化学发光免疫技术课件.ppt

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1、人民卫生出版社人民卫生出版社免疫学检验免疫学检验人民卫生出版社人民卫生出版社第二十一章第二十一章化学发光免疫技术化学发光免疫技术 人民卫生出版社人民卫生出版社1.1.化学发光剂的概念及常用的化学发光剂。化学发光剂的概念及常用的化学发光剂。2.2.化学发光免疫分析的基本原理及其技术类化学发光免疫分析的基本原理及其技术类型。型。3.3.化学发光酶免疫分析基本原理及其分离技化学发光酶免疫分析基本原理及其分离技术。术。4.4.电化学发光免疫分析基本原理。电化学发光免疫分析基本原理。5.5.化学发光免疫技术的临床应用。化学发光免疫技术的临床应用。本章要点本章要点人民卫生出版社人民卫生出版社目录目录 发光

2、基本知识发光基本知识1化学发光免疫分析化学发光免疫分析2化学发光酶免疫分析化学发光酶免疫分析3电化学发光免疫分析电化学发光免疫分析4化学发光免疫技术的临床应用化学发光免疫技术的临床应用5人民卫生出版社人民卫生出版社化学发光免疫化学发光免疫技术技术是将具有高灵敏度的化学发光测是将具有高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的定技术与高特异性的抗原抗体抗原抗体反应反应技术技术相结合，用相结合，用于各种抗原、半抗原、抗体、激素、酶、维生素和于各种抗原、半抗原、抗体、激素、酶、维生素和药物等的检测分析技术药物等的检测分析技术。该技术具有。该技术具有特异性高、特异性高、灵灵敏度敏度高、分离简便、高、分离简便

3、快速、试剂无毒、安全稳定、快速、试剂无毒、安全稳定、可自动化可自动化分析等特点，在免疫学检验中应用广泛。分析等特点，在免疫学检验中应用广泛。前前 言言人民卫生出版社人民卫生出版社放放射射免免疫疫技技术术酶酶免免疫疫技技术术荧荧光光免免疫疫技技术术金金免免疫疫技技术术化化学学发发光光免免疫疫技技术术标记免疫技术标记免疫技术人民卫生出版社人民卫生出版社第一节第一节 基本知识基本知识 一、发光一、发光发光是指分子或原子中的电子吸收能量后，由低能级发光是指分子或原子中的电子吸收能量后，由低能级的基态跃迁到高能级的激发态，然后再返回到基态，的基态跃迁到高能级的激发态，然后再返回到基态，释放出的能量表现

4、为光的发射。根据形成激发态的激释放出的能量表现为光的发射。根据形成激发态的激发能不同可将发光分为发能不同可将发光分为光照发光光照发光、生物发光生物发光和和化学发化学发光光。人民卫生出版社人民卫生出版社1.1.光照发光（光照发光（photoluminescencephotoluminescence）发光剂（荧光素）经短波长入射光照射后进发光剂（荧光素）经短波长入射光照射后进入激发态，当回复至基态时发出较长波长的入激发态，当回复至基态时发出较长波长的可见光。可见光。人民卫生出版社人民卫生出版社2.2.生物发光（生物发光（bioluminescencebioluminescence）发生在生物体内的

5、发光现象，如萤火虫的发光，反发生在生物体内的发光现象，如萤火虫的发光，反应底物为萤火虫荧光素，在荧光素酶的催化下，利应底物为萤火虫荧光素，在荧光素酶的催化下，利用用ATPATP产能，生成激发态氧化型荧光素，它在回复产能，生成激发态氧化型荧光素，它在回复基态时多余的能量以光子的形式释放出来。基态时多余的能量以光子的形式释放出来。人民卫生出版社人民卫生出版社3.3.化学发光化学发光某些物质某些物质(发光剂发光剂)在化学反应时，吸收了反应过在化学反应时，吸收了反应过程中所产生的化学能，使反应的产物分子或中间程中所产生的化学能，使反应的产物分子或中间态分子中的电子跃迁到激发态，当电子从激发态态分子中的

6、电子跃迁到激发态，当电子从激发态回复到基态时，以发射光子的形式释放出能量，回复到基态时，以发射光子的形式释放出能量，这一现象称为化学发光。这一现象称为化学发光。人民卫生出版社人民卫生出版社一个化学反应要产生化学发光现象，必须满足以一个化学反应要产生化学发光现象，必须满足以下条件：下条件：该反应必须提供足够的激发能该反应必须提供足够的激发能,并由某一步骤单独并由某一步骤单独提供提供,因为前一步反应释放的能量将因振动弛豫消失因为前一步反应释放的能量将因振动弛豫消失在溶液中而不能发光在溶液中而不能发光要有有利的反应过程要有有利的反应过程,使化学反应的能量至少能被使化学反应的能量至少能被一种物质所接受

7、并生成激发态一种物质所接受并生成激发态激发态分子必须具有一定的化学发光量子效率释放激发态分子必须具有一定的化学发光量子效率释放出光子出光子,或者能够转移它的能量给另一个分子使之进或者能够转移它的能量给另一个分子使之进入激发态并释放出光子入激发态并释放出光子 人民卫生出版社人民卫生出版社在化学发光反应中参与能量转移并最终以发射光在化学发光反应中参与能量转移并最终以发射光子的形式释放能量的化合物称为子的形式释放能量的化合物称为化学发光剂化学发光剂或或发发光底物光底物。二二.化学发光剂化学发光剂人民卫生出版社人民卫生出版社作为化学发光免疫技术的化学发光剂应符合以下作为化学发光免疫技术的化学发光剂应符

8、合以下几个条件：几个条件：发光的量子产率高发光的量子产率高 物理物理-化学特性要与被标记或测定的物质相匹配化学特性要与被标记或测定的物质相匹配 能与抗原或抗体形成稳定的偶联结合物能与抗原或抗体形成稳定的偶联结合物 其化学发光常是氧化反应的结果其化学发光常是氧化反应的结果 在所使用的浓度范围内对生物体没有毒性在所使用的浓度范围内对生物体没有毒性 人民卫生出版社人民卫生出版社常用的化学发光剂或发光底物有常用的化学发光剂或发光底物有 1.1.直接化学发光剂直接化学发光剂 2.2.酶促反应的发光底物酶促反应的发光底物 3.3.电化学发光剂电化学发光剂 人民卫生出版社人民卫生出版社1.1.直接化学发光剂

9、直接化学发光剂在发光免疫分析过程中不需酶的催化作用，直接在发光免疫分析过程中不需酶的催化作用，直接参与发光反应，它们在化学结构上有产生发光的参与发光反应，它们在化学结构上有产生发光的特有基团，可直接标记抗原或抗体。如常用的吖特有基团，可直接标记抗原或抗体。如常用的吖啶酯（啶酯（acridiniumacridinium，AEAE）。人民卫生出版社人民卫生出版社吖啶酯吖啶酯在碱性条件下被在碱性条件下被H H2 2O O2 2氧化时氧化时,发出波长发出波长为为470nm470nm的光，具有很高的发光效率，其激发的光，具有很高的发光效率，其激发态产物态产物N-N-甲基吖啶酮是该发光反应体系的发光体。甲

10、基吖啶酮是该发光反应体系的发光体。人民卫生出版社人民卫生出版社2.2.酶促反应的发光底物酶促反应的发光底物 是利用标记酶的催化作用，使发光剂（底物）发是利用标记酶的催化作用，使发光剂（底物）发光。光。目前化学发光酶免疫技术中常用的酶有辣根过氧目前化学发光酶免疫技术中常用的酶有辣根过氧 化物酶（化物酶（HRPHRP）和碱性磷酸酶（）和碱性磷酸酶（ALPALP）。）。HRPHRP的常用的常用 的发光底物为鲁米诺或其衍生物，的发光底物为鲁米诺或其衍生物，ALPALP的发光底物的发光底物 为金刚烷（为金刚烷（AMPPDAMPPD）人民卫生出版社人民卫生出版社（1 1）鲁米诺或其衍生物）鲁米诺或其衍生物

11、 鲁米诺在碱性条件下可被一些氧化剂氧化，发生化鲁米诺在碱性条件下可被一些氧化剂氧化，发生化学发光反应，辐射出最大发射波长为学发光反应，辐射出最大发射波长为425nm425nm的光。的光。人民卫生出版社人民卫生出版社鲁米诺增强发光反应原理鲁米诺增强发光反应原理人民卫生出版社人民卫生出版社（2 2）AMPPDAMPPD 3-(23-(2-螺旋金刚烷螺旋金刚烷)-4-)-4-甲氧基甲氧基-4-(3-4-(3“-磷酰氧磷酰氧基基)苯苯-1,2-1,2-二氧杂环丁烷二氧杂环丁烷人民卫生出版社人民卫生出版社3 3电化学发光剂电化学发光剂 电化学发光剂是指通过在电极表面进行电化学反电化学发光剂是指通过在电极

12、表面进行电化学反应而发光的物质。如化学发光剂三联吡啶钌应而发光的物质。如化学发光剂三联吡啶钌Ru(bpy)32+Ru(bpy)32+和电子供体三丙胺（和电子供体三丙胺（TPATPA）在阳性电）在阳性电极表面可同时失去一个电子而发生氧化反应。极表面可同时失去一个电子而发生氧化反应。人民卫生出版社人民卫生出版社用化学发光剂（如吖啶酯）直接标记抗体用化学发光剂（如吖啶酯）直接标记抗体(抗原抗原)，与待测标本中相应的抗原，与待测标本中相应的抗原(抗体抗体)和磁颗粒性的和磁颗粒性的抗体（抗原）发生免疫反应后，通过磁场把结合抗体（抗原）发生免疫反应后，通过磁场把结合状态和游离状态的化学发光剂标记物分离开来

13、状态和游离状态的化学发光剂标记物分离开来，这时只需加入氧化剂（这时只需加入氧化剂（H H2 2O O2 2）和）和NaOHNaOH使成碱性环使成碱性环境，吖啶酯在不需要催化剂的情况下分解、发光。境，吖啶酯在不需要催化剂的情况下分解、发光。由集光器和光电倍增管接收、记录单位时间内所由集光器和光电倍增管接收、记录单位时间内所产生的光子能，可从标准曲线上计算出待测抗原产生的光子能，可从标准曲线上计算出待测抗原(抗体抗体)的含量的含量 第二节第二节 化学发光免疫分析化学发光免疫分析一、一、检测原理检测原理人民卫生出版社人民卫生出版社化学发光免疫分析双抗体夹心法原理示意图化学发光免疫分析双抗体夹心法原

14、理示意图 人民卫生出版社人民卫生出版社1.1.分离方法分离方法 常用磁颗粒分离技术，即用抗原或抗体包被磁颗粒，常用磁颗粒分离技术，即用抗原或抗体包被磁颗粒，与标本中相应抗体或抗原及吖啶酯标记的抗体或与标本中相应抗体或抗原及吖啶酯标记的抗体或抗原通过一定模式的免疫学反应后抗原通过一定模式的免疫学反应后,最终通过在磁场最终通过在磁场中冲洗将结合到免疫复合物中的标记物和游离标记物中冲洗将结合到免疫复合物中的标记物和游离标记物进行分离的技术。进行分离的技术。二、方法类型二、方法类型 人民卫生出版社人民卫生出版社2.2.常用的免疫学反应模式常用的免疫学反应模式 双双抗抗原原夹夹心心法法固相抗原竞争法固相

15、抗原竞争法双双抗抗体体夹夹心心法法人民卫生出版社人民卫生出版社三、技术要点三、技术要点抗原抗体结合反应抗原抗体结合反应 结合物与游离物的分离结合物与游离物的分离(磁颗粒分离技术磁颗粒分离技术)化学发光反应化学发光反应 人民卫生出版社人民卫生出版社化学发光酶免疫分析（化学发光酶免疫分析（CLEIACLEIA）是用参与催化某一）是用参与催化某一化学发光反应的酶如辣根过氧化物酶（化学发光反应的酶如辣根过氧化物酶（HRPHRP）或碱）或碱性磷酸酶性磷酸酶(ALP)(ALP)来标记抗原或抗体，在与待测标本来标记抗原或抗体，在与待测标本中相应的抗体中相应的抗体(抗原抗原)发生免疫反应后，经洗涤将发生免疫反

16、应后，经洗涤将结合物与游离的酶标物分离后，加入底物结合物与游离的酶标物分离后，加入底物(发光剂发光剂)，酶催化和分解底物发光，由光量子阅读系统接，酶催化和分解底物发光，由光量子阅读系统接收，光电倍增管将光信号转变为电信号并加以放收，光电倍增管将光信号转变为电信号并加以放大，再把它们传送至计算机数据处理系统，计算大，再把它们传送至计算机数据处理系统，计算出测定物的浓度。出测定物的浓度。第三节第三节 化学发光酶免疫分析化学发光酶免疫分析一、一、检测原理检测原理人民卫生出版社人民卫生出版社碱性磷酸酶化学发光酶免疫分析双抗体夹心法原理示意图碱性磷酸酶化学发光酶免疫分析双抗体夹心法原理示意图 人民卫生出

17、版社人民卫生出版社 1.1.根据标记酶不同分类根据标记酶不同分类 可分为辣根过氧化物可分为辣根过氧化物酶标记的化学发光酶免疫分析和碱性磷酸酶标酶标记的化学发光酶免疫分析和碱性磷酸酶标记的化学发光酶免疫分析。前者常以鲁米诺或记的化学发光酶免疫分析。前者常以鲁米诺或其衍生物作为发光底物，后者常以其衍生物作为发光底物，后者常以AMPPDAMPPD作为发作为发光底物。光底物。2.2.根据免疫学反应模式分类根据免疫学反应模式分类 同化学发光免疫同化学发光免疫分析，主要有双抗体夹心法、双抗原夹心法和分析，主要有双抗体夹心法、双抗原夹心法和固相抗原竞争法等主要模式，所不同只是相应固相抗原竞争法等主要模式，所

18、不同只是相应抗原或抗体上标记的是酶而不是直接标记发光抗原或抗体上标记的是酶而不是直接标记发光剂。剂。二、方法类型二、方法类型 人民卫生出版社人民卫生出版社三、技术要点三、技术要点抗原抗体结合反应抗原抗体结合反应 结合物与游离物的分离结合物与游离物的分离（磁颗粒分离法磁颗粒分离法 、微粒子捕获法、微粒子捕获法 、包被聚苯乙烯反应珠或孔分离法、包被聚苯乙烯反应珠或孔分离法 ）酶促发光反应酶促发光反应 人民卫生出版社人民卫生出版社电化学发光免疫分析（电化学发光免疫分析（ECLIAECLIA）是以电化学发光剂）是以电化学发光剂三联吡啶钌标记抗体三联吡啶钌标记抗体(抗原抗原)，通过抗原抗体反应，通过抗原

19、抗体反应和磁珠分离技术，根据三联吡啶钌在电极上发出和磁珠分离技术，根据三联吡啶钌在电极上发出的光强度对待测的抗原或抗体进行定量分析，它的光强度对待测的抗原或抗体进行定量分析，它包括电化学和化学发光两个过程。包括电化学和化学发光两个过程。第四节第四节 电化学发光免疫分析电化学发光免疫分析一、一、检测原理检测原理人民卫生出版社人民卫生出版社电化学发光免疫分析双抗体夹心法原理示意图电化学发光免疫分析双抗体夹心法原理示意图 人民卫生出版社人民卫生出版社电化学发光免疫测定示意图电化学发光免疫测定示意图人民卫生出版社人民卫生出版社1.1.分离方法分离方法 常用磁颗粒分离技术常用磁颗粒分离技术2.2.免疫学

20、反应模式免疫学反应模式 其反应模式同发光免疫分析，其反应模式同发光免疫分析，主要有双抗体夹心法、双抗原夹心法和固相抗原主要有双抗体夹心法、双抗原夹心法和固相抗原竞争法三种主要模式，所不同只是相应抗原或抗竞争法三种主要模式，所不同只是相应抗原或抗体上标记的是三联吡啶钌。体上标记的是三联吡啶钌。二、方法类型二、方法类型 人民卫生出版社人民卫生出版社三、技术要点三、技术要点抗原抗体反应抗原抗体反应 结合物与游离物的分离结合物与游离物的分离(磁颗粒分离技术磁颗粒分离技术)电化学发光过程电化学发光过程 人民卫生出版社人民卫生出版社第五节第五节 化学发光免疫技术的临床应用化学发光免疫技术的临床应用一、化学

21、发光免疫技术的特点一、化学发光免疫技术的特点1.1.敏感度高，甚至超过敏感度高，甚至超过RIARIA；2.2.精密度和准确性均可与精密度和准确性均可与RIARIA相比；相比；3.3.试剂稳定，无毒害；试剂稳定，无毒害；4.4.测定耗时短；测定耗时短；5.5.测定项目多；测定项目多；6.6.已发展成自动化测定系统。已发展成自动化测定系统。人民卫生出版社人民卫生出版社1.1.甲状腺激素甲状腺激素 T3T3、T4T4、hTSHhTSH、FT4FT4、FT3FT3、抗、抗TPOTPO、甲状腺球蛋白、抗甲状腺球蛋白抗体等。甲状腺球蛋白、抗甲状腺球蛋白抗体等。2.2.生殖激素生殖激素 -HCG-HCG、催

22、乳素、促卵泡激素、促黄、催乳素、促卵泡激素、促黄体激素、孕酮、雌二醇、非结合雌三醇、甲胎蛋白、体激素、孕酮、雌二醇、非结合雌三醇、甲胎蛋白、睾丸酮、硫酸脱氢异雄酮。睾丸酮、硫酸脱氢异雄酮。3.3.肾上腺肾上腺/垂体激素垂体激素 皮质醇、尿皮质醇、人生长激皮质醇、尿皮质醇、人生长激素、甲状旁腺素、促肾上腺皮质激素。素、甲状旁腺素、促肾上腺皮质激素。二、二、化学发光免疫技术常见的检测项目化学发光免疫技术常见的检测项目人民卫生出版社人民卫生出版社4.4.贫血因子贫血因子 维生素维生素B12B12、叶酸、红细胞叶酸、铁蛋、叶酸、红细胞叶酸、铁蛋白等。白等。5.5.肿瘤标记物肿瘤标记物 AFPAFP、C

23、EACEA、PSAPSA、游离、游离PSAPSA、CAl9-9CAl9-9、CAl25CAl25、CAl5-3CAl5-3等。等。6 6感染性疾病感染性疾病 衣原体抗原、尿衣原体抗原、衣原衣原体抗原、尿衣原体抗原、衣原体抗原确认、弓形体体抗原确认、弓形体IgGIgG抗体、弓形体抗体、弓形体IgMIgM抗体、风抗体、风疹病毒疹病毒IgGIgG抗体、风疹病毒抗体、风疹病毒IgMIgM抗体、巨细胞病毒抗体、巨细胞病毒IgGIgG抗体、巨细胞病毒抗体、巨细胞病毒IgMIgM抗体等。抗体等。二、二、化学发光免疫技术常见的检测项目化学发光免疫技术常见的检测项目人民卫生出版社人民卫生出版社7 7糖尿病糖尿病

24、 胰岛素、胰岛素、C C肽等。肽等。8 8心血管系统心血管系统 肌酸激酶肌酸激酶MBMB同工酶、地高辛、肌红同工酶、地高辛、肌红蛋白、心肌肌钙蛋白蛋白、心肌肌钙蛋白-I-I等。等。9 9病毒标记物病毒标记物 HIVl/2AbHIVl/2Ab、H HB BsAgsAg、HBsAgHBsAg确认、确认、H HB BsAbsAb、HCVAbHCVAb、HAV IgMHAV IgM、HAVAbHAVAb、H HB BcAbcAb、HBclgMHBclgM、HBeAgHBeAg、HBeAbHBeAb等。等。二、二、化学发光免疫技术常见的检测项目化学发光免疫技术常见的检测项目人民卫生出版社人民卫生出版社1

25、010骨代谢骨代谢 骨胶原酶、脱氧吡啶啉等。骨胶原酶、脱氧吡啶啉等。1111过敏性疾病过敏性疾病 总总IgEIgE、特异性、特异性IgEIgE等。等。1212治疗药物监测治疗药物监测 茶碱、地高辛、环孢素、巴比茶碱、地高辛、环孢素、巴比妥等。妥等。二、二、化学发光免疫技术常见的检测项目化学发光免疫技术常见的检测项目人民卫生出版社人民卫生出版社化学发光是吸收了化学反应过程中所产生的化学发光是吸收了化学反应过程中所产生的化学能使分子激发而发光。化学发光免疫分化学能使分子激发而发光。化学发光免疫分析是将化学发光与免疫反应相结合，用于检析是将化学发光与免疫反应相结合，用于检测微量抗原或抗体的标记免疫分析技术，分测微量抗原或抗体的标记免疫分析技术，分为直接化学发光免疫分析，化学发光酶免疫为直接化学发光免疫分析，化学发光酶免疫分析和电化学发光免疫分析。分析和电化学发光免疫分析。小小 结结人民卫生出版社人民卫生出版社