靶向高通量测序技术应用于感染性疾病专家共识.docx

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1、靶向高通量测序技术应用于感染性疾病专家共识摘要感染性疾病仍是全球重要的公共卫生威胁之一，及时准确的病原学检测对于感染性疾病的诊治至关重要。传统的病原体检测方法，如涂片镜检法、培养法、免疫学方法和分子生物学技术等，在临床检测中发挥着各自优势，但也存在不同的局限性。目前，靶向高通量测序技术（targetednextgenerationsequencing,tNGS）在感染性疾病病原体检测中显示出较大潜力。随着技术的不断进步和成本的进一步降低，tNGS预计将在感染性疾病的诊断和治疗中得到更广泛的应用。为保证tNGS在临床应用更加规范，提高tNGS技术应用于感染性疾病病原体诊断的质量，明确tNGS应用

2、场景，有效实施质量管理，特组织领域内专家编写制订本共识，希望本共识有益于业界的良性互动，使该技术为临床抗感染诊治能力提升提供帮助。关键词：靶向高通量测序;感染性疾病;诊断;专家共识近年来，全球感染性疾病发病率虽有所下降，但仍是人类健康的主要威胁之一。在治疗感染性疾病的过程中，准确和及时的病原学诊断至关重要。目前，传统的病原体检测方法各有优势和局限性：（1）培养是部分病原体诊断的“金标准”，但是耗时长且阳性检出率低；（2）抗原抗体等免疫学方法检测速度快，但准确度有待提升；（3）聚合酶链反应（POIymeraSechainreaction,PCR）技术特异度和敏感度高，但是检测覆盖病原体有限。Sa

3、nger测序技术在过去30测序方法tNGSmNGS探针捕获多重PCR点靶向病原谱外的微生物存在局限性；(2)样品制备中的文库制备富集步骤会增加污染风险(几十到几百种)，针对性富集，病原谱外的微生物存在局限性；(2)样品制备中的目标核酸富集步骤会增加污染风险；(3)核酸完整性要求高，不适用于无菌体液(如血液、脑脊液等)干扰；(2)费用相对较高；(3)测序数据量推荐20M以上表ItNGS与mNGS在不同病原体检测中的优缺点注：tNGS.靶向高通量测序；mNGS.宏基因组二代测序；PCR.聚合酶链反应目前，tNGS在感染性疾病病原体检测中显示出较大的潜力，可能成为一种更优的检测手段。随着技术的进步和

4、成本的进一步降低,tNGS有望在临床上得到更广泛的应用。为了提高tNGS技术在感染性疾病病原体诊断中的质量，明确tNGS应用场景，有效实施质量管理，保证tNGS在临床应用中更加规范，国家感染性疾病临床医学研究中心、深圳市医学会感染病专业委员会和深圳市医疗感染性疾病临床质量控制中心组织领域内专家制订本共识。本共识采用2011版牛津大学循证医学证据分级与推荐意见强度分级方法即(2),对循证医学证据等级和推荐意见强度进行了评估，最终形成24条建议。希望本共识有益于业界的良性互动，使该技术为临床抗感染诊治能力提升提供帮助。推荐强度证据级别描述AIa随机对照试验(randomizedcontrolled

5、trials,RCT)的系统评价Ib结果可信区间小的RCTIc显示“全或无效应”的任何证据B2a队列研究的系统评价2b单个的队列研究（包括低质量的RCT,如失访率20%者）2c基于患者结局的研究3a病例对照研究的系统评价3b单个病例对照研究C4病例系列报告、低质量队列研究和低质量病例对照研究D5专家意见（即无临床研究支持的仅依据基础研究或临床经验的推测）表22011年牛津大学证据分级与推荐意见强度分级标准1临床适应证建议L对于以下疑似下呼吸道感染的非重症患者，建议进行tNGS检测：（1）传统微生物检测尚未明确病原体；（2）经验性抗感染治疗23d效果不佳；（3）高危人群包括儿童、老年人、孕妇、肥

6、胖和存在基础疾病等（B2b）。下呼吸道感染是常见且多发的感染性疾病，临床表现多样，是导致患者病情恶化乃至死亡的重要因素。下呼吸道感染的病原体类型复杂，如病毒、细菌、真菌、其他非典型病原体或混合感染等。急性下(turn-aroundtime,TAT)更快,31.9%的BSl患者在根据tNGS结果进行针对性抗感染治疗调整后病情获得了临床改善越O建议4：对于以下疑似泌尿系统、脊柱关节感染的患者，建议进行tNGS检测：（1）传统微生物检测结果阴性；（2）经验性抗感染治疗23（1效果不佳（B2b）。研究发现，tNGS在关节假体感染（PeriPrOSthetiCjointinfection,PJD中的诊断

7、敏感度和特异度与培养和mNGS相当。其中tNGS和mNGS的敏感度分别为88.37%和93.02%,特异度分别为95.24%和95.24%,但tNGS在成本和检测TAT方面优于mNGS噌幽切。及时完善病原学检测并积极抗感染治疗非常重要，传统尿液培养方法干扰因素较多，培养阳性率较低，检测种类有限。tNGS检测尿路感染病原体具有快速、灵敏和全面的优势，在尿培养结果尚未报告甚至阴性时，tNGS检测结果具备一定的临床参考价值，可作为传统检测方法的有效补充，有利于对患者病情的综合判断，具有较好的临床应用价值,o有研究表明，与传统的尿液培养和PCR检测相比，tNGS在复杂和混合感染的尿路感染性疾病中，表现

8、出识别多种微生物和提供更详细诊断信息方面的潜力建议5：对于结核分枝杆菌，耐药基因与表型一致性较高的物种,若需进行耐药检测，建议采用tNGS检测方法（B2b）。tNGS针对结核分枝杆菌耐药基因的预测被认为是用于判断其耐药性的重要依据应组。2023年，世界卫生组织（WorldHealthOrganization,WHO)发布了运用全基因组测序(wholegenomesequencing,WGS)和tNGS进行耐药结核分枝杆菌诊断的指南推荐。与传统方法相比，tNGS可以更加快速识别结核分枝杆菌的谱系和耐药性5O有研究显示，tNGS(63.1%,82/130)对结核分枝杆菌的检出率明显高于AFB涂片(

9、32.3%,42/130)、培养(32.3%,42/130)和免疫学检查(48.6%,63/130),且与XPertMTB/RIF检测的敏感度相当(75.5%比74.5%)o另一项研究显示，tNGS对不同耐药谱结核分枝杆菌的检测结果和WGS高度一致，敏感度和特异度分别为97.0%和99.1%,且与表型药物敏感性测试(phenotypicdrugsusceptibiIitytesting,pDST)的一致性为98.5%。Uddirl等3对264份经XpertMTB/RIF测定确认的利福平耐药或敏感的结核病患者的痰液样本进行了pDST线性探针分析(Iineprobeassay,LPA)和tNGS检

10、测，并将tNGS的耐药检测结果与pDST、LPA和复合参考标准(PDST或LPA耐药)进行了比较，tNGS对利福平、异烟脱、氟唾诺酮类和氨基糖甘类的敏感性较高，但对乙胺丁醇、链霉素、乙硫异烟胺和此嗪酰胺的敏感性相对较低。SibandZe等组的一项前瞻性队列研究结果显示，tNGS能够从粪便样本中识别出耐药基因，这为难以提供呼吸道样本的结核病患者提供了获取关键诊断信息的机会。上述研究表明，tNGS是一种有效的药物敏感性测试(drugsusceptibilitytesting,DST)解决方案，可为精准医学指导的耐药结核病治疗提供所需的临床信息。建议6：对于以下感染情况，优先考虑InNGS送检：(1

11、)传统方法检测病原体尚未明确且病因不明的危重症患者；(2)病因不明的免疫功能缺陷或抑制患者；(3)社区聚集疑似新发病原体暴发流行的病例(B2b)o免疫功能抑制患者发生感染时，病原体较免疫正常患者更为复杂,不仅容易受到常见病原体感染，还有大量机会性病原体感染和混合感染，且起病隐匿、进展快速、预后差及病死率高，故应特别重视，尽早明确病原学诊断。多项研究显示，mNGS覆盖的病原体更广泛、临床符合率高，能发现更多的细菌、真菌、病毒及混合感染等画班回。研究显示，支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolarlavagefluid,BALF)mNGS在成人重症社区获得性肺炎(SeVerecommunit

12、y-acquiredpneumonia,SCAP)患者中具有较高的微生物检出率，进一步分析发现成人SCAP患者中最常见的病原体在免疫功能正常和免疫功能低下患者之间有所不同，mNGS检测可能是早期识别SCAP患者潜在病原体以启动精准抗菌治疗的有力工具诬。另一项前瞻性研究表明，仅使用常规培养法时病原体检出率为14.4%(43/299),联合常规培养、抗原检测及PCR法时病原体检出率为40.8%(122/299),而联合mNGS检测后病原体检出率高达74.2%(222/299)o进一步分析发现，病因明确和病因不明患者病死率分别为21.7%(43/198)和25.9%(20/77)。综上所述，早期联合

13、检测可提高病原体检出率，有利于降低患者病死率。社区性感染暴发应采取准确、快速、全面的方法以尽快明确病原体，医院感染管理科、疾病预防控制中心等部门方可根据病原体采取有效的防控措施。tNGS针对的是已知的、临床常见的病原体，因此对于新发病原体，该方法很有可能会发生漏检，此时mNGS具有病原体覆盖更广的优势E-o建议7：tNGS检测结果判读需结合患者的病情、标本类型和实验室检测结果，必要时结合文献资料综合判读；对于病情严重且病因不明的患者，建议感染科、病原微生物团队及相关临床科室多学科会诊(B3a)O在临床中，同一患者常同时检测多种类型的标本，例如BALF和外周血等。这种多标本检测为致病菌的判断提供

14、了更丰富的参考信息。在多学科会诊中由感染科医师对患者进行详细的评估，以确定是否存在潜在的感染病因。考虑到病因可能涉及复杂的微生物群落关系，建议进行病原微生物的深入分析，包括识别微生物群体的组成及其与患者病情的相关性，可能需要涉及其他临床科室，建议感染科、病原微生物团队及相关临床科室多学科会诊画组o2tNGS的实验流程建议建议8：尽量在使用抗菌药物治疗前，采集临床疑似感染患者的样本，并且优先选择采集感染部位的样本。实验室需对来自疑似感染部位的各种类型样本建立完整的前处理流程,充分保障生物安全性(C4)怀疑上呼吸道感染时，可选择鼻咽拭子/口咽拭子；怀疑下呼吸道感染，尽可能采集BALF进行检测，提高

15、检测结果的准确性。痰液采集过程中容易受到口腔和上呼吸道的定植菌影响，会干扰致病菌的准确检出。BALF直接来自肺部病变区域，能更准确地反映肺泡内的病理状态，并且针对BALF进行病原体检测具有更高的准确性，可以为肺部感染的诊断和治疗提供更有力的支持。样本采集建议在使用抗菌药物治疗之前，如果患者已经使用抗菌药物治疗，应在下一次用药之前进行采集。样本的选择须结合患者自身情况、流行病学、病原体特性、受累器官及感染部位等状况综合考虑，优先选择采集感染部位的样本应，不同样本采集及注意事项见表样本类型取样量建议采样管储存条件运输条件注意事项支气管肺泡灌洗液3mL无菌、干燥洁净冻存管-80C以下保存，禁止反复冻

16、融（不可超过3次）取样后立即送检（2h内最佳）；干冰运输（7d内，l3d最佳）弃去前段可能污染的部分，收集其余部分约3mL以上立即送检痰液3mL无菌、干燥洁净冻存管-80C以下保存，禁止反复冻融（不可超过3次）取样后立即送检（2h内最佳）；干冰运输（7d内，3d最佳）深部痰最佳；不能进行深部咳痰的患者，也可考虑通过气管镜获取标本咽拭子（鼻咽/口咽拭子）三2支干拭子+5mL无菌、干燥洁净冻存管-80C以下保存，禁止反复冻融（不可超过3次）取样后立即送检（2h内最佳）；干冰运输（7d内，3d最佳）无菌拭子采集，擦拭多次，尽可能多采集，而后立即置入专用保护液的拭子采集管中血浆1.2mL无菌、干燥洁净

17、冻存管4暂存(24h),-20。C保存(7d),-80C长取样后立即送检（2h内最佳）；干冰运输（7d内，采血后在规定时间内进行血浆分离；吸取上清（即血浆），转入冻存管中，切勿吸入红细胞及白细胞流程的性能，必须包括对照组和患者数据集的分析与比较，并通过常规实验室结果确认最终结果的准确性。目前，这些方面缺乏统一的标准。不同实验室或公司可能采用不同的分析流程，因此需要详细记录所使用的生物信息学方法，包括软件的名称、版本和主要命令等。3质量控制建议12：实验室应通过合理的布局、环境洁净度控制、单向工作流程、严格的去污染方案和对照的设置等降低污染风险，尤其采用专用操作空间，以最大程度减少气溶胶污染（B

18、3a）。采用tNGS进行感染性疾病诊断的最大挑战是污染导致的假阳性。污染来源包括实验室试剂或环境中检测到的背景微生物和气溶胶污染侬包。在样品收集、核酸提取、文库制备和混样过程中引入的少量外源DNA或RNA都能从污染的读长中产生可检测的信号组。此外，实验室物品表面、耗材和试剂可能均含脱氧核糖核酸酶（DNaSe）/RNaseo因此，tNGS检测的复杂性要求操作人员训练有素，样品处理过程需格外小心，以避免操作错误和交叉污染。止匕外，各实验室也应通过一些去污染方案严格控制批次内、批次间的交叉污染，如通过在每轮PCR中引入样本唯一标签，并通过生信流程自动识别和校准来严格控制批次内交叉污染L另一方面，可以

19、在扩增体系中引入脱氧尿甘三磷酸CdUTP）/热敏尿喘咤DNA糖基化酶（UDG）防污染技术，以清除PCR残余产物，从源头阻断批次间污染&恒o建议13：实验室的核酸提取流程(手工法或者试剂盒法)应经过验证；测序原始数据应进行质量控制，确保测序原始数据的质量(C4)O不同的测序平台可能会产生不同类型的读长，例如单端和双端、短读长(50300bp)和长读长(1000bp),故实验室应根据不同测序平台及样本类型选择不同试剂盒和检测流程。寡核甘酸的设计和合成质量直接影响tNGS检测的成功率和数据质量，因此需要对合成寡核甘酸材料的来源、寡核甘酸的质量和数量进行质控。同时数据与序列管理需要有检验医师、临床医师

20、的综合团队参与。建议14：建议下机数据中单样本平均数据量21M,识别正确率超过99.9%的碱基占比(Q30)85%(B3b)。测序数据量直接关系到tNGS应用于感染性疾病病原体诊断的敏感度和特异度。较高的数据量可以提高低丰度病原体的检出率，并且有助于区分真正的病原体序列与背景噪音，减少假阳性和假阴性结果,从而提高诊断的准确性侬位o建议15：tNGS技术中阳性阈值的设定对于确保检测的敏感度、特异度和临床意义至关重要,需基于实验数据、统计分析、临床意义、病原体特性、样本类型、测序平台、生物信息学数据库、质控标准及相关标准或指南等，并保证结果的可重复性(C4)o各实验室在分析tNGS结果时对于阳性阈

21、值的设定至关重要。特别是针对不同的病原体，可能具有不同的阳性阈值。各实验室应该基于自身的tNGS检测流程，结合临床意义，考虑不同病原体的生物学特性，并基于大量的实验室数据和统计分析，设定相应的阳性阈值,阈值应确保检测结果具有良好的可重复性，符合行业规范。建议16：建议对整个检测和分析流程中的参考样品（代表物种）的检出限、精密度、准确性、稳定性及重复性等进行确认（B3a）。对整个检测和分析流程中的参考样品（代表物种）进行确认是确保实验室检测性能的关键。建议确认包括检出限（最小可检测量）、精密度（结果的一致性）、准确性（结果的正确性）、稳定性（分析物在特定条件下的保持能力）和重复性（在相同条件下重

22、复实验的一致性）o这些性能确认步骤应通过使用阴性、阳性质控和标准参考品，在不同时间点、不同操作人员和不同仪器上重复实验来完成，以确保检测方法的可靠性和实验室间的可比较性。还应包括方法比较研究，以及对检测流程中可能引入的偏差和干扰因素的评估。此外，比较tNGS结果与传统微生物学方法和其他分子诊断技术的一致性也十分必要。建议17：实现tNGS医疗机构本地化检测能够较好地进行实验室管理与人才培养，提高对抗传染病的应急响应能力（D5）o随着科技的进步和医学诊断需求的提升，越来越多的医院选择在内部建立先进的检测平台，以应对日益复杂的医疗挑战和提升患者诊疗需求。医院内部建立检测平台能够提升医院的技术水平和

23、运营水平。医院可以根据自身的临床实践和病例特点定制检测流程，更好地满足特定的临床需求。其次，医院内部检测能够显著缩短样本处理和结果报告的时间，有助于医疗团队更迅速地获取关键的诊断信息，从而及时调整治疗方案并提供紧急护理，也有助于更好地控制传染病的传播;在复杂病例中，更短的检测周期可为临床多学科诊疗（multi-disciplinarytreatment,MDT）探讨争取时间，有助于更有效地指导临床治疗。医院开展本地化tNGS检测面临的挑战主要包括技术人员的质控意识、仪器设备校准、方法学性能验证，以及实验室环境控制和安全保证等方面，以确保本地化检测的准确性、可靠性和安全性。4报告解读建议18：t

24、NGS结果的报告应包含患者和送检机构的基本信息、详细的tNGS检测方法、检测范围、检测结果及其解释、质量控制措施、专业的报告格式、结论和建议、报告解释权和联系方式，以及相关的参考文献（B3a）o报告的基本内容应该包含：（1）患者的姓名、性别、年龄及病历号等个人信息；（2）送检科室的名称、联系方式和送检医师等相关信息；（3）样本类型、采集时间、接收时间和样本编号；（4）详细描述所使用的tNGS技术，包括样本处理、DNA/RNA提取、核酸富集、建库和测序等步骤；（5）提供使用的测序平台和测序策略（如双端测序、读长等）；（6）明确说明检测范围包含哪些内容，列出检测到的可能致病病原体，包括细菌、病毒、

25、真菌和寄生虫等；（7）提供病原体的检出序列数，区分正式检出的病原体和可能的背景微生物或污染物；（8）对检测到的可能致病病原体进行解释，包括其潜在致病性和临床相关性；(9)描述实验过程中使用的质量控制措施，如内参和阴性对照。报告的常用术语解释：(1)检出序列数(reads)：指样本中检出的微生物核酸序列的总数。检出序列数的数值越高，理论上该病原体的有效扩增信号越强;(2)引物(primer)：用于PCR扩增过程中，特异性结合到目标DNA序列的短片段；(3)库(Iibrary)：指为进行高通量测序而准备的核酸样本集合，包括经过切割、修饰和适配体连接的DNA或RNA片段；(4)质控(qualityc

26、ontrol,QO：指在实验过程中用于确保数据质量的各种检测和措施；(5)阴性对照(negativecontrol)：实验中不含目标病原体的样本，用于确保实验过程中没有污染；(6)内参(internalcontrol)：实验中加入的已知量的核酸序列，用于监控实验过程的准确性和可靠性；(7)严格比对序列数(standardizedofreadsstringentlymappedtopathogenspecies,SDSMRN)：标准化后的物种(种或型或亚型)严格比对序列数；(8)Q30:表示碱基错误识别的概率为0.1%,即正确率为99.9%oQ30比例指正确率超过99.9%的碱基占比。建议19：

27、为确保tNGS检测的准确性，可使用质控品建立背景微生物数据库和排除环境污染等情况(B3a)。质量合格的测序数据应综合临床特征和其他检测指标共同判定,进而得出检验结果。若采用阴性质控品与阳性质控品进行质控，则测序数据下机以后，经过数据分析，阴性质控品检测结果应为阴性，如果有检测范围内的病原体检出，说明环境中可能存在相应病原体核酸污染；阳性质控品的检测结果应正确检出对应病原体，若未检出，则此次实验检测结果无效。建议20：测序完成后，应全面进行样本和实验流程的质控，包括下机数据量、数据质量、内参、阴性及阳性质控等（B3a）。测序完成后，首先应该分别从样本、实验流程、文库构建情况、数据质量及是否有污染

28、等全面进行质控，质控合格后再进行分析。查看结果文件，包括临床样本和对照样本的下机数据量、数据质量、内参检出情况及阴性、阳性质控。通过质控后，使用比对工具将过滤后的读段与本实验室的tNGS参考病原体数据库比对，对检出物种进行注释。建议21：理论上标准化后的物种（种或型或亚型）SDSMRN高于其对应类别的阳性判断阈值则视为检出，同时考虑微生物自身特点及患者临床实际情况（B3a）。检出病原微生物列表中，细菌分为革兰阳性菌和革兰阴性菌，病毒分为DNA病毒和RNA病毒,此外还包括真菌和其他病原体（支原体、衣原体、立克次体和寄生虫等），根据阳性判断值、阴控倍数及强阳污染阈值同时对检出靶标进行分析，全部满足

29、条件则判定为阳性，若不满足则会根据本批次该物种的检出情况、检出SDSMRN等进行同批次校正。但注意检出序列数可能不足以反映病原体的真实丰度或致病潜力，应结合临床实际情况及其他临床检测结果、病原体本身致病情况判断是否为致病微生物。建议22：报告中某种/某些胞内菌（如结核分枝杆菌）/厚壁菌（真菌，如曲霉等）检出序列数不高时，需要结合患者临床症状及其他检测结果综合判断（D5）0对于结核分枝杆菌、曲霉等胞内菌和厚壁菌，低序列数可能是由于破壁技术（如超声波破壁、酶解法或物理机械法等）未能有效破坏微生物的细胞壁，导致胞内DNA释放不充分，从而在样本中提取的DNA量较少。因此，对于低序列数无法明确判断的胞内

30、菌和厚壁菌，必须结合临床症状、影像学检查、培养结果以及其他实验室检测来综合分析，做出更为准确的诊断。建议23：tNGS结果判读为阴性，应该结合整体检出情况综合判断，不能作为排除感染标准（B3b）o准确的tNGS阴性结果有可能作为排除感染条件，尤其是排除检测靶标的感染。但是tNGS的靶标是有限的，结果阴性亦有可能存在其他非靶标病原体感染。另外,某些情况下受病原体类型、采样时间、样本类型、患者疾病进程及检测技术本身的局限性等因素对结果会产生影响。因此，在做阴性结果判断的时候，临床医师应该结合临床和其他实验室检测方法进行综合考量o建议24：采用tNGS进行耐药基因/毒力因子鉴定时，需要明确耐药/毒力

31、基因型不等于表型，最终结果还应结合实验室检测结果进行验证(C4)o对于一些来自正常无微生物定植的感染部位并且样本采集过程污染概率较低的样本，tNGS检测可以同时鉴定病原体种类和其相关的耐药/毒力基因。对于耐药基因与表型一致性较高的物种，如结核分枝杆菌，可使用基因分型结果作为用药指导。除此之外还有许多微生物耐药/毒力基因表达可能受宿主免疫反应、环境因素或病原体特定突变的影响，此种情况下tNGS检测结果应仅作为参考信息，最终的耐药性或毒力评估仍然需要结合实验室结果(表型药物敏感性测试、细胞实验等)和临床实际情况进行判断。5总结与展望tNGS在病原体诊断中的发展充满潜力，未来将在多个方面促进感染性疾

32、病的诊断和治疗。首先，tNGS能够精准识别多种病原体，包括细菌、病毒、真菌及寄生虫等，适用于复杂或混合感染的情况;其次，tNGS能够检测病原体的耐药基因，对于与表型一致性较高的病原体如结核分枝杆菌，能够及时提供用药指导，有效推动精准医学的发展。但是，对于基因型与表型之间的关系尚未完全明确的病原体,耐药基因的检测与临床表现可能存在不一致情况。应对这一挑战，亟需通过整合多个数据库并深入研究耐药机制，通过对耐药基因相关耐药性状进行分级，生成更加直观、易于解读的耐药检测结果。同时，随着测序技术水平的不断突破，其读长实现了从数千碱基到数百万碱基的飞跃，即靶向长读长测序。长读长有助于提高拼接的完整性和准确

33、性，通过靶向特定基因区域，可以用于病原体的识别和追踪，帮助研究病原体的传播路径、基因型变异及地域性流行病的特征。靶向长读长测序可通过特定的捕获技术，对临床标本中微生物的核酸，耐药/毒力基因进行靶向富集，从而获得更多的检测数据信息上“。靶向长读长测序以其便携高效、长读长等特性，能够在微生物的种类鉴定及发现新型（未知）耐药突变方面发挥关键作用型。尽管长读长测序在敏感度和特异度上有优势，但目前其成本较高，尤其是在大规模流行病学调查和常规临床应用中，仍然需要突破。综上所述，随着测序技术和平台的不断进步，tNGS的成本逐渐降低，其应用领域也将更加广泛。未来，tNGS有望成为常规的临床诊断工具。并且能够在全球范围内，特别是在资源较为匮乏的地区，普及应用。tNGS将在提高诊断准确性、加速治疗决策、控制耐药性及应对全球健康挑战等方面发挥重要作用，推动精准医疗和全球健康管理的进步。但任何一个技术都不能单独解决所有问题，tNGS也存在核酸检测的局限性，其检测结果需要结合传统微生物学诊断技术及临床综合分析和判读。