电镜冷冻制样技术NEWB.ppt

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1、 第七章第七章电镜冷冻制样技术电镜冷冻制样技术第一节第一节 冷冻制样的基础知识冷冻制样的基础知识一一 金属投影技术金属投影技术二二 复型技术复型技术三三 电镜冷冻制样技术概述电镜冷冻制样技术概述（一）发展概况（一）发展概况：1946,Willams建立金属投影技术，主要用于观察颗粒材料，如病毒、细菌、原生动物、孢子、分离的微纤丝、蛋白质分子、核酸分子，以及其它非生物材料的微粒和粉末材料。1955，Hall,Huxley提出负染色技术；1959,Horne和Brenner正式命名：Negative staining，取代了金属投影技术。一一 金属投影技术金属投影技术 目前金属投影技术主要用于主要

2、用于：观察不适合负染色但需要金属投影来提高反差的样品；可用于测量颗粒的大小、高度，增加颗粒的尺寸，以改善粒子在TEM的可见性；是复型技术、冷冻断裂蚀刻复型技术的基础。1.金属投影技术的概念金属投影技术的概念：把具有高电子密度的金属材料（把具有高电子密度的金属材料（Pt，Pd,Au,Cu,Al),加热到其熔点之上，以一加热到其熔点之上，以一定的角度沉积在样品表面形成投影，从定的角度沉积在样品表面形成投影，从而增加样品的反差，并使图像具有立体而增加样品的反差，并使图像具有立体感。感。（二）、金属投影基本概念及原理（二）、金属投影基本概念及原理：基本过程：真空蒸发真空镀膜基本原理：有金属沉积的部位散

3、射能力强，TEM像呈现暗区 无金属沉积的部位散射能力弱，TEM像呈现亮区基本特点：图像反差明显，富有强烈的立体感 样品被“包埋”在金属膜中，即样品表面被金属粒 子覆盖，其图像分辨率由金属粒子大小限制，样 品表面细微机构看不清，只能看到表面形貌。不能分辨杂质和病毒，造成鉴定上的困难，故对 病毒样品的纯度要求较高 2.基本原理及特点基本原理及特点：真空镀膜仪：104105Torr 仪器结构仪器结构 真空钟罩真空钟罩：玻璃或金属钟罩；两组电极（碳电 极、金属电极）；样品台。真空系统真空系统：两级泵真空系统，104105 Torr 加热电流供给系统加热电流供给系统：大电流变压器，提高40 50A电流。

4、真空的作用真空的作用：防止样品受到热传导和对流引起的热损伤。防止样品受到金属氧化而引起的污染。3.所用仪器所用仪器.具有高电子密度，和较高的电子 散射能力.在喷镀层中金属颗粒细小，分布均匀，高温下不升华，经久耐用.在电子束作用下，金属不会粒状化.化学稳定，不与样品反应.熔点低，易于蒸发 4.选用金属的标准选用金属的标准5.常用的金属：常用的金属：Pt，Pd，Pt-Pd,Au,颗粒细颗粒细10 用于很小或很薄的生物材料，如病毒、用于很小或很薄的生物材料，如病毒、核酸、蛋白质分子等。核酸、蛋白质分子等。Cu，Cr（铬的合金），颗粒粗（铬的合金），颗粒粗20，用于对分辨率要求不高的较大样品，用于对分

5、辨率要求不高的较大样品，如细菌等如细菌等1 1、一次投影、一次投影 A A、样品的准备样品的准备：制备样品悬液滴样品液摆载网 放入真空镀膜仪 B B、金属的选取金属的选取：蒸发材料有粒状、块状、细丝状、薄片状 高分辨率的样品：粒度较细的Pt，Pt-C，Pt-Pd合金 一般的样品：粒度粗、易蒸发，低价的 Cu，Al，Cr（三）、方法：（三）、方法：C C、投影角度投影角度的调整的调整 调整原则调整原则：样品越细小，如核酸59 ，细菌30 病毒、噬菌体1215 注意：样品与蒸发源的直线距离10cm D、金属投影金属投影 先喷3s4min,厚1020nm 再 90 垂直喷碳，加固E E、样品颗粒大小

6、的测量样品颗粒大小的测量 h:颗粒高度:投影角度 l:照片上投影长度 M:放大倍数 H:蒸发源的高度 L:蒸发源与样品的水平距离2、二次投影、二次投影 一次投影之后，将样品旋转180，再次投影3 3、旋转投影、旋转投影:金属蒸发时,样品3060转/min 适于：极小颗粒 金属投影的电镜图像样品的颗粒呈 黑色，投影区呈白色金属投影与日光投影的比较金属投影与日光投影的比较 唯一一种能用TEM观察样品表面方法1 1、适用范围、适用范围:金属材料,矿物质、化合物表面 坚硬的生物材料：骨骼、牙齿、种子、孢子、花粉、木材2 2、定义、定义：用电子透明的薄膜将某些坚硬材料表面结构“铸印”下来，复制的这层薄膜

7、就是样品表面结构的一个“模子”，称之为复型（Replication)。二、复型技术二、复型技术（一）、技术概述（一）、技术概述3、优点、优点：分辨率极高，研究样品表面精 细结构；制样简单，不损伤样品，图像 具有立体感，在TEM下可以观察样品天然表 面或人工断面的细微结构特征。1 1、一级复型、一级复型 （负复型）（负复型）基本描述：先用有机材料直接在样品表面 印制复型，再将复型膜剥离样 品，金属投影来增加反差。常用介质：0.51%火棉胶醋酸戊酯溶液 或0.5%formvar氯仿溶液 基本步骤：滴加福尔莫瓦溶液成膜漂膜 洗膜捞膜金属投影和喷碳 加固观察 基本特点：分辨率高，2050，人工假象少；

8、复型膜软，剥离时易变形，且不易 与样品分离（二）、制样方法（二）、制样方法2、预投影一级复型、预投影一级复型 基本描述基本描述：直接在样品表面进行金属投影：直接在样品表面进行金属投影 和喷碳，制成碳复型膜，再化和喷碳，制成碳复型膜，再化 学法溶解掉样品，将复型膜打学法溶解掉样品，将复型膜打 捞在载网上。捞在载网上。典型方法典型方法：石蜡铬预投影一级复型法：石蜡铬预投影一级复型法 基本步骤基本步骤：准备材料：准备材料喷铬喷碳喷铬喷碳 石蜡补强石蜡补强溶木材溶木材脱蜡脱蜡基本描述：用较厚的有机材料在样品表面印制一 级复型，剥离后以此为模板，进行金 属投影和喷碳，制成二级碳复型，最 后溶去一级有机复

9、型膜，留下二级碳 复型膜。常用方法：AC纸-C二级复型法基本步骤：贴AC纸样表结构铸印于AC纸 揭下AC纸（一级复型）用石蜡将AC纸粘于玻板 金属投影与喷碳（二级复型）溶掉AC纸水浴脱蜡清洗捞膜3、二级复型、二级复型（正复型）（正复型）4 4、拟复型法和微粒复型法、拟复型法和微粒复型法基本描述：基本描述：用于研究用于研究微颗粒材料微颗粒材料，将其制，将其制成悬浮液，喷到云母片上，干燥后成悬浮液，喷到云母片上，干燥后金属投影，喷碳加固金属投影，喷碳加固,云母片斜插入云母片斜插入10丙酮溶液，漂浮碳膜，捞膜后丙酮溶液，漂浮碳膜，捞膜后电镜观察，此法为电镜观察，此法为拟复型法拟复型法。若将膜片转移到

10、溶剂中溶解掉若将膜片转移到溶剂中溶解掉样品，得到该微粒的表面复型膜，样品，得到该微粒的表面复型膜，即为即为微粒复型法微粒复型法。病毒荚膜：负染色病毒荚膜：负染色病毒荚膜：旋转投影病毒荚膜：旋转投影病毒荚膜：金属投影病毒荚膜：金属投影(一一)、冰冻制样技术的分类、冰冻制样技术的分类 冷冻干燥、冷冻取代、冰冻超薄切片 冷冻断裂蚀刻及复型、冷冻扫描电镜技术等(二二)、特点：、特点：1、快速固定，保持细胞或组织的生活状态 2、避免了化学药剂对样品产生的影响，减 少了样品超微结构和成分的损伤，有利 于保护生物大分子活性，用于组织化学、细胞化学、免疫电镜技术、放射自显影、尤其Xray微区分析 3、操作步骤

11、少，时间短，适于快速研究 与诊断三、电镜冷冻制样技术概述三、电镜冷冻制样技术概述1 1、概念、概念：由样品中游离态水分冻结形成冰晶而造 成的一种生物样品精细结构的损伤。2 2、结冰过程：、结冰过程：090 ：六角型晶体 90140：立方体 低于140：玻璃态无定形结构（非晶态）（三）、应用范围：（三）、应用范围：形态学、组织化学、细胞化学、免疫电镜技术、放射自显影、尤其Xray微区分析领域；其它材料的研究：塑料、橡胶、及高分子材料（四）、冰晶损伤：（四）、冰晶损伤：3 3、结冰过程与结冰速率、结冰过程与结冰速率 生物样品结冰过程：细胞外结冰：结冰温度较高、速率低 细胞内结冰：结冰温度较低、速率

12、高 实验结果表明：冷冻速率低时,冷度温度较高，胞间形成较 大冰晶，损伤细胞结构 冷冻速率很高时,冷度温度很低，胞内外同 时形成玻璃态冰，无损伤 结论:防止冰晶形成的关键:提高冷却速率提高冷却速率 （103 104/s）、降低冷冻温度降低冷冻温度 4 4、冷冻剂（冷媒）、冷冻剂（冷媒）常用：液氮、液态丙烷、氟里昂、液氦，液态乙烷冷冻速率冷冻速率 冰晶直径冰晶直径 冷冻损伤冷冻损伤 5 5、冷冻保护剂、冷冻保护剂 目的：防止冰晶损伤 原理：保护剂与水分结合，减少样品中 的水分，从而降低样品的冰冻点 常用的保护剂：甘油、二甲基亚砜（DMSO）、蔗糖、乙二醇6 6、产生冰晶损伤的原因及排除方法、产生冰

13、晶损伤的原因及排除方法原因：冷却速率不足；样品块过大排除方法：选择优质冷冻剂 使用最佳冷冻装置 剁碎样品 冷冻前用冷冻保护剂处理样品第二节第二节 冷冻断裂冷冻断裂(蚀刻蚀刻)和复型技术和复型技术一一 技术概况技术概况二二 基本原理基本原理三三 样品的制备样品的制备1.1.优点优点：.避免化学试剂对样品的损伤，保持细胞 原有结构。.适于观察和研究细胞膜结构，立体感 强，分辨率高 .复型膜耐电子束的轰击，可长期保存,是研究生物膜的常规技术一、技术概况一、技术概况 （）技术的特点（）技术的特点2.2.缺点缺点：.冷冻会造成样品人为损伤，冰 晶损伤 .获取生物膜以外的结构信息不足（二）应用（二）应用：

14、主要用于研究生物膜的分子结构，以及观主要用于研究生物膜的分子结构，以及观察人及各种动物、植物、微生物细胞的膜结察人及各种动物、植物、微生物细胞的膜结构及细胞器的超微结构。构及细胞器的超微结构。(一一)分子生物膜结构的特性分子生物膜结构的特性 1.生物膜的主要化学成分：脂类（磷脂，胆固醇）2.脂类分子的结构特点：亲水的头部和疏水的尾部 3.脂类分子在水中三种排列：小球分子团，脂双分子，层脂质体二、基本原理二、基本原理(二二)断裂的原理断裂的原理 断裂总是沿着阻力最小平面进行的 即断裂总是从脂双分子层的疏水区 裂开(三三)蚀刻作用蚀刻作用：冷冻蚀刻：样品断裂后，调控温度使之回升,断裂面上冻结的冰直

15、接升华为水而挥发，从而暴露出更深一层结构的一种物理效应。1.1.蚀刻条件蚀刻条件：温度：100110 真空：1105Torr 蚀刻速度：2nm/s 时间：1590s2.2.蚀刻速度的规则蚀刻速度的规则：温度T 蚀刻 真空度蚀刻(四四)复型原理复型原理：（22.5nm)1、一般方法：先45喷Pt/C 25nm 后90 喷C 715nm(加固)2、复型的环境条件 真空优于5105Torr 温度：100 3、间歇喷碳法：喷1s,间歇34s,再喷1s,反 复45次，以防止热辐射损伤(五五)冷冻断裂仪简介冷冻断裂仪简介 1.专用冷冻断裂及复型装置 EIKO：FD-2A、FD-3 2.附件型装置：真空喷镀

16、仪冷冻断裂装置温 度控制器三、冷冻断裂三、冷冻断裂(蚀刻蚀刻)和复型样品的制备和复型样品的制备(一一)技术准备技术准备：1.电极的准备 2.2.样品冷冻前的预处理样品冷冻前的预处理 取材：活体取下样品1mm3 预固定:1%-2%戊二醛固定液固定13小时 （戊二醛固定液的温度为生理温度，彻底固定后，冷却到4保存13h，在没彻底固定之前保存在4下会引起膜脂质从细胞膜中分离出来而造成人工假象。）漂洗：室温下PBS漂洗3次，10min次 冷冻保护：2030甘油等溶液渗透 824h (二）操作步骤二）操作步骤 1.冷冻冷冻 将预处理后的样品装在冷冻蚀刻装置的样品将预处理后的样品装在冷冻蚀刻装置的样品 夹

17、中，夹中，直接冷冻或间接冷冻。直接冷冻或间接冷冻。2.真空中断裂真空中断裂 51051105托，托，100110 3.稍加热、蚀刻稍加热、蚀刻 样品温度从样品温度从110上升至上升至100，保持，保持 1590s 4.喷镀覆型喷镀覆型 45投影喷铂，厚投影喷铂，厚25nm，垂直喷碳，垂直喷碳 加固，加固，1020nm 5.复型膜和组织的分离复型膜和组织的分离：腐蚀剂：动物：腐蚀剂：动物：1030NaClO 植物：铬酸植物：铬酸 6.清洗、打捞、干燥复型膜清洗、打捞、干燥复型膜(三三)、冷冻断裂复型膜的命名、冷冻断裂复型膜的命名 (Branton,1975)1.1.两个半膜两个半膜:E半膜（外半

18、膜）：连接细胞外空间及 细胞内空间(包括内质网腔、核周间隙、线粒体内等)的半膜 P半膜（胞质半膜）：连接细胞质、核 质、线粒体和叶绿体基质的半膜 2.2.四个面四个面：P半膜上的亲水面PS面（protoplasmic Surface)P半膜上的疏水面PF面（protoplasmic fracture face)ES(extracellular),EF第三节第三节 冷冻超薄切片冷冻超薄切片一一 技术概况技术概况二二 冷切的基本流程冷切的基本流程三三 冷切的总结冷切的总结 1.1.冷冻超切冷冻超切：将样品迅速冷冻,用冷冻超薄切片机进 行切片.2.2.应用范围应用范围:在分子水平研究新鲜组织的超微结

19、构,生物大分子和某些元素的分布组织化 学、免疫电镜标记,X-ray微区分析等。3.关键：关键：防止冰晶损伤 游离态的水玻璃态的冰一、技术概况一、技术概况4.4.冷切适合的材料：冷切适合的材料：非生物材料：橡胶、胶片、塑料、纸张、纺织品高分子材料生物材料：组织块、细胞团、病毒、生物大分子、微生物5.5.冷冻超薄切片的难点：冷冻超薄切片的难点：防止冰晶损伤排除干燥损伤、省去经典的超切固定、脱水等过程，实现快速固定，适于快速制片、适于快速研究与诊断。、切片前后避免了化学药剂的处理，样品结构、成分不发生变化，尤其可溶性成分不被抽提，保持了细胞或组织的原始生活状态，使电镜图像更具有接近生物的存活状态。、

20、能很好保存生物大分子活性，有利于组织化学、免疫电镜技术、酶活性、电镜放射自显影、Xray微区分析等领域中对细胞化学和细胞成分进行定量定性分析。6.6.冷冻超薄切片的优点：冷冻超薄切片的优点：7.7.所用仪器：冷冻超薄切片机所用仪器：冷冻超薄切片机、仪器准备：专用的冷冻超薄切片：FC-4E,FC-4D 配有附件的普通超切机 如：Sweden LKB Cryo NoVa,LKB2088、FC 4E性能：a.5min内完成制冷，最低t=-190 b.灵活调节刀、样品的温度 c.液氮消耗低、自动充盈，连续3h d.切片小室内不结霜，利于操作8.8.冷切制备程序的分类冷切制备程序的分类 无溶液制备法无溶

21、液制备法：步骤步骤：取材：取材快速冷冻快速冷冻 切片切片干燥干燥 染色或不染色染色或不染色镜检；镜检；特点特点：有利于保存生物材料中的可溶性物：有利于保存生物材料中的可溶性物 质及生物大分子的活性和天然构型。质及生物大分子的活性和天然构型。应用应用：可溶性物质的放射自显影、：可溶性物质的放射自显影、X射线微区分析。射线微区分析。固定样品制备法固定样品制备法：步骤步骤：取材：取材醛类固定醛类固定样品包封（夹埋）样品包封（夹埋）冷冻保护处理冷冻保护处理切片切片染色染色镜检镜检特点特点：该方法用醛类固定及冷冻保护处理，：该方法用醛类固定及冷冻保护处理，较好保存细胞的精细结构，较好保存细胞的精细结构，

22、应用应用：适用进行形态学、细胞化学、免疫化：适用进行形态学、细胞化学、免疫化 学的研究。学的研究。二、冷切的基本流程二、冷切的基本流程（一）、（一）、取材取材 原则原则:快、准、鲜快、准、鲜 大小大小:边长边长0.51mm的块的块（二）、醛类固定（二）、醛类固定典型方法典型方法：0.1M的二甲砷酸钠缓冲的二甲砷酸钠缓冲(pH=7.2)的的2.5%戊二醛固定液或戊二醛固定液或4甲醛甲醛0.5%戊二醛混合固定液固定戊二醛混合固定液固定1h,04注意注意：研究的目的和材料不同，固定液的：研究的目的和材料不同，固定液的浓度和处理时间可以不同。浓度和处理时间可以不同。一般的形态学研究一般的形态学研究：2

23、5%戊二醛固定戊二醛固定1560min,4做免疫电镜标记时做免疫电镜标记时：0.21%戊二醛固定戊二醛固定515min,4（三）、预包埋（三）、预包埋(包封、夹埋包封、夹埋)包封：包封：采用某些大分子量的支持采用某些大分子量的支持介质，将组织块包埋起来，以便介质，将组织块包埋起来，以便于切出大面积平整的切片。于切出大面积平整的切片。具体操作具体操作：将组织块放入：将组织块放入1020 的明胶溶液中，的明胶溶液中，1530min,冰冰箱冷却到箱冷却到4，凝固，样品被明，凝固，样品被明胶包封。胶包封。(四四)、冷冻保护处理、冷冻保护处理 1.常用试剂：2060%甘油水溶液 2050%DMSO,5

24、聚乙烯醇 1.62.3mol/L蔗糖溶液 2.处理时间：5min3h 3.浓度原则：组织含水量，保护剂浓度(五）、冷冻固定五）、冷冻固定 1.液氮直接冷冻：12S，达196 液氦273 2.间接冷冻固定（中间冷媒法）（液态丙烷）（液态丙烷）3.金属接触法：铜块液氮中铜块接触样样预冷 样入液N4.双丙烷喷气式冷冻法 双丙烷喷气式冷冻机RMCMF72005.高压冷冻法高压冷冻机LeicaReichert 样品夹放入高压腔中，注入液氮，加压冷冻。高压下2100标大气压下，水的凝聚点降到22，形成冰晶和冰晶生长的速度降低，为组织深层冷冻提供了时间。可以冷冻直径为1mm左右的样品，如真菌芽孢。(六六)

25、切片和捞片、切片和捞片 1.切片时温度的控制与选择 选择切片时样品的温度 生物样品T-35,冰晶损伤小 细胞内小分子物质和小元素固定下 来,T-80 形成玻璃无定形水溶液混合相,始 终T-140,（若T-140 则样品中无 定形固体化的水份发生变形，而且变形不可 逆。）刀温比样品温度高1020根据研究的目的选择样品的温度2.切片的速度和厚度 样品温度-60-80 切速：0.5mm/s 厚度：70100nm3.刀的选择:(玻璃刀，钻石刀)注意：(1)切片之前冷却刀 (2)钻石刀反复使用后需要调整 (3)玻璃刀口上喷钨，增加其锋利性 (4)钻石刀使用后需认真清洗，防止腐蚀 (5)使用玻刀时，用铝

26、铂胶条做水槽，冷的 硅胶密封4.修块 切片机修块法 预修块法5.切片:(关键：稳定温度）湿刀法：低温下，DMSO做槽液 干刀法：无槽液，刀角50706、捞片(切片收集)：A 干刀法切片的收集 (1)液滴法：玻棒粘液粘切片在 铜网上展片洗去糖液 (2)直接拨取法：拨片到冷铜网上 镜面压平（此过程维持样品低 温，在超切机的冷冻样品室进行）B 湿刀法切片的收集 (1)用预冷的有膜铜网捞片 (2)塑料环套法：（七）、（七）、冷冻干燥冷冻干燥 优点：消除表面张力，避免有机溶 剂对细胞质的抽提 缺点：低温(-80）真空需几天或几十小时（八）、染色（八）、染色 冷切多用负染色 0.2%-1%磷钨酸，pH6.

27、5-8.5,染色115s 0.5%-3%醋酸双氧铀，pH4.5-5.2,染色115s 负染色：方法简单，分辨率高、染色时间短，有利于保存结构 正染色：适于免疫电镜、细胞化学（九）、观察（九）、观察三、冷切总结三、冷切总结：取材（醛类固定预包封）冷冻 保护冷冻固定冷冻超切 直接冷冻观察 冷冻干燥染色常温观察 低温X-ray微区分析 免疫细胞学第四节第四节 冷冻其他相关技术冷冻其他相关技术1.1.冷冻干燥冷冻干燥 避免化学试剂的固定和脱水 将冰或固体脱水剂直接升华为气体2.2.冷冻取代冷冻取代 (1)低温下，用有机溶剂取代生物 中的冰，速度相当缓慢 (2)升华固态的有机溶剂第五节第五节 冻安全规则

28、冻安全规则 四防：四防：防冻伤防冻伤 防窒息防窒息 防爆炸防爆炸 防燃烧防燃烧作业作业1.名词：冷冻蚀刻、冰晶损伤、冷冻保护、金属投影技术、复型技术2.常用的金属投影方法、复型的方法有哪些？3.冷冻制样中为什么产生冰晶损伤?怎样排除？（冰晶损伤的原因，如何防止冰晶损伤？)4.简述冷切制备过程，与普切比较，其优 点是什么？简述冷冻超切的一般操作步骤。5.为什么对样品进行冷冻保护？常用的冷冻保护剂及保护方法？6.什么是冷冻断裂复型技术？它的主要步 骤及优缺点是什么？7.细胞冷冻断裂产生哪些膜面？如何命名？8.冷冻安全规则是什么？大大鼠鼠肝肝细细胞胞冷冷冻冻蚀蚀刻刻照照片片分离的人沙眼支原体分离的人沙眼支原体小小鼠鼠肝肝细细胞胞冰冰冻冻蚀蚀刻刻照照片片洋葱的根细胞洋葱的根细胞人肺人肺II型板层体冷冻蚀刻照片型板层体冷冻蚀刻照片冷冷杉杉木木材材管管胞胞纹纹孔孔及及微微纤纤丝丝