有丝丝丝丝分分分分裂裂裂裂过过过过程程程程中中中中纺纺纺纺锤锤锤锤丝丝丝丝的的的的结结结结合合合合位位位位点点点点,使使使使染染染染色色色色体体体体在在在在分分分分裂裂裂裂过过过过程程程程中中中中能能能能正正正正确确确确分分分分配配配配到到到到子子子子细细细细胞
6、胞胞胞中中中中。在在在在 YACYAC中中中中起起起起到到到到保保保保证证证证一一一一个个个个细细细细胞胞胞胞内内内内只只只只有有有有一一一一个个个个人人人人工工工工染染染染色色色色体体体体的的的的作用。作用。作用。作用。pYAC4pYAC4:酵酵酵酵母母母母第第第第四四四四条条条条染色体的着丝粒。染色体的着丝粒。染色体的着丝粒。染色体的着丝粒。vvYACYAC载体的选择标记载体的选择标记载体的选择标记载体的选择标记vv主要采用营养缺陷型基因主要采用营养缺陷型基因主要采用营养缺陷型基因主要采用营养缺陷型基因TRP1:色氨酸生物合成基因缺陷型:色氨酸生物合成基因缺陷型URA3:尿嘧啶生物合成基因
7、缺陷型:尿嘧啶生物合成基因缺陷型LEU2:亮氨酸合成基因缺陷型:亮氨酸合成基因缺陷型 SUPSUP 4 4:赭石突变抑制基因:赭石突变抑制基因:赭石突变抑制基因:赭石突变抑制基因 作作作作用用用用方方方方式式式式:YACYAC载载载载体体体体配配配配套套套套工工工工作作作作的的的的宿宿宿宿主主主主酵酵酵酵母母母母菌菌菌菌(如如如如AB1380AB1380)的的的的胸胸胸胸腺腺腺腺嘧嘧嘧嘧啶啶啶啶合合合合成成成成基基基基因因因因带带带带有有有有一一一一个个个个赭赭赭赭石石石石突突突突变变变变 adeade 2-12-1。带带带带有有有有这这这这个个个个突突突突变变变变的的的的酵酵酵酵母母母母菌菌
8、菌菌在在在在基基基基本本本本培培培培养养养养基基基基上上上上形形形形成成成成红红红红色色色色菌菌菌菌落落落落,当当当当带带带带有有有有赭赭赭赭石石石石突突突突变变变变抑抑抑抑制制制制基基基基因因因因 supsup44的的的的载载载载体体体体存存存存在在在在于于于于细细细细胞胞胞胞中中中中时时时时,可可可可抑抑抑抑制制制制 adeade 2-12-1基因的突变效应,形成正常的白色菌落。基因的突变效应,形成正常的白色菌落。基因的突变效应,形成正常的白色菌落。基因的突变效应,形成正常的白色菌落。vv由由于于酵酵母母的的染染色色体体是是线线状状的的,因因此此其其在在工工作作状状态态也也是是线线状状的的
9、但但是是,为为了了方方便便制制备备YAC载载体体,YAC载载体体以以环环状状的的方方式式存存在在,并并增增加加了了普普通通大大肠肠杆杆菌菌质质粒粒载载体体的的复复制制元元件件和和选选择择标标记记,以以便便保存和增殖。保存和增殖。二、克隆策略二、克隆策略vvYAC克克隆隆DNA片片段段的的过过程程是是:目目的的基基因因在在限限制制性性内内切切酶酶酶酶解解后后变变成成大大片片段段DNA,克克隆隆进进酵酵母母载载体体DNA,转转染染酵酵母母缩缩主主细细胞胞,扩扩增增后后,根据标记性状筛选出重组的人工染色体根据标记性状筛选出重组的人工染色体三、三、YAC克隆系统的特点克隆系统的特点v1、YAC作作为
10、为可可提提供供大大片片段段DNA的的方方法法,简简化化了了构构建建染染色色体体延延伸伸区区域域图图谱谱和和分分离离完完整整基基因的过程(因的过程(200500kb,甚至甚至1000kb)v2、用用酵酵母母为为宿宿主主重重新新构构建建大大的的人人类类基基因因区区段段,可将小的重叠的可将小的重叠的YAC变成一个大的变成一个大的YACv3、酵酵母母作作为为一一种种真真核核生生物物,为为其其它它真真核核的的DNA提供了更合适的环境提供了更合适的环境四、四、YAC克隆系统的克隆系统的缺点缺点vv首首首首 先先先先,在在在在 YACYAC载载载载 体体体体 的的的的 插插插插 入入入入 片片片片 段段段段
11、 会会会会 出出出出 现现现现 缺缺缺缺 失失失失 (deletiondeletion)和和和和基基基基因因因因重重重重排排排排(rearrangementrearrangement)的的的的现现现现象。象。象。象。vv其其其其次次次次,容容容容易易易易形形形形成成成成嵌嵌嵌嵌合合合合体体体体。嵌嵌嵌嵌合合合合就就就就是是是是在在在在单单单单个个个个YACYAC中中中中的的的的插插插插入入入入片片片片段段段段由由由由2 2个个个个或或或或多多多多个个个个的的的的独独独独立立立立基基基基因因因因组组组组片片片片段段段段连连连连接接接接组组组组成成成成。嵌合克隆约占总克隆的嵌合克隆约占总克隆的嵌合
12、克隆约占总克隆的嵌合克隆约占总克隆的 5%5%50%50%。vv YACYAC染染染染色色色色体体体体与与与与宿宿宿宿主主主主细细细细胞胞胞胞的的的的染染染染色色色色体体体体大大大大小小小小相相相相近近近近,影影影影响响响响了了了了YACYAC载载载载体体体体的的的的广广广广泛泛泛泛应应应应用用用用。YACYAC染染染染色色色色体体体体一一一一旦旦旦旦进进进进入入入入酿酿酿酿酒酒酒酒酵酵酵酵母母母母细细细细胞胞胞胞,由由由由于于于于其其其其大大大大小小小小与与与与内内内内源源源源的的的的染染染染色色色色体体体体的的的的大大大大小小小小相相相相近近近近,就很难从中分离出来,不利于进一步分析。就很
13、难从中分离出来,不利于进一步分析。就很难从中分离出来,不利于进一步分析。就很难从中分离出来,不利于进一步分析。返回第二节第二节细菌人工染色体(细菌人工染色体(BAC)一、一、一、一、BACBAC特点特点特点特点1 1、是是是是以以以以大大大大肠肠肠肠杆杆杆杆菌菌菌菌的的的的F F因因因因子子子子的的的的重重重重要要要要位位位位点点点点及及及及基基基基因因因因为为为为主主主主体体体体的的的的高高高高通通通通量量量量低低低低拷贝拷贝拷贝拷贝的质粒载体。的质粒载体。的质粒载体。的质粒载体。2 2、F F因子的特点因子的特点因子的特点因子的特点vv又又又又称称称称致致致致育育育育因因因因子子子子,是是
14、是是一一一一个个个个100100kbkb的的的的质质质质粒粒粒粒,能能能能整整整整合合合合到到到到宿宿宿宿主主主主染染染染色色色色体体体体中。并能高频率的转移遗传标记。中。并能高频率的转移遗传标记。中。并能高频率的转移遗传标记。中。并能高频率的转移遗传标记。vvF F因因因因子子子子在在在在大大大大肠肠肠肠杆杆杆杆菌菌菌菌中中中中的的的的复复复复制制制制受受受受到到到到严严严严格格格格控控控控制制制制而而而而保保保保持持持持低低低低拷拷拷拷贝贝贝贝,一一一一般般般般为为为为每每每每细细细细胞胞胞胞1 12 2个个个个拷拷拷拷贝贝贝贝,其其其其parBparB基基基基因因因因能能能能够够够够排排
15、排排斥斥斥斥细细细细胞胞胞胞中中中中的的的的外外外外源源源源性性性性F F质质质质粒粒粒粒,限限限限制制制制了了了了细细细细胞胞胞胞内内内内质质质质粒粒粒粒分分分分子子子子间间间间的的的的重重重重排排排排,降降降降低低低低了了了了BACBAC中外源基因的重组和嵌合度中外源基因的重组和嵌合度中外源基因的重组和嵌合度中外源基因的重组和嵌合度vv带带带带有有有有外外外外源源源源片片片片段段段段的的的的BACBAC载载载载体体体体在在在在细细细细菌菌菌菌细细细细胞胞胞胞(重重重重组组组组缺缺缺缺陷陷陷陷型型型型,recrec)中中中中通通通通常常常常仅仅仅仅单单单单个个个个拷拷拷拷贝贝贝贝,这这这这一
16、一一一特特特特点点点点有有有有利利利利于于于于保保保保持持持持DNADNA大大大大分分分分子子子子在在在在细细细细胞胞胞胞内内内内稳定复制而不发生重组,尤其是重复序列多的稳定复制而不发生重组,尤其是重复序列多的稳定复制而不发生重组,尤其是重复序列多的稳定复制而不发生重组,尤其是重复序列多的DNADNA大分子大分子大分子大分子vv克隆克隆克隆克隆350350kbkb F F因因因因子子子子具具具具有有有有携携携携带带带带1Mb1Mb插插插插入入入入片片片片段段段段的的的的潜潜潜潜能能能能,这这这这就就就就使使使使构构构构建建建建具具具具有有有有大大大大容量克隆能力的载体成为可能容量克隆能力的载体
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