拟订产品标准及编制说明巨细胞病毒CMV核酸定量测定试剂盒荧光PCR法.doc

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1、YZB /津2003上海科技有限公司 发布200X-XX-XX实施200X-XX-XX发布巨细胞病毒（CMV）核酸定量测定试剂盒（荧光PCR法）Cytomegalo Virus（CMV）Real Time PCR Kit YZB/国 XXXX-200X YZB医疗器械注册产品标准1YZB/国XXXX200X前 言根据医疗器械监督管理条例、医疗器械标准管理办法特制订本注册产品标准作为该产品生产、检验、销售的质量依据。本标准编写格式遵循了医疗器械标准编写规范和GB/T 1.1-2000标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写规则。本标准的附录A主要原材料质量要求、附录 B 主要液体的配制是规范性

2、附录、附录C企业参考品使用说明。本注册标准由上海市之江生物科技有限公司提出并负责起草。本注册标准主要起草人：邵俊斌、王逸芸。本注册标准首次发布于200X年XX月。通用名称：巨细胞病毒（CMV）核酸定量测定试剂盒（荧光PCR法）英文名称：Cytomegalo Virus (CMV) Real Time PCR Kit1 范围本注册标准规定了巨细胞病毒（CMV）核酸定量测定试剂盒（荧光PCR法）产品组成、用途、制造、检定、使用方法，包装、贮存。本注册标准适用于巨细胞病毒（CMV）核酸定量测定试剂盒（荧光PCR法）。2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引

3、用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。医疗器械监督管理办法医疗器械注册管理办法体外诊断试剂注册管理办法（试行）中国生物制品规程2000医疗器械说明书、标签和包装标识管理规定3 定义及用途本品系采用人巨细胞病毒特异引物，利用核酸扩增、荧光标记探针技术，对人血清或尿液中人巨细胞病毒核酸（CMV DNA）进行定量检测。可用于临床对人巨细胞病毒感染的辅助诊断。4 分类与组成4.1分类 按照体外诊断试剂注册管理办法（试行）的分类原则，本产品属于第三类体外诊

4、断试剂；4.2 组成 序号组分数量1核酸抽提液1.4ml12CMV 核酸荧光PCR检测混合液936ml13酶（Taq+UNG）10.4ml14CMV DNA阴性血清对照品50ml15CMV DNA临界阳性对照品50ml16CMV DNA标准品（5107copies/ml）20ml17CMV DNA标准品（5106 copies /ml）20ml18CMV DNA标准品（5105 copies /ml）20ml19CMV DNA标准品（5104 copies /ml）20ml15要求采用经过标定的企业参考品进行检定。5.1外观试剂盒外包装应无破损，品名、批号、保存条件、有效期清晰，各管试剂外观完

5、整、标记清楚、无破损，液体试剂溶解后应该澄清。5.2 试剂盒内对照品试剂盒中的阴性血清对照品CMV DNA检测结果无对数扩增曲线；临界阳性对照品CMV DNA检测结果在51035104copies/ml范围内；且标准曲线R20.98。5.3 阴性参考品符合率5份CMV DNA阴性参考品CMV DNA定量检测结果不得出现假阳性。5.4 阳性参考品符合率5份CMV DNA阳性参考品CMV DNA定量检测结果不得出现假阴性。5.5 线性灵敏度参考品线性灵敏度参考品浓度范围(copies/ml)理论浓度对数值CMV4.291064.441077CMV4.471053.831066CMV3.901043

6、401055CMV3.181033.441044CMV2.231024.401033线性灵敏度参考品检测浓度在上表范围内，且检测浓度对数值与理论浓度对数值的相关系数0.975.6 批内不精密度CV值10%5.7批间不精密度CV值15%6 试验方法6.1 试验条件应该在1825适宜的温度条件下进行实验操作。整个检测过程应严格分在三区进行：PCR反应体系的配制区；标本处理、加样区；PCR扩增、荧光检测及结果分析区。各区使用的仪器、设备、耗材和工作服应独立专用。6.2 外观检查试验以肉眼观察检查，结果应符合5.1的要求。6.3 试剂盒内对照品试验检测试剂盒中的阴性血清对照品和临界阳性对照品，按照试

7、剂盒操作说明书进行实验，试验结果应该符合5.2要求。6.4 阴性参考品符合率试验 检测阴性参考品，按照试剂盒操作说明书进行实验，试验结果应该符合5.3要求。6.5 阳性参考品符合率试验检测阳性参考品，按照试剂盒操作说明书进行实验，试验结果应该符合5.4要求。6.6 线性灵敏度参考品试验检测线性灵敏度参考品，按照试剂盒操作说明书进行实验，试验结果应该符合5.5要求。6.7 批内不精密度试验线性灵敏度参考品CMV按照1：100稀释，测定10个复孔，所得Ct值求变异系数(CV)，应该符合5.6的要求。6.8 批间不精密度试验线性灵敏度参考品CMV按照1：100稀释，连续三批试剂，每批试剂测定3个复孔

8、所得Ct值求变异系数(CV)，应该符合5.7的要求。7 检验规则7.1 巨细胞病毒（CMV）核酸定量测定试剂盒（荧光PCR法）产品应由生产企业质量检验部门检验合格后方可提交验收。7.2 抽样要求随机抽取6套完整试剂盒，其中2套用于产品全检，2套用于产品复验，2套用于留样。7.3 检验项目试验内容包括试验方法中6.26.7的内容。7.4 判定规则 检验项目必须全部符合要求中5.15.6的所有规定，才能作为合格产品出厂；只要其中一项不符合要求，即判为不合格，不能出厂放行。7.5 型式试验7.5.1 在下列情况之一时，应进行型式试验a） 新产品投产前；b） 间隔一年以上再投产时；c） 设计、结构或

9、工艺有较大变动可能影响性能时；d） 正常生产中每年不少于一次；e） 国家质量监督机构提出进行周期检查要求时。7.5.2型式试验从出厂合格品中随机抽取6套成品试剂，其中2套用于产品全检，4套用于产品复验。7.5.3型式试验包括本标准要求中的所有检查项目。7.5.4 所检项目均应合格。8标志、包装（使用说明书）、运输、储存8.1标志产品外包装盒上应有下列标志a） 制造厂名称和商标；b） 厂址；c） 产品名称、规格；d） 注册产品标准号、产品注册号；e） 生产日期、有效期f） 生产批号。盒上的字样和标志应能保证不因历时较久而模糊不清。8.2 产品包装应有检验合格证、使用说明书上述文件编写应符合医疗器

10、械说明书、标签和包装标识管理规定。8.3 运输巨细胞病毒（CMV）核酸定量测定试剂盒（荧光PCR法）采用冰壶加冰或泡沫盒加冰密封进行运输。8.4 贮存包装后的巨细胞病毒（CMV）核酸定量测定试剂盒（荧光PCR法）应贮存在4低温环境中。附录 A 主要原材料质量要求（规范性附录）A.1 原料及辅料应符合现行中国药典或中国生物制品主要原辅材料质控标准要求。未纳入上述标准的化学试剂，应不低于分析纯。A.2 专用原材料A.2.1 引物按照要求合成引物DNA,要求HPLC纯化，具有厂家对该产品的HPLC分析图谱质检证明，为单吸收峰图谱，核对序列正确，用紫外分光光度计测定符合1.6OD260nm/OD280

11、nm2.0。上游引物：5- GTGAAACACGCTCGCTT-3下游引物：5- GTCGGTACACGGTCCCT-3A.2.2 探针按照要求合成荧光探针,要求HPLC纯化，具有厂家对该产品的HPLC分析图谱质检证明，为单吸收峰图谱，核对序列正确，用紫外分光光度计测定符合1.6OD260nm/OD280nm2.0 CMV DNA定量检测探针标记的荧光素为FAM。FAM荧光素探针在485nm-505nm处有吸收峰。探针：5-FAM- AAGGAACACTGGGTCC-MGB-NFQ-3A.2.3 PCR mix、Taq DNA聚合酶和UNGPCR mix含有dATP 、dUTP、 dCTP和d

12、GTP。Taq DNA聚合酶置94 1小时活性保持50并具有53外切酶活性。UNG IU在 37处理3分钟后，103copies以下含U模版应完全降解，不能产生扩增产物。A.2.4 质粒CMV质粒100倍稀释后用紫外分光光度计测定符合1.65OD260nm/OD280nm2.0，且OD260nm值0.1。A.2.5 阴性血清ELISA检测结果为阴性、CMV DNA检测为阴性。A.2.6 细胞培养上清CMV DNA检测为阳性，且浓度1106 copies/ml。附录 B 主要液体的配制（规范性附录）B.1 样本处理用试剂配方核酸抽提液：含0.9% NaCl和0.1% EDTA-Na2。B.2 核

13、酸扩增试剂配方CMV 核酸荧光PCR检测混合液：含50% PCR mix，600nM上游引物，600nM下游引物和100nM探针。 酶（Taq+UNG）：浓度为5U/l的Taq DNA聚合酶和浓度为1U/l UNG以2:1的体积比混合。B.3 CMV DNA标准品CMV 质粒用工艺用水稀释，使其浓度为5107copies/ml，然后连续三次作10倍梯度稀释，各个稀释度质粒作为CMV DNA标准品。B.4 CMV DNA 阴性血清对照品ELISA检测结果为阴性、CMV DNA检测阴性的正常人血清，60热处理1小时，除菌过滤。B.5 CMV DNA临界阳性对照品从AD169细胞培养上清中获得高滴度

14、人巨细胞病毒，60热处理1小时，除菌过滤，用CMV DNA阴性血清进行适当稀释，使CMV DNA浓度在51035104copies/ml范围内。附录C企业参考品使用说明C.1 企业参考品组成CMV DNA 阴性参考品5份，编号：CMV N1CMV N5；CMV DNA 阳性参考品5份，编号：CMV P1CMV P5； CMV DNA 灵敏度参考品5份，编号（浓度）：CMV、CMV、 CMV、 CMV、 稀释液H。取10ul CMV加至稀释液H中混匀即为CMV。C.2 参考品要求C.2.1 5份阴性参考品的阴性符合率（-/-）为5/5；C.2.2 5份阳性参考品的阳性符合率（+/+）为5/5；C

15、2.3 线性灵敏度参考品CMVCMV检测浓度必须在下表范围内，且检测浓度对数值与理论浓度对数值的相关系数0.97。线性灵敏度参考品浓度范围(copies/ml)理论浓度对数值CMV4.291064.441077CMV4.471053.831066CMV3.901043.401055CMV3.181033.441044CMV2.231024.401033C.2.4 批内不精密度CV值10%C.2.5 批内不精密度CV值15%C.3 储存条件参考品第一次融化后，请立即按照1次/份使用量进行分装，-20冻存。注：灵敏度参考品CMVCMV无需进行核酸裂解处理，直接上样进行PCR反应。医疗器械注册产品

16、标准名称编制说明一、产品概述1. 技术原理本试剂采用Taqman 荧光定量PCR原理，设计针对CMV核酸序列特异性引物，扩增CMV特异性核酸序列，同时设计Taqman探针，针对CMV保守序列，位于上下游引物之间。针对CMV保守序列的探针其5端标记FAM荧光报告基团，3端标记非荧光淬灭基团。检测所得的循环数阈值（Cycle threshold,Ct值）与反应初始模板量对数值呈线形负相关。反应过程中引入标准品，可以建立Ct值与样品浓度的标准曲线。未知样品可以根据Ct值，经程序软件自动换算成样品浓度。2. 产品用途本产品可对人血液或尿液中人巨细胞病毒（CMV）核酸进行定量检测，可用于临床对人巨细胞病

17、毒感染的辅助诊断。3. 国内外同类产品注册与使用情况目前国内针对CMV核酸定量检测试剂盒仅有中山大学达安基因股份有限公司产品“人巨细胞病毒核酸扩增荧光定量检测试剂盒”。国外同类产品采用的技术以b-DNA技术和Taqman荧光定量PCR技术为主，b-DNA技术需要特殊昂贵的实验仪器，目前尚无在国内注册的相关产品。Taqman荧光定量PCR技术相关产品在国外有获得有CE和美国FDA认证的产品，不过尚无在国内注册的国外产品。二、引用或参照的相关标准和资料：1. 医疗器械监督管理办法2. 医疗器械注册管理办法3. 体外诊断试剂注册管理办法（试行）4. 中国生物制品规程20005. 医疗器械说明书、标签

18、和包装标识管理规定三、管理类别确定的依据：1. 医疗器械分类目录；2. 医疗器械分类规则；3. 有关医疗器械分类界定的通知；4. 体外诊断试剂注册管理办法（试行）四、主要技术指标确定的说明：1. 环境条件为保证测定结果的有效性，根据生物试剂的特性，对环境条件进行了规定。2. 检测用参考品经过标化的企业参考品。3. 试剂盒外观试剂盒各成分的物理性状可以使用户在视觉上对产品质量做出初步判断，也是保证产品质量的重要内容，因此规定了其基本要求。4. 试剂盒的安全性试剂盒组成中不含与人体接触的材料，而且不含致畸物，也无放射性污染。5. 阴性参考品符合率阴性参考品符合率是反应试剂特异性的重要指标，是保障该试剂盒所测物质仅为CMV DNA，为此对临床病症相似的其他病原体进行了测定，通过临床研究，以检查试剂盒的特异性，可以满足临床测定的需要。6. 阳性参考品符合率阳性参考品符合率是反应试剂检测灵敏度的重要指标，是保障该试剂盒能够有效检测CMV DNA，为此对临床人巨细胞病毒感染者进行了测定，通过临床研究，以检查试剂盒检测CMV DNA有效性，可以满足临床测定的需要。7. 线性灵敏度参考品符合率试剂盒的分析灵敏度以最低检出限表示，线性以检测结果和理论值双对数相关系数表示，可以满足临床测定的需要。9