waterse2695高效液相色谱.ppt

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1、主讲人：马贵红主讲人：马贵红日期：日期：2010-07-17高效液相色谱仪高效液相色谱仪操作方法操作方法 Waters e2695 型型什么是高效液相色谱法什么是高效液相色谱法nHigh Performance Liquid Chromatography高效液相色谱法，简称：HPLCn是一种基于仪器方法的高效能分离手段：高性能的色谱柱，高精度、耐高压的输液泵以及高灵敏度的检测器n广泛应用于各个领域：医药/环保/石化/生命科学/食品及农业n在技术，理论及应用上仍处于发展阶段n定量分析主要基于与标准品的比较是其最大应用领域n定性分析；不是色谱的强项基于样品的保留时间比较借助于和其联用的紫外、质谱或

2、其他检测器n对定量及定性分析的要求灵敏度、精度及准确度的要求样品量的要求；复杂样品的分析能力容易使用什么是高效液相色谱法什么是高效液相色谱法高效液相色谱如何工作高效液相色谱如何工作n一个储液瓶装有溶剂称为流动相，因为溶剂是流动的。n一个高压泵溶剂传输系统或称溶剂管理器用来产生和计量流动相的流速，一般是毫升/分钟。n一个进样器样品管理器或自动进样器可以将样品导入注射连续的流动相，并由流动相携带样品进入高效液相色谱柱。n色谱柱装有能获得分离效果的填料。这种填料称为固定相因为它被柱硬件包围住。n检测器用来查看化合物流出色谱柱时被分开的谱带大多数化合物没有颜色，所以人眼观察不到。n流动相流出检测器可被

3、送至废液瓶，或按需被收集。n当流动相含有一个分开的化合物谱带，高效液相色谱可以收集含有纯化的化合物的该洗脱组分，用于进一步分析。n注意高压管路和附件用来连接泵、进样器、色谱柱和检测器单元，形成流动相、样品和化合物分离谱带的通路。n检测器连接计算机数据站，高效液相色谱系统单元先记录电信号，再将电信号转换为色谱图，在显示屏上展现出来。n定性和定量样品内溶物浓度。n由于样品中化合物性质差异很大，几种类型的检测器被开发出来。n如果一个化合物能吸收紫外光，可使用紫外吸收检测器。n如果这个化合物发荧光，可使用荧光检测器。n如果该化合物没有上述性质之一，可使用更广泛的检测器，如蒸发光散射检测器ELSD。n最

4、强大的方式是顺序使用多个检测器。例如，紫外和/或蒸发光检测器可和质谱仪MS联用来分析色谱分离的组分。这样，从一次进样，可得到分析物的更多综合的信息。将质谱与高效液相色谱系统耦合称之为液质联用.高效液相色谱如何工作高效液相色谱如何工作液相液相色谱的基本流程图色谱的基本流程图流动相 泵色谱柱检测器 泵输液分离 检测 记录AEGBCDF进样阀进样液相液相色谱的色谱的各部分示意各部分示意图图n液相色谱实验所需的基本参数-亦称色谱条件q流动相：种类及配比，等度或梯度q固定相：色谱柱类型及内径、长短q流动相输送系统参数：流速q检测器参数：紫外检测波长，灵敏度等q温度控制q进样量n仪器组成及开机 n溶剂管理

5、系统的准备 n样品管理系统的准备 n运行样品 n数据采集n报告打印 n关机 Waters e2695 型高效液相色谱仪操作方法型高效液相色谱仪操作方法 Waters e2695 型高效液相色谱仪操作方法型高效液相色谱仪操作方法 n仪器组成及开机 1 仪器组成nWaters e2695 分离单元n 2498型紫外检测器n色谱管理工作站n打印机 四元梯度洗脱的溶剂输送系统四通道在线真空脱气机可容纳 120 个样品瓶的自动进样系统柱温箱内置的柱塞杆密封垫清洗系统溶剂瓶托盘液晶显示器键盘用户界面及软盘驱动器 2 开机开机n 打开电源至on位置，开机依次接通 2695 分离单元、检测器、计算机和打印机的

6、电源。接通后，约 20s 仪器开始自检，约 1min 后，显示主屏幕，此时继续各部件的初始化。溶剂管理系统的准备溶剂管理系统的准备n流动相脱气确认所有溶剂管路都充满溶剂，按【Menu/Status】，进入“Status（1）”屏幕溶剂管理系统的准备溶剂管理系统的准备必须用色谱纯有机溶剂，水或缓冲盐要用超纯水；必须用色谱纯有机溶剂，水或缓冲盐要用超纯水；水相流动相需要每水相流动相需要每48h重新配制，特别是重新配制，特别是100%含水流含水流动相；动相；检查检查6根管子是否均在液面下，必须保证根管子是否均在液面下，必须保证6根管子全部根管子全部插到溶剂瓶底部。插到溶剂瓶底部。打开真空脱气机（打开

7、真空脱气机（degasser）Wet prime（执行湿灌注）（执行湿灌注）流动相平衡色谱柱流动相平衡色谱柱同理温度、流速都可在此控制面板设定！同理温度、流速都可在此控制面板设定！流动相特性流动相特性 n（1）液相色谱的流动相又称为：淋洗液，洗脱剂。流动相组成改变，极性改变，可显著改变组分分离状况；n（2）亲水性固定液常采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定相的极性，称为正相液液色谱法，极性柱也称正相柱。n（3）若流动相的极性大于固定液的极性，则称为反相液液色谱，非极性柱也称为反相柱。组分在两种类型分离柱上的出峰顺序相反。常用溶剂的极性顺序常用溶剂的极性顺序：水(最大)甲酰胺 乙腈 甲醇 乙

8、醇 丙醇 丙酮 二氧六环 四氢呋喃 甲乙酮 正丁醇 乙酸乙酯 乙醚 异丙醚 二氯甲烷氯仿溴乙烷苯四氯化碳二硫化碳环己烷己烷煤油(最小)流动相方面要求流动相方面要求q除去微粒q纯度的要求n超纯水，梯度实验时水中有机杂质含量要低（建议走空白检验）n缓冲液的pH值，在填料的允许范围内n缓冲液（盐）的浓度n溶剂：色谱纯，并与填料相匹配n溶剂中的杂质含量n注意溶剂的相容性，避免使用不相容的溶剂 q流动相对样品的溶解度n有机溶剂或水的比例n流动相的转换要缓慢n流速(压力)的变化幅度较小，比较稳定n温度的变化幅度n专用色谱柱样品及溶剂的要求色谱柱的使用及操作色谱柱的使用及操作 装载样品盘（loading c

9、arousels）：装入样品与转盘将样品瓶插到样品盘合适的位置，打开样品仓门，显示“Door is Open”屏幕，装入样品盘，按【Next】，直至所有样品盘装毕，关仓门。样品管理系统的准备样品管理系统的准备样品方面要求样品方面要求n溶剂和样品过滤非常重要，它会对色谱柱、仪器起到保护作用，消除溶剂和样品过滤非常重要，它会对色谱柱、仪器起到保护作用，消除由于污染对分析结果的影响。由于污染对分析结果的影响。n色谱柱：由于填料颗粒很细，色谱柱内腔很小，溶剂和样品中的细小色谱柱：由于填料颗粒很细，色谱柱内腔很小，溶剂和样品中的细小颗粒会使色谱柱和毛细管容易堵塞。颗粒会使色谱柱和毛细管容易堵塞。n仪器：

10、溶剂和样品中的细小颗粒会增加进样阀的堵塞和磨损，同时也仪器：溶剂和样品中的细小颗粒会增加进样阀的堵塞和磨损，同时也会增加泵头内的蓝宝石活塞杆和活塞的磨损。会增加泵头内的蓝宝石活塞杆和活塞的磨损。n除去微粒及杂质除去微粒及杂质n了解样品在流动相中的溶解度了解样品在流动相中的溶解度,如样品的溶剂不是流动相，一定要确如样品的溶剂不是流动相，一定要确保样品在流动相中不析出。保样品在流动相中不析出。n了解样品与色谱柱的基质了解样品与色谱柱的基质/填料是否相互作用。填料是否相互作用。运行样品运行样品n配置系统项目配置系统项目n管理数据（相当于新建文件夹），鼠标右键选新建，设定项目名（设定后将出现在运行样品

11、中）。n建立方法组并运行样品建立方法组并运行样品n在浏览项目浏览项目中打开你的项目，通过“新建仪器方法”来设定使用的仪器方法（即对配置系统一步选定的主机和检测器进行参数设置）：仪器方法（新建仪器方法，包括主机和选定的检测器的参数的设置设置好选另存为保存此仪器方法关闭）此时上述编辑的仪器方法出现在列表中运行样品运行样品n在浏览项目浏览项目中打开你的项目，通过“新建方法组”来设定具体仪器方法、处理方法、报告方法仪器方法、处理方法、报告方法另存为“方法组”，设置方法名（与刚才的仪器方法名相统一）完成。在“运行样品运行样品”中打开设定的仪器方法，并在设针时选定设定的方法组来对样品进行分析。数据处理数据

12、处理n都可以在“浏览项目浏览项目”中完成。n点开“浏览项目浏览项目”，选定要要浏览的项目，确定后进入的界面中有如下内容：样品组、进样、通道、方法、结果组、结果等。PDA数据处理数据处理n在浏览项目浏览项目中，点“通道”双击要处理的原始数据（点查看图标）进入查看主窗口提取色谱图点“处理方法向导”图标新建处理方法峰1、峰2积分区域（选定要积分的峰）给出条件剔除不要的峰纯度匹配PDA光谱对照处理方法名完成（然后又出现主窗口，处理结果自动给出）点“方法组”图标，选好后点“文件”下的“另存为”“方法组”，设定即可。至此选好处理方法。n结果处理：选好数据，右键选处理选好方法组（上面设定好的）n点结果即可给

13、出处理好的数据n注：通道无论什么时候给出的都是未处理数据。注：通道无论什么时候给出的都是未处理数据。nFD数据处理数据处理：点“处理方法向导”图标新建处理方法在新方法（方法类型中选LC）新建处理方法峰1、峰2积分区域（选定要积分的峰）给出条件剔除不要的峰处理方法名完成（然后又出现主窗口，处理结果自动给出）至此选好处理方法。色谱图：色谱图：HPLC图形图形结果（结果（Chromatogram）色谱图即色谱柱流出物通过检测器时所产生的响应信色谱图即色谱柱流出物通过检测器时所产生的响应信号对时间的曲线图，其纵坐标为信号强度，横坐标为保留号对时间的曲线图，其纵坐标为信号强度，横坐标为保留时间。时间。色

14、谱峰色谱峰保留时间（分）保留时间（分）基线基线峰高峰高峰宽峰宽响应值响应值色谱图色谱图 参数基本概念参数基本概念n色谱峰 Peak色谱柱流出组分通过检测器时产生的响应信号的微分曲线n峰底 Peak Base峰的起点与终点之间连接的直线n峰高 Peak Height峰最大值到峰底的距离n峰宽 Peak Width在峰两侧拐点处所作切线与峰底相交两点之间的距离n半（高）峰宽 Peak Width at Half Height通过峰高的中点作平行于峰底的直线，其与峰两侧相交两点之间的距离n峰面积 Peak Area峰与峰底之间的面积,又称响应值n标准偏差；Standard Error0.607倍峰高

15、处所对应峰宽的一半n拖尾峰 Tailing Peak后沿较前沿平缓的不对称峰n前伸峰 Leading Peak前沿较后沿平缓的不对称峰n鬼峰 Ghost Peak并非由试样所产生的峰；亦称假峰色谱图色谱图 参数基本概念参数基本概念n基线 Baseline在正常操作条件下，仅由流动相所产生的响应信号的曲线n基线飘移 Baseline Drift基线随时间定向的缓慢变化n基线噪声；N Baseline Noise由各种因素所引起的基线波动n谱带扩展 Band Broadening由于纵向扩散,传质阻力等因素的影响,使组分在色谱柱内移动过程中谱带宽度增加的现象色谱图色谱图 参数基本概念参数基本概念n

16、死时间，t0 Dead time不被固定相滞留的组分，从进样到出现峰最大值所需的时间n保留时间，tR Retention time组分从进样到出现峰最大值所需的时间n死体积，V0 Dead volume不被固定相滞留的组分，从进样到出现峰最大值所需的流动相体积n保留体积，VR Retention volume组分从进样到出现峰最大值所需的流动相体积色谱图色谱图 参数基本概念参数基本概念 在结果结果中，选择图谱点打印，报告打印时，选择设定好的报告模式，或者选择“缺醒单个报告”模式打印，在待打印的模式下可以编辑报告显示的信息，比如表头，色谱图的显示范围，表格中所需内容等。报告打印报告打印关关 机机

17、n数据采集完毕后，关闭检测器电源开关，以节省使用寿命。n使用完毕，按规定用适当的溶剂冲洗色谱柱、系统管路、自动进样器、进样针和柱塞杆密封垫，确保 2695 分离单元已彻底冲洗干净后，关闭电源开关。n处理数据并打印报告后，关闭计算机和打印机电源开关，并做使用登记。HPLC使用常见注意事项使用常见注意事项n1.夏季气温高，水容易生菌，要求HPLC所用重蒸水必须每天都要更新。n2.柱压变动范围较大，处理方法：多为进气泡。高低流速交替冲洗。n3.配制的流动相使用前要脱气，常用超声脱气法：流动相放在超声波容器中，用超声波振荡10-15min，此法效果一般，但比较方便。n4.使用缓冲溶液时，做完样品后应立即用甲醇水溶液冲洗。n5.长时间不用仪器，应该将柱子取下用堵头封好保存，注意不能用纯水冲洗及保存柱子，而应该用有机相(如甲醇等)，因为纯水极性太强且易长霉。n6.开机时，流速和柱压要逐渐增加。n7.要注意柱子的PH值范围，不得注射强酸强碱的样品，特别是碱性样品。8.更换流动相时应该先将吸滤头部分放入烧杯中边振动边清洗，然后插入新的 流动相中。n9.关机前先用水冲洗整个系统，移走缓冲液后再用有机相冲洗。n10.进样前检查色谱系统的各个接头是否有漏液。Thank you！