分光光度法检测蛋白质含量.ppt

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1、生物化学与分子生物学生物化学与分子生物学实验 曾季平曾季平 生物化学与分子生物学系生物化学与分子生物学系生物化学与分子生物学生物化学与分子生物学实验实验室室规则实验室安全及防室安全及防护实验室常用玻璃室常用玻璃仪器器实验考考试实验室室规则 提前提前提前提前5 5分分分分钟钟到到到到实验实验室，不能室，不能室，不能室，不能迟迟到、早退、到、早退、到、早退、到、早退、旷课旷课，每，每，每，每迟迟到、早退到、早退到、早退到、早退一一一一次扣次扣次扣次扣1 1分，每分，每分，每分，每旷课旷课一次扣一次扣一次扣一次扣5 5分分分分。禁止在禁止在禁止在禁止在实验实验室内吃食品室内吃食品室内吃食品室内吃食品

2、如有，如有，如有，如有违违反者按反者按反者按反者按迟迟到到到到处处理。理。理。理。上上上上课课必必必必须须穿隔离衣穿隔离衣穿隔离衣穿隔离衣，不能穿拖鞋和吊，不能穿拖鞋和吊，不能穿拖鞋和吊，不能穿拖鞋和吊带带背心，否背心，否背心，否背心，否则则禁止禁止禁止禁止进进入入入入实验实验室。室。室。室。实验实验期期期期间间手机必手机必手机必手机必须设须设置在振置在振置在振置在振动动上上上上，上，上，上，上课课期期期期间间如急需接、打如急需接、打如急需接、打如急需接、打电话请电话请到走廊上到走廊上到走廊上到走廊上处处理。理。理。理。在在在在实验实验室内要保持安静，不得嬉室内要保持安静，不得嬉室内要保持安

3、静，不得嬉室内要保持安静，不得嬉闹闹、大声、大声、大声、大声说话说话。认认真真真真预习预习 认认真做真做真做真做实验实验 养成良好的养成良好的养成良好的养成良好的实验习惯实验习惯（实验实验中、中、中、中、实验结实验结束后）束后）束后）束后）值值日生工作日生工作日生工作日生工作实验室安全及防室安全及防护预预防火灾防火灾防火灾防火灾预预防中毒防中毒防中毒防中毒外外外外伤伤实验室常用玻璃室常用玻璃仪器器吸量管吸量管*(示教示教)试管管烧杯杯量筒量筒实验考考试实验课实验课成成成成绩绩平平平平时时表表表表现现 实验测验实验测验 原理原理原理原理实验报实验报告告告告 -格式格式格式格式 结结果果果果操作考

4、操作考操作考操作考试试 分析分析分析分析实验报告网上提交告网上提交 实验报实验报告采取告采取告采取告采取网上提交网上提交网上提交网上提交的方式，的方式，的方式，的方式，实验报实验报告提交告提交告提交告提交时间设时间设定定定定为为3 3 3 3天天天天，即本次，即本次，即本次，即本次实验结实验结束后第三天晚上束后第三天晚上束后第三天晚上束后第三天晚上12121212点之前提交，点之前提交，点之前提交，点之前提交，过过期无法再提交，本次期无法再提交，本次期无法再提交，本次期无法再提交，本次实验报实验报告告告告则记为则记为0 0 0 0分分分分。尽早提交尽早提交尽早提交尽早提交报报告告告告，不要等到

5、最后期限，有，不要等到最后期限，有，不要等到最后期限，有，不要等到最后期限，有时时系系系系统统不不不不稳稳定，可能提交不上去。定，可能提交不上去。定，可能提交不上去。定，可能提交不上去。直接将直接将直接将直接将报报告粘告粘告粘告粘贴贴在框中在框中在框中在框中，切，切，切，切记记不要以附件方式上不要以附件方式上不要以附件方式上不要以附件方式上传传，否，否，否，否则则有可能文件打有可能文件打有可能文件打有可能文件打不开，影响成不开，影响成不开，影响成不开，影响成绩绩。不要相互抄不要相互抄不要相互抄不要相互抄袭袭，一旦，一旦，一旦，一旦发现发现雷同卷雷同卷雷同卷雷同卷则则均均均均记为记为0 0 0

6、0分分分分。若若若若过过期没有提交期没有提交期没有提交期没有提交报报告，不要将告，不要将告，不要将告，不要将报报告告告告发发到老到老到老到老师邮师邮箱，箱，箱，箱，发发也没用，最也没用，最也没用，最也没用，最终实验终实验报报告成告成告成告成绩绩只只只只记记系系系系统导统导出的成出的成出的成出的成绩绩。实验一一分光光度技分光光度技术及蛋白含量及蛋白含量测定定 理理理理论论掌握分光光度技掌握分光光度技掌握分光光度技掌握分光光度技术术的基本原理的基本原理的基本原理的基本原理了解分光光度了解分光光度了解分光光度了解分光光度计计的基本构造的基本构造的基本构造的基本构造 实验实验:利用分光光度技利用分光光

7、度技利用分光光度技利用分光光度技术进术进行蛋白行蛋白行蛋白行蛋白质质含量含量含量含量测测定定定定 1.1.1.1.双双双双缩脲缩脲法法法法测测定蛋白定蛋白定蛋白定蛋白质质含量含量含量含量 2.2.2.2.考考考考马马斯亮斯亮斯亮斯亮兰结兰结合法合法合法合法测测定蛋白定蛋白定蛋白定蛋白质质含量含量含量含量 3.3.3.3.紫外分光光度法紫外分光光度法紫外分光光度法紫外分光光度法测测定蛋白定蛋白定蛋白定蛋白质质含量含量含量含量 一、概念一、概念利用物利用物质特有的特有的吸收光吸收光谱来来鉴别物物质或或测定其含量的一定其含量的一项技技术。应用：用：定性、定量定性、定量优点：点：灵敏度高灵敏度高精确度

8、高精确度高操作操作简便、快速便、快速n 分光光度技分光光度技术（Spectrophotography）二、工作原理二、工作原理vv物物物物质对质对光光光光线线有有有有选择选择性吸收作用。性吸收作用。性吸收作用。性吸收作用。vv每种物每种物每种物每种物质质都具有其特征性的吸收光都具有其特征性的吸收光都具有其特征性的吸收光都具有其特征性的吸收光谱谱。vv在一定条件下，物在一定条件下，物在一定条件下，物在一定条件下，物质对质对光的吸收程度与光的吸收程度与光的吸收程度与光的吸收程度与该该物物物物质质的的的的浓浓度成正比。度成正比。度成正比。度成正比。分光光度法所使用的光谱范围：分光光度法所使用的光谱范

9、围：200nm 10m 200 400nm 400 760nm 760 10m 紫外光区紫外光区 可见光区可见光区 红外光区红外光区如何定性？如何定性？利用利用利用利用吸收光吸收光吸收光吸收光谱谱曲曲曲曲线线鉴鉴定化合物定化合物定化合物定化合物 吸收光吸收光吸收光吸收光谱谱曲曲曲曲线线：以不同以不同以不同以不同波波波波长长的的的的单单色光色光色光色光作作作作为为入射光入射光入射光入射光，测测定某一定某一定某一定某一溶液的吸光度溶液的吸光度溶液的吸光度溶液的吸光度，以波，以波，以波，以波长为长为横横横横轴轴，吸光度，吸光度，吸光度，吸光度为纵轴为纵轴作作作作图图，得到溶液的，得到溶液的，得到溶液

10、的，得到溶液的吸收光吸收光吸收光吸收光谱谱曲曲曲曲线线。每种物每种物每种物每种物质质有其特征性的吸收光有其特征性的吸收光有其特征性的吸收光有其特征性的吸收光谱谱，故可作故可作故可作故可作为为定性分析的依据定性分析的依据定性分析的依据定性分析的依据。吸吸 光光 度度 1.1.朗伯朗伯朗伯朗伯（LambertLambert）定律定律定律定律一束一束一束一束单单色光通色光通色光通色光通过过一光吸收介一光吸收介一光吸收介一光吸收介质时质时，其光，其光，其光，其光强强度随吸收光介度随吸收光介度随吸收光介度随吸收光介质质的的的的厚度厚度厚度厚度增增增增加呈指数减少。加呈指数减少。加呈指数减少。加呈指数减少

11、I I1 1/I/I0 0=e=e-K-K1 1l l2.2.比比比比尔尔（BeerBeer）定律定律定律定律 一束一束一束一束单单色光通色光通色光通色光通过过一光吸收介一光吸收介一光吸收介一光吸收介质时质时，其光，其光，其光，其光强强度随吸收光介度随吸收光介度随吸收光介度随吸收光介质质的的的的浓浓度度度度的增加呈指数减少。的增加呈指数减少。的增加呈指数减少。的增加呈指数减少。I I1 1/I/I0 0=e=e-K-K2 2C C I I0 0:入射光入射光入射光入射光强强度；度；度；度；I I :透射光透射光透射光透射光强强度；度；度；度；l l：介：介：介：介质质厚度厚度厚度厚度 C C

12、介：介：介：介质浓质浓度度度度如何定量？如何定量？Lambert-Beer定律定律*3.Lambert-Beer定律定律*一束一束一束一束单单色光通色光通色光通色光通过过某溶液某溶液某溶液某溶液时时，光波被溶液吸收一部，光波被溶液吸收一部，光波被溶液吸收一部，光波被溶液吸收一部分，吸收多少与溶液的分，吸收多少与溶液的分，吸收多少与溶液的分，吸收多少与溶液的浓浓度和溶液厚度成正比。度和溶液厚度成正比。度和溶液厚度成正比。度和溶液厚度成正比。A=A=CLCL A A：吸光度；吸光度；吸光度；吸光度；C C：溶液溶液溶液溶液浓浓度；度；度；度；L L：液液液液层层厚度厚度厚度厚度 ：即摩即摩即摩即

13、摩尔尔吸光系数，指一定波吸光系数，指一定波吸光系数，指一定波吸光系数，指一定波长时长时，溶液的，溶液的，溶液的，溶液的浓浓度度度度为为1 mol/L1 mol/L，光程，光程，光程，光程为为 1cm1cm时时的吸光度的吸光度的吸光度的吸光度值值。*在在在在波波波波长长、溶液、溶液、溶液、溶液和和和和温度温度温度温度确定的情况下，确定的情况下，确定的情况下，确定的情况下，由物由物由物由物质质的的的的特性决定的。特性决定的。特性决定的。特性决定的。4.4.计算算*（1 1）标准管法准管法（标准比准比较法）法）实际测实际测定定定定过过程中，用一程中，用一程中，用一程中，用一已知已知已知已知浓浓度度度

14、度的的的的测测定物按定物按定物按定物按测测定管同定管同定管同定管同样处样处理理理理显显色，色，色，色，读读出吸光度，再根据前式出吸光度，再根据前式出吸光度，再根据前式出吸光度，再根据前式计计算。算。算。算。A A标标准准准准=标标准准准准C C标标准准准准L L标标准准准准A A样样品品品品=样样品品品品C C样样品品品品L L样样品品品品A A：吸光度；：吸光度；：吸光度；：吸光度；：摩：摩：摩：摩尔尔吸光度；吸光度；吸光度；吸光度；C C：溶液：溶液：溶液：溶液浓浓度；度；度；度；L L：液：液：液：液层层厚度厚度厚度厚度因因标准液和准液和样品液中溶品液中溶质为同一物同一物质，样品品=标准

15、准 因盛因盛标准液和准液和测定液的比色杯径定液的比色杯径长相同相同L样品品=L标准准 故上二式可写成：故上二式可写成：A标准准/A样品品=标准准C标准准L标准准/样品品C样品品L样品品 C样品品=A样品品/A标准准 C标准准（2 2）标标准曲准曲准曲准曲线线法法法法 绘绘制制制制标标准曲准曲准曲准曲线线：配制配制配制配制一系列已知不同一系列已知不同一系列已知不同一系列已知不同浓浓度度度度的的的的测测定物溶液，按定物溶液，按定物溶液，按定物溶液，按测测定管同定管同定管同定管同样样方法方法方法方法处处理理理理显显色，分色，分色，分色，分别读别读取各管吸光度。以溶液取各管吸光度。以溶液取各管吸光度。

16、以溶液取各管吸光度。以溶液浓浓度度度度为为横座横座横座横座标标，吸，吸，吸，吸光度光度光度光度为纵为纵座座座座标标，在方格座，在方格座，在方格座，在方格座标纸标纸上作上作上作上作图图得得得得标标准曲准曲准曲准曲线线。获获取取取取样样品的品的品的品的浓浓度：根据度：根据度：根据度：根据测测得得得得样样品的吸光度品的吸光度品的吸光度品的吸光度值值从从从从标标准曲准曲准曲准曲线线上上上上获获得得得得测测定物的定物的定物的定物的浓浓度。度。度。度。浓度吸光度标准曲准曲线使用注意事使用注意事项vv标标准曲准曲准曲准曲线线范范范范围围在在在在测测定定定定浓浓度的一半到二倍之度的一半到二倍之度的一半到二倍之

17、度的一半到二倍之间间。vv吸光度在吸光度在吸光度在吸光度在0.050.051.01.0范范范范围围内。内。内。内。vv所作所作所作所作标标准曲准曲准曲准曲线仅线仅供短期使用。供短期使用。供短期使用。供短期使用。vv标标准曲准曲准曲准曲线线制作与制作与制作与制作与测测定管定管定管定管测测定定定定应应在同一台在同一台在同一台在同一台仪仪器上器上器上器上进进行，行，行，行，避免避免避免避免误误差差差差产产生。生。生。生。5 5应应用中注意的用中注意的用中注意的用中注意的问题问题*vv Lambert-beers law Lambert-beers law的偏离：的偏离：的偏离：的偏离：该该定律只适定

18、律只适定律只适定律只适应应于一定于一定于一定于一定浓浓度度度度范范范范围围，A A宜在宜在宜在宜在0.050.051.01.0之之之之间间；vv 选择选择波波波波长长：最大吸收波最大吸收波最大吸收波最大吸收波长长；a.a.灵敏；灵敏；灵敏；灵敏；b.b.避免避免避免避免杂质杂质干干干干扰扰vv 参比溶液（空白管）参比溶液（空白管）参比溶液（空白管）参比溶液（空白管）：消除背景效：消除背景效：消除背景效：消除背景效应应，应应包含除待包含除待包含除待包含除待测测溶溶溶溶质质以外所有的成分。以外所有的成分。以外所有的成分。以外所有的成分。空白管：空白管：测测量量量量过过程中，因比色皿本身和溶程中，因

19、比色皿本身和溶程中，因比色皿本身和溶程中，因比色皿本身和溶剂剂也会也会也会也会产产生一定的生一定的生一定的生一定的光吸收，故光吸收，故光吸收，故光吸收，故设设置一个置一个置一个置一个空白管空白管空白管空白管，即其中除了待，即其中除了待，即其中除了待，即其中除了待测测溶溶溶溶质质以外，以外，以外，以外，其它的成分完全相同。其它的成分完全相同。其它的成分完全相同。其它的成分完全相同。测测量量量量时时，首先以空白管，首先以空白管，首先以空白管，首先以空白管对对准光路准光路准光路准光路对仪对仪器器器器调调零零零零，既消，既消，既消，既消除比色皿本身除比色皿本身除比色皿本身除比色皿本身对对光的吸收，又消

20、除了非待光的吸收，又消除了非待光的吸收，又消除了非待光的吸收，又消除了非待测测物物物物对对光的吸光的吸光的吸光的吸收，所收，所收，所收，所测值测值即即即即为为待待待待测测物造成的光吸收。物造成的光吸收。物造成的光吸收。物造成的光吸收。n分光光度分光光度计(spectrophotometer)一基本部件一基本部件单色器光源狭缝吸收池检测系统、测量装置钨灯氢灯棱镜光栅比色皿/比色池 二、分光光度分光光度计使用步使用步骤（示教）（示教）三、使用三、使用时注意事注意事项*1.波波长选择。2.机器机器预热。3.不不测量量时，应使使样品室盖品室盖处于开启状于开启状态，否否则会使光会使光电管疲管疲劳。4.不

21、不应把成有把成有腐腐蚀性液体性液体的比色皿放在的比色皿放在仪器表面。器表面。5.比色皿使用注意事比色皿使用注意事项*v由于紫外光不能透由于紫外光不能透由于紫外光不能透由于紫外光不能透过过玻璃比色皿，玻璃比色皿，玻璃比色皿，玻璃比色皿，紫外光区紫外光区紫外光区紫外光区测测量量量量时时要要要要用石英比色皿用石英比色皿用石英比色皿用石英比色皿。v 同同同同组组使用的比色皿必使用的比色皿必使用的比色皿必使用的比色皿必须须配套（配套（配套（配套（规规格、新旧程度格、新旧程度格、新旧程度格、新旧程度一致）。一致）。一致）。一致）。v 比色皿有比色皿有比色皿有比色皿有2 2 2 2光面与光面与光面与光面与2

22、 2 2 2毛面，光学表面毛面，光学表面毛面，光学表面毛面，光学表面对对准光路，准光路，准光路，准光路，不能有任何不能有任何不能有任何不能有任何污损污损，否否否否则则会引起光吸收的增加。会引起光吸收的增加。会引起光吸收的增加。会引起光吸收的增加。v比色皿中所盛溶液比色皿中所盛溶液比色皿中所盛溶液比色皿中所盛溶液不能太少不能太少不能太少不能太少，也，也，也，也不能太多不能太多不能太多不能太多，一，一，一，一般所盛液体般所盛液体般所盛液体般所盛液体约约占全部容占全部容占全部容占全部容积积的的的的2/32/32/32/3。v 腐腐腐腐蚀蚀性溶液不得性溶液不得性溶液不得性溶液不得长长期盛放在比色皿中。

23、期盛放在比色皿中。期盛放在比色皿中。期盛放在比色皿中。v 每次使用后每次使用后每次使用后每次使用后,应应立即倒空或以吸液立即倒空或以吸液立即倒空或以吸液立即倒空或以吸液泵泵吸干，然后吸干，然后吸干，然后吸干，然后用水冲洗比色皿用水冲洗比色皿用水冲洗比色皿用水冲洗比色皿3 3 3 34 4 4 4次。次。次。次。*本次本次本次本次实验实验，考，考，考，考马马斯亮斯亮斯亮斯亮蓝蓝可使玻璃比色皿着可使玻璃比色皿着可使玻璃比色皿着可使玻璃比色皿着色，酒精浸泡后清洗。色，酒精浸泡后清洗。色，酒精浸泡后清洗。色，酒精浸泡后清洗。蛋白蛋白质定量分析定量分析实验 实验实验一一一一 双双双双缩脲缩脲法法法法测测

24、定蛋白定蛋白定蛋白定蛋白质质含量含量含量含量（p50p50p50p50）实验实验三三三三 考考考考马马斯亮斯亮斯亮斯亮兰结兰结合法合法合法合法测测定蛋白定蛋白定蛋白定蛋白质质含量（含量（含量（含量（p52p52p52p52）实验实验四四四四 紫外分光光度法紫外分光光度法紫外分光光度法紫外分光光度法测测定蛋白定蛋白定蛋白定蛋白质质含量含量含量含量（p53p53p53p53）实验一一 双双缩脲法法测定蛋白定蛋白质含量含量【基本原理基本原理基本原理基本原理】蛋白蛋白蛋白蛋白质质分子中含有分子中含有分子中含有分子中含有许许多多多多肽键肽键，与双，与双，与双，与双缩脲结缩脲结构构构构类类似似似似，在碱性

25、在碱性在碱性在碱性溶液中能与溶液中能与溶液中能与溶液中能与铜铜离子离子离子离子结结合成合成合成合成紫色紫色紫色紫色的化合物的化合物的化合物的化合物（称双（称双（称双（称双缩脲缩脲反反反反应应）。）。）。）。在一定在一定在一定在一定浓浓度范度范度范度范围围，颜颜色的深浅与蛋白色的深浅与蛋白色的深浅与蛋白色的深浅与蛋白质浓质浓度成正比度成正比度成正比度成正比，故可故可故可故可用比色法用比色法用比色法用比色法测测定蛋白定蛋白定蛋白定蛋白质质的含量。的含量。的含量。的含量。含有两个以上含有两个以上含有两个以上含有两个以上肽键肽键的物的物的物的物质质才有此反才有此反才有此反才有此反应应，故氨基酸无此反，

26、故氨基酸无此反，故氨基酸无此反，故氨基酸无此反应应。双双双双缩脲缩脲法的灵敏度法的灵敏度法的灵敏度法的灵敏度为为1-20mg1-20mg1-20mg1-20mg。试试 剂剂 （mlml）1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 6 6标准蛋白质溶液标准蛋白质溶液0.10.10.30.30.50.50.70.70.90.9生理盐水生理盐水0.90.90.70.70.50.50.30.30.10.11.01.0双缩脲试剂双缩脲试剂4.04.04.04.04.04.04.04.04.04.04.04.0【操作步骤】【操作步骤】（一）（一）（一）（一）标标准曲准曲准曲准曲线线的的的的绘绘制制制制1.1.

27、1.1.取小取小取小取小试试管管管管6 6 6 6支，支，支，支，编编号按下表操作号按下表操作号按下表操作号按下表操作2 2混合混合后，于后，于3737水浴水浴中放置中放置1515分分钟，在，在540nm540nm波波长下比色，以下比色，以 第第6 6管管调零，零，测得各管的吸光度得各管的吸光度值。以各管的吸光度。以各管的吸光度值为纵 座座标，蛋白，蛋白质浓度度为横座横座标，绘成曲成曲线。（二）（二）（二）（二）样样品品品品测测定：定：定：定：取取取取样样品品品品0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml，加生理，加生理，加生理，加生理盐盐水水水水0.9m10.9m10.9m10.9m1，再加双

28、再加双，再加双，再加双缩脲试剂缩脲试剂4m14m14m14m1，于，于，于，于37373737水浴中放置水浴中放置水浴中放置水浴中放置15151515分分分分钟钟，测测其吸光度，根据吸光度其吸光度，根据吸光度其吸光度，根据吸光度其吸光度，根据吸光度值查值查标标准曲准曲准曲准曲线线并并并并计计算得出算得出算得出算得出样样品中蛋白品中蛋白品中蛋白品中蛋白质质的的的的浓浓度。度。度。度。注意：注意：注意：注意：v双双缩脲法的灵敏度法的灵敏度为1-20mg1-20mg，取蛋白，取蛋白标准液准液时注意注意浓度。度。v实验时，样品管可与品管可与标准管同准管同时处理理【基本原理基本原理基本原理基本原理】考

29、考考考马马斯亮斯亮斯亮斯亮兰兰G-250G-250存在着两种不同的存在着两种不同的存在着两种不同的存在着两种不同的颜颜色形式，色形式，色形式，色形式，红红色和色和色和色和蓝蓝色。它和蛋白色。它和蛋白色。它和蛋白色。它和蛋白质质可通可通可通可通过过范德范德范德范德华华力力力力结结合，与蛋白合，与蛋白合，与蛋白合，与蛋白质结质结合后合后合后合后颜颜色色色色由由由由红红色色色色转变转变成成成成蓝蓝色，最大吸收峰从色，最大吸收峰从色，最大吸收峰从色，最大吸收峰从465nm465nm变变成成成成595nm595nm，能，能，能，能过过测测定定定定595nm595nm处处的光吸收的增加量可知与其的光吸收的

30、增加量可知与其的光吸收的增加量可知与其的光吸收的增加量可知与其结结合蛋白合蛋白合蛋白合蛋白质质的量。的量。的量。的量。优优点：点：点：点：灵敏度高，灵敏度高，灵敏度高，灵敏度高，1-51-5 g g；测测定速度快；干定速度快；干定速度快；干定速度快；干扰扰物物物物质质少。少。少。少。实验三三 考考马斯亮斯亮兰结合法合法测定蛋白定蛋白质含量含量1 1取取取取试试管管管管3 3 3 3支，支，支，支，编编号按下表操作号按下表操作号按下表操作号按下表操作 试试 剂剂（mlmlmlml）空白空白空白空白标标准准准准标标本本本本 生理生理生理生理盐盐水水水水0.10.10.10.1 蛋白蛋白蛋白蛋白标标

31、准液准液准液准液(50ug(50ug(50ug(50ugml)0.1ml)0.1ml)0.1ml)0.1 样样 品品品品0.10.10.10.1 考考考考马马斯亮斯亮斯亮斯亮蓝试剂蓝试剂5.05.05.05.05.05.05.05.05.05.05.05.02.2.混匀，放置混匀，放置5 5分分钟，在波，在波长595nm595nm处，以空白管，以空白管调“0 0”，测定各管的吸光度。定各管的吸光度。【操作步骤操作步骤】3.计算计算 A标本标本/A标准标准 50（g/ml）=样品中蛋白质的含量样品中蛋白质的含量（g/ml）注意：注意：蛋白蛋白蛋白蛋白标标准液准液准液准液浓浓度度度度50 g/ml

32、50 g/ml实验四四紫外分光光度法紫外分光光度法测定蛋白定蛋白质含量含量【基本原理基本原理基本原理基本原理】由于蛋白由于蛋白由于蛋白由于蛋白质质分子中含有酪氨酸，色氨酸等芳香分子中含有酪氨酸，色氨酸等芳香分子中含有酪氨酸，色氨酸等芳香分子中含有酪氨酸，色氨酸等芳香族氨基酸，因而蛋白族氨基酸，因而蛋白族氨基酸，因而蛋白族氨基酸，因而蛋白质质具有吸收紫外光的性具有吸收紫外光的性具有吸收紫外光的性具有吸收紫外光的性质质，吸，吸，吸，吸收高峰在收高峰在收高峰在收高峰在280nm280nm280nm280nm波波波波长长处处。由于各种蛋白。由于各种蛋白。由于各种蛋白。由于各种蛋白质质所含芳香族所含芳香

33、族所含芳香族所含芳香族氨基酸的量相差很少，因此在此波氨基酸的量相差很少，因此在此波氨基酸的量相差很少，因此在此波氨基酸的量相差很少，因此在此波长长范范范范围围内，吸收内，吸收内，吸收内，吸收峰的光密度峰的光密度峰的光密度峰的光密度值值与其与其与其与其浓浓度成正比关系，可作定量度成正比关系，可作定量度成正比关系，可作定量度成正比关系，可作定量测测定。定。定。定。灵敏度：灵敏度：灵敏度：灵敏度：50-10050-10050-10050-100 g g g g【操作步骤】【操作步骤】（一）制作（一）制作（一）制作（一）制作标标准曲准曲准曲准曲线线1.1.1.1.取取取取试试管管管管6 6 6 6支，

34、支，支，支，编编号，按下表操作。号，按下表操作。号，按下表操作。号，按下表操作。试剂试剂（mlmlmlml）123456123456123456123456标标准蛋白准蛋白准蛋白准蛋白质质溶液溶液溶液溶液0.51.01.52.02.500.51.01.52.02.500.51.01.52.02.500.51.01.52.02.50生理生理生理生理盐盐水水水水3.53.02.52.01.54.03.53.02.52.01.54.03.53.02.52.01.54.03.53.02.52.01.54.0混匀，盛于石英杯中，用紫外分光光度混匀，盛于石英杯中，用紫外分光光度混匀，盛于石英杯中，用紫外分

35、光光度混匀，盛于石英杯中，用紫外分光光度计计，以第，以第，以第，以第6 6 6 6管管管管调调“0 0 0 0”，在，在，在，在280nm280nm280nm280nm波波波波长长下下下下测测定各管光密度，以各管的光密度定各管光密度，以各管的光密度定各管光密度，以各管的光密度定各管光密度，以各管的光密度值为纵值为纵座座座座标标，以蛋白，以蛋白，以蛋白，以蛋白质浓质浓度度度度为为横座横座横座横座标绘标绘制制制制标标准曲准曲准曲准曲线图线图。（二）（二）（二）（二）标标本本本本测测定：取定：取定：取定：取标标本本本本1.0ml1.0ml1.0ml1.0ml，加入生理，加入生理，加入生理，加入生理盐

36、盐水水水水3.0ml3.0ml3.0ml3.0ml，测测A A A A280280280280标标准曲准曲准曲准曲线线上上上上读读出出出出浓浓度。度。度。度。1.1.颈椎脱臼椎脱臼处死小鼠，剪开腹部，取出肝死小鼠，剪开腹部，取出肝脏组织，置于平皿中，置于平皿中用用PBSPBS清洗。清洗。2.2.称取称取100mg100mg肝肝组织，剪碎，并，剪碎，并转移到匀移到匀浆器中。器中。3.3.将将1mL1mL预冷的裂解冷的裂解缓冲液加入匀冲液加入匀浆器中，冰浴条件下充分研器中，冰浴条件下充分研磨。将磨。将组织研磨液研磨液转移到移到1.5mL1.5mL的离心管中。的离心管中。4.4.离心（离心（13000rpm13000rpm，5min5min），取上清液），取上清液转移至一新的移至一新的1.5ml1.5ml离离心管中，即心管中，即为组织蛋白粗提取液。蛋白粗提取液。小鼠肝小鼠肝脏组织总蛋白的提取蛋白的提取注意：注意：实验一一用原液用原液，实验三和三和实验四四将原液将原液进行行5050倍稀倍稀释。实验安排安排1.获得蛋白样品：自己提取蛋白。2.蛋白含量测定：上午完成1-2个实验，下午1-2个。