核酸提取技术CDC培训.ppt

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1、核核 酸酸 提提 取取 技技 术术四川大学华西公共卫生学院王国庆前 言核酸是遗传信息的携带者，是基因表达的物质核酸是遗传信息的携带者，是基因表达的物质基础。在生物的生长、发育和繁殖等生命活动基础。在生物的生长、发育和繁殖等生命活动中起着十分重要的作用。中起着十分重要的作用。因此无论是进行核酸结构与功能的研究，还是因此无论是进行核酸结构与功能的研究，还是进行基因工程、蛋白质工程，首先需要对核酸进行基因工程、蛋白质工程，首先需要对核酸进行分离和纯化，核酸样品的质量将直接关系进行分离和纯化，核酸样品的质量将直接关系到实验的成败。到实验的成败。核酸的提取是分子生物学实验核酸的提取是分子生物学实验技术中

2、最重要、最基本的操作技术中最重要、最基本的操作 。DNADNA和和RNARNA都是极性化合物，溶于水，不溶于乙都是极性化合物，溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂，它们的钠盐比游离酸易醇、氯仿等有机溶剂，它们的钠盐比游离酸易溶于水。在酸性溶液中，溶于水。在酸性溶液中，DNADNA、RNARNA易水解，在易水解，在中性或弱碱性溶液中较稳定。中性或弱碱性溶液中较稳定。真核生物中，真核生物中，DNADNA主要存在于细胞核的染色体主要存在于细胞核的染色体中，中，RNARNA则主要存在于细胞质中；原核生物中，则主要存在于细胞质中；原核生物中，DNADNA主要存在于核质区，主要存在于核质区，RNARNA则主

3、要存在于细胞则主要存在于细胞质中；而非细胞形式存在的病毒和噬菌体，往质中；而非细胞形式存在的病毒和噬菌体，往往只含往只含DANDAN或只含或只含RNARNA。主要内容核酸提取的目的意义核酸提取的一般程序微生物核酸提取的方法原理核酸提取质量的鉴定核酸提取的注意事项 核酸提取的意义核酸提取的意义从生物材料中分离制备核酸，研究其结构与从生物材料中分离制备核酸，研究其结构与功能，对于了解生命活动的规律，揭示生命现功能，对于了解生命活动的规律，揭示生命现象的本质有重大意义。象的本质有重大意义。医学检验需要：是分析标本中包含的分子医学检验需要：是分析标本中包含的分子信息的前提条件，对于精确诊断疾病具有重信

4、息的前提条件，对于精确诊断疾病具有重要意义。要意义。基因工程的需要：基因工程疫苗和药物。基因工程的需要：基因工程疫苗和药物。核酸提取的一般程序核酸提取的一般程序v 核酸的提取一般分为两个阶段：核酸的提取一般分为两个阶段：分离纯化：分离纯化：使核酸与裂解体系中的其使核酸与裂解体系中的其它成分，如蛋白质、盐及其它杂质彻它成分，如蛋白质、盐及其它杂质彻底分离。底分离。裂解细胞：裂解细胞：使样品中的核酸游离在裂使样品中的核酸游离在裂解体系中解体系中。细胞的裂解 分离提取核酸，首先要求核分离提取核酸，首先要求核酸酸从原来的从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来，并保组织或细胞中以溶解的状态释放出来，并

5、保持原来的天然状态，不丢生物活性。因此应持原来的天然状态，不丢生物活性。因此应选择适当的方法将组织和细胞破碎。但若材选择适当的方法将组织和细胞破碎。但若材料是体液（如血）或生物体分泌到体外的分料是体液（如血）或生物体分泌到体外的分泌物，则不必进行组织细胞的破碎泌物，则不必进行组织细胞的破碎一般动物组织和细胞可用电动捣碎机或匀浆器破一般动物组织和细胞可用电动捣碎机或匀浆器破碎或用超声波处理破碎。碎或用超声波处理破碎。植物组织和细胞由于具有纤维素、半纤维素和果植物组织和细胞由于具有纤维素、半纤维素和果胶等物质组成的细胞壁，一般常用与石英砂和适胶等物质组成的细胞壁，一般常用与石英砂和适当的提取液一起

6、研磨的方法破碎或用纤维素酶处当的提取液一起研磨的方法破碎或用纤维素酶处理也能达到目的。理也能达到目的。细菌细胞的破碎比较困难，因为整个细菌细胞壁细菌细胞的破碎比较困难，因为整个细菌细胞壁的骨架实际上是一借共价键连接而成的肽聚糖囊的骨架实际上是一借共价键连接而成的肽聚糖囊状大分子，非常坚韧。状大分子，非常坚韧。细胞的裂解方法：细菌有坚硬的细胞壁，裂解细胞有三种方法：细菌有坚硬的细胞壁，裂解细胞有三种方法：机械方法：超声波处理法、研磨法、匀浆法；机械方法：超声波处理法、研磨法、匀浆法；化学试剂法：用化学试剂法：用SDS处理细胞；处理细胞；酶解法：加入溶菌酶或蜗牛酶，可使细胞壁破碎。酶解法：加入溶菌

7、酶或蜗牛酶，可使细胞壁破碎。细胞裂解后，核酸与大量细胞裂解后，核酸与大量杂质杂质在一起，必须在一起，必须进行分离纯化。进行分离纯化。关键：蛋白质的去除关键：蛋白质的去除 核酸的分离纯化l蛋白质的去除可以选择蛋白质的去除可以选择酶法酶法、去污剂去污剂法法或或有机溶剂法有机溶剂法或或联合运用联合运用上述方法。上述方法。蛋白质蛋白质多糖多糖微生物核酸提取的方法原理微生物核酸提取的方法原理1.阴离子表面活性剂法阴离子表面活性剂法原理：利用原理：利用SDSSDS等等阴离子表面活性剂阴离子表面活性剂与蛋与蛋白质带正电荷的侧链结合，从而使核酸与白质带正电荷的侧链结合，从而使核酸与蛋白质分开蛋白质分开。然后加

8、入浓醋酸钾溶液，使。然后加入浓醋酸钾溶液，使SDS-SDS-蛋白质复合物沉淀，并使多余的蛋白质复合物沉淀，并使多余的SDSSDS转化为溶解度小的钾盐而同时沉淀转化为溶解度小的钾盐而同时沉淀微生物核酸提取的方法原理微生物核酸提取的方法原理2.有机溶剂法有机溶剂法原理：原理：利用酚、氯仿的混合液与含核酸和利用酚、氯仿的混合液与含核酸和蛋白质的水溶液一起振摇时形成乳状液，蛋白质的水溶液一起振摇时形成乳状液，蛋白质因充分接触酚和氯仿而变性，与核蛋白质因充分接触酚和氯仿而变性，与核酸分开。离心后可分为两相，一般上层为酸分开。离心后可分为两相，一般上层为含核酸的水相，下层为有机相，交界处是含核酸的水相，下

9、层为有机相，交界处是变性凝聚的蛋白质层。变性凝聚的蛋白质层。原理：利用蛋白酶消化降解蛋白质，达到去除原理：利用蛋白酶消化降解蛋白质，达到去除蛋白质的目的。蛋白质的目的。微生物核酸提取的方法原理微生物核酸提取的方法原理3.酶法酶法核酸提取质量的鉴定核酸提取质量的鉴定 纯度 浓度 完整性OD260/OD280=1.8（1.61.9）1.9，RNA污染1.6，蛋白、酚污染uDNA电泳观察条带情况OD260=1 时，DNA=50g/ml1cm核酸提取质量的鉴定核酸提取质量的鉴定 纯度 浓度 完整性OD260/OD280=2.0（1.72.0）2.0，异硫氰酸残留1.7，蛋白、酚污染uRNA电泳观察条带

10、情况OD260=1 时，RNA=40g/ml1cm核酸提取的注意事项核酸提取的注意事项为了确保核酸的完整性，实验应注意：温度不宜过高；温度不宜过高；控制一定的控制一定的pHpH值范围（值范围（pH5pH59 9），），过酸或过酸或过碱均能破坏核酸链中磷酸二酯键；过碱均能破坏核酸链中磷酸二酯键；保持一定的离子强度，有助于维持核酸的保持一定的离子强度，有助于维持核酸的空间构型；空间构型；减少物理因素对核酸的降解机械剪切力，减少物理因素对核酸的降解机械剪切力，如强力高速振荡、搅拌、样品反复冻贮等。如强力高速振荡、搅拌、样品反复冻贮等。DNA提取的方法q基因组基因组DNADNA的提取的提取CTABCT

11、AB法法SDSSDS法法其它其它q非基因组非基因组DNADNA的提取的提取质粒质粒DNADNA 碱裂解法碱裂解法 煮沸法煮沸法基因组DNA CTAB法q原理原理CTAB（hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。该复剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。该复合物在高盐溶液中（合物在高盐溶液中（0.7mol/L NaCl）是可溶是可溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出

12、来。等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。q原理原理基因组DNASDS法SDSSDS在在高高温温（55556565）条条件件下下能能裂裂解解细细胞胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸；使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸；提提高高盐盐(KAcKAc或或NHNH4 4Ac)Ac)浓浓度度并并降降低低温温度度（冰冰浴浴），使蛋白质及多糖杂质沉淀，离心后除去沉淀；使蛋白质及多糖杂质沉淀，离心后除去沉淀；上上清清液液中中的的DNADNA用用酚酚/氯氯仿仿抽抽提提，反反复复抽抽提提后后用乙醇沉淀水相中的用乙醇沉淀水相中的DNADNA。q SDSSDS法流程图法流程图基因组DNASDS法标标 本、本、细

13、菌培养物细菌培养物上层溶液上层溶液干燥溶解干燥溶解离心洗涤离心洗涤酒精沉淀酒精沉淀DNA溶液溶液裂解抽提裂解抽提基因组DNA其它方法物理方式物理方式：玻璃珠法、：玻璃珠法、超声波法、研磨法、冻融法超声波法、研磨法、冻融法化学方式化学方式：异硫氰酸胍法、碱裂解法：异硫氰酸胍法、碱裂解法生物方式生物方式：酶法：酶法q根据细胞裂解方式的不同有：根据细胞裂解方式的不同有：基因组DNA其它方法吸附材料结合法：吸附材料结合法：q根据核酸分离纯化方式的不同有：根据核酸分离纯化方式的不同有：硅质材料硅质材料高盐低高盐低pHpH值结合核酸，低盐值结合核酸，低盐高高pHpH值洗脱。值洗脱。快捷高效。快捷高效。低盐

14、高低盐高pHpH值结合核酸，高盐值结合核酸，高盐低低pHpH值洗脱。值洗脱。适用于纯度适用于纯度要求高的实验。要求高的实验。阴离子交阴离子交 换树脂换树脂基因组DNA其它方法浓盐法浓盐法：有机溶剂抽提法有机溶剂抽提法：密度梯度离心法：密度梯度离心法：利用利用RNP和和DNP在盐溶液中溶解度不同，将二者分离在盐溶液中溶解度不同，将二者分离有机溶剂作为蛋白变性剂，同时抑制核酸酶的降解作用有机溶剂作为蛋白变性剂，同时抑制核酸酶的降解作用利用不同内容物密度不同的原理分离各种内容物利用不同内容物密度不同的原理分离各种内容物质粒DNA碱裂解法q 原理原理在在pH 12.012.6环境中，线性的大分子量细菌

15、染色体环境中，线性的大分子量细菌染色体DNA变性，而共价闭环质粒变性，而共价闭环质粒DNA仍为自然状态。仍为自然状态。将将pH调至中性并在高盐浓度的条件下，染色体调至中性并在高盐浓度的条件下，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构，大部分之间交联形成不溶性网状结构，大部分DNA和蛋白质和蛋白质在去污剂在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍为可仍为可溶状态，通过离心可除去大部分细胞碎片、染色体溶状态，通过离心可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒及蛋白质，质粒DNA尚在上清中，再用尚在上清中，再用酚氯仿抽提进一步纯化质粒酚氯仿抽提进一步纯化质粒D

16、NA。质粒DNA碱裂解法流程对数期菌体对数期菌体溶液溶液III中和中和溶液溶液I充分重悬充分重悬溶液溶液II裂解裂解上清液上清液抽提抽提离心洗涤离心洗涤酒精沉淀酒精沉淀干燥溶解干燥溶解沉淀沉淀质粒质粒DNA溶液溶液质粒DNA煮沸法q煮沸法原理煮沸法原理染色体染色体DNADNA比质粒比质粒DNADNA分子大得多，且染色体分子大得多，且染色体DNADNA为为线状分子，而质粒线状分子，而质粒DNADNA为共价闭合环状分子；为共价闭合环状分子；当加热处理当加热处理DNADNA溶液时，线状染色体溶液时，线状染色体DNADNA容易发生容易发生变性，共价闭环的质粒变性，共价闭环的质粒DNADNA在冷却时即恢

17、复其天然在冷却时即恢复其天然构象；构象；变性染色体变性染色体DNADNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀，而复性的超螺旋质粒形成沉淀，而复性的超螺旋质粒DNADNA分子则以溶解分子则以溶解状态存在液相中，从而可通过离心将两者分开。状态存在液相中，从而可通过离心将两者分开。DNA提取的基本步骤I.I.材料准备材料准备II.II.破碎细胞或包膜内容物释放破碎细胞或包膜内容物释放III.III.核酸分离、纯化核酸分离、纯化IV.IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质沉淀或吸附核酸，并去除杂质V.V.核酸溶解在适量缓冲液或水中核酸溶解在适量缓冲液或水中材料准备最好使用新鲜

18、材料，最好使用新鲜材料，低温保低温保存的样品材料不要反复冻融存的样品材料不要反复冻融提取血液基因组提取血液基因组DNA时，要时，要选择有核细胞（白细胞）选择有核细胞（白细胞）组培细胞培养时间不能过长，组培细胞培养时间不能过长，否则会造成否则会造成DNA降解降解含病毒的液体材料含病毒的液体材料DNADNA含量较含量较少，提取前先富集少，提取前先富集基因组基因组DNADNA的提取的提取质粒质粒DNADNA的提取的提取使用处于对数期的新鲜菌体（老使用处于对数期的新鲜菌体（老化菌体导致开环质粒增加）化菌体导致开环质粒增加）培养时应加入筛选压力，否则菌培养时应加入筛选压力，否则菌体易污染，质粒易丢失体易

19、污染，质粒易丢失尽量选择高拷贝的质粒，如为低尽量选择高拷贝的质粒，如为低拷贝或大质粒，则应加大菌体用拷贝或大质粒，则应加大菌体用量量菌株不要频繁转接（质粒丢失）菌株不要频繁转接（质粒丢失）细胞裂解材料应适量，过多会影响裂材料应适量，过多会影响裂解，导致解，导致DNA量少，纯度低量少，纯度低针对不同材料，选择适当的针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式：裂解预处理方式：细菌溶菌酶破壁细菌溶菌酶破壁酵母破壁酶或玻珠酵母破壁酶或玻珠高温温浴时，定时轻柔振荡高温温浴时，定时轻柔振荡基因组基因组DNADNA的提取的提取质粒质粒DNADNA的提取的提取菌体量适当菌体量适当培养基去除干净，同时保证培养基去除

20、干净，同时保证菌体充分悬浮菌体充分悬浮变性的时间不要过长（变性的时间不要过长（5分钟）分钟），否则质粒易被打断，否则质粒易被打断复性时间也不宜过长，否则复性时间也不宜过长，否则会有基因组会有基因组DNA的污染的污染G菌、酵母质粒的提取，应菌、酵母质粒的提取，应先用酶法或机械法处理，以先用酶法或机械法处理，以破壁破壁核酸分离、纯化采用吸附材料吸附的方式分离采用吸附材料吸附的方式分离DNA时，应提供相时，应提供相应的缓冲体系应的缓冲体系采用有机（酚采用有机（酚/氯仿）抽提时应充分混匀，但动氯仿）抽提时应充分混匀，但动作要轻柔作要轻柔离心分离两相时，应保证一定的转速和时间离心分离两相时，应保证一定的

21、转速和时间针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应的针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应的去杂质的方法去杂质的方法基因组基因组DNADNA的提取的提取质粒质粒DNADNA的提取的提取核酸分离、纯化q蛋白质的去除：蛋白质的去除：酚酚/氯仿抽提氯仿抽提使用变性剂变性（使用变性剂变性（SDSSDS、异硫异硫氰酸胍等）氰酸胍等）高盐洗涤高盐洗涤蛋白酶处理蛋白酶处理q多糖的去除：多糖的去除：核酸分离、纯化高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入1/21/2体积的体积的5M NaCl5M NaCl，高盐可溶解多糖。高盐可溶解多糖。用多糖水解酶将多糖降解。用多糖水

22、解酶将多糖降解。在提取缓冲液中加在提取缓冲液中加1/21/2体积的氯苯（与多糖的体积的氯苯（与多糖的羟基作用去除多糖羟基作用去除多糖 ）。用用PEGPEG80008000代替乙醇沉淀代替乙醇沉淀DNADNA：在：在500L DNA500L DNA液中液中加入加入200l 20%PEG200l 20%PEG8000 8000(含含1.2 M NaCl)1.2 M NaCl)，冰冰浴浴20min20min。q多酚的去除：多酚的去除：在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂：在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂：-巯基乙醇、巯基乙醇、抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等加入易与酚类结

23、合的试剂：如加入易与酚类结合的试剂：如PVPPVP、PEG(PEG(聚乙二醇聚乙二醇)，它，它们与酚类有较强的亲和力，可防止酚类与们与酚类有较强的亲和力，可防止酚类与DNADNA的结合的结合核酸分离、纯化q盐离子的去除：盐离子的去除：7070的乙醇洗涤的乙醇洗涤核酸沉淀、溶解当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀，当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀，沉淀会更充分沉淀会更充分沉淀时加入沉淀时加入1/10体积的体积的NaAc（pH5.2，3M），），有有利于充分沉淀利于充分沉淀沉淀后应用沉淀后应用70的乙醇洗涤，以除去盐离子等的乙醇洗涤，以除去盐离子等晾干晾干DNA，让乙醇充分挥发（不

24、要过分干燥）让乙醇充分挥发（不要过分干燥）若长期储存建议使用若长期储存建议使用TE缓冲液溶解缓冲液溶解TE中的中的EDTA能抑制能抑制DNasepH值为值为8.0，可防止，可防止DNA发生酸解发生酸解 基因组基因组DNADNA的提取的提取质粒质粒DNADNA的提取的提取1.1.含有蛋白、多糖、含有蛋白、多糖、多酚类杂质多酚类杂质2.2.有酒精残留，酒精有酒精残留，酒精抑制后续酶解反应抑制后续酶解反应3.3.有金属离子残留有金属离子残留1.1.重新纯化重新纯化DNADNA，去除蛋白、去除蛋白、多糖、多酚等杂质多糖、多酚等杂质2.2.重新沉淀重新沉淀DNADNA，让酒精充分让酒精充分挥发挥发3.3

25、增加增加7070乙醇洗涤的次数乙醇洗涤的次数（2-32-3次）次）DNA提取常见问题q问题一：问题一：DNADNA样品不纯样品不纯，抑制后续酶解和，抑制后续酶解和PCRPCR反应。反应。原原因因对对策策1.1.材料不新鲜或反复冻材料不新鲜或反复冻融融2.2.未很好抑制内源核酸未很好抑制内源核酸酶的活性酶的活性3.3.提取过程操作过于剧提取过程操作过于剧烈，烈，DNADNA被机械打断被机械打断4.4.外源核酸酶污染外源核酸酶污染5.5.反复冻融反复冻融1.1.尽量取新鲜材料，低温尽量取新鲜材料，低温保存材料避免反复冻融保存材料避免反复冻融2.2.细胞裂解后的后续操作细胞裂解后的后续操作应尽量轻

26、柔应尽量轻柔3.3.所有试剂用无菌水配制，所有试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌耗材经高温灭菌4.4.将将DNADNA分装保存于缓冲液分装保存于缓冲液中，避免反复冻融中，避免反复冻融DNA提取常见问题q问题二：问题二：DNADNA降解。降解。对对策策 原原因因1.1.实验材料不佳或量少实验材料不佳或量少2.2.破壁或裂解不充分破壁或裂解不充分3.3.沉淀不完全沉淀不完全4.4.洗涤时洗涤时DNADNA丢失丢失1.1.尽量选用新鲜的材料尽量选用新鲜的材料2.2.G G菌、酵母裂解前先用生物菌、酵母裂解前先用生物酶或机械方式破壁酶或机械方式破壁3.3.高温裂解时，时间适当延长高温裂解时，时间适当延长

27、细菌可增加（细菌可增加PKPK的用量）的用量）4.4.延长低温沉淀时间延长低温沉淀时间5.5.加辅助物，促进沉淀加辅助物，促进沉淀6.6.洗涤时，最好用枪头将洗涤洗涤时，最好用枪头将洗涤液吸出，勿倾倒液吸出，勿倾倒DNA提取常见问题q问题三：问题三：DNADNA提取量少提取量少对对策策 原原因因RNARNA提取的通用方法提取的通用方法q异硫氰酸胍异硫氰酸胍/苯酚法苯酚法原理：原理：细胞在细胞在变性剂异硫氰酸胍的作用下被裂解，变性剂异硫氰酸胍的作用下被裂解，同时核蛋白体上的蛋白变性，核酸释放；同时核蛋白体上的蛋白变性，核酸释放；释放的释放的DNADNA和和RNARNA在特定在特定pHpH下分别

28、位于体系下分别位于体系的中间相和水相，从而得以分离的中间相和水相，从而得以分离；有机溶剂抽提，沉淀，得到纯净有机溶剂抽提，沉淀，得到纯净RNARNA。步骤步骤:材料准备：材料准备：尽量新鲜。尽量新鲜。裂解变性裂解变性：异硫氰酸胍异硫氰酸胍（亚硫氢胍，巯基乙醇，亚硫氢胍，巯基乙醇，N-N-月桂肌氨月桂肌氨酸等）。使细胞及核蛋白复合物变性，释放酸等）。使细胞及核蛋白复合物变性，释放RNARNA，有效抑制有效抑制核酸酶。核酸酶。纯化分离：纯化分离：苯酚，氯仿，异戊醇。苯酚苯酚，氯仿，异戊醇。苯酚/氯仿可抽提去除杂氯仿可抽提去除杂物。物。洗涤：洗涤：7070乙醇。乙醇。沉淀：沉淀：异丙醇、无水乙醇。异

29、丙醇、无水乙醇。乙酸钠（乙酸钠（pH4.0pH4.0）：）：维持变性的细胞裂解液的维持变性的细胞裂解液的pHpH值，值，沉淀沉淀RNARNA。此外还常用氯化锂选择沉淀此外还常用氯化锂选择沉淀RNARNA。影响影响RNARNA提取的因素提取的因素q 材料材料：新鲜，切忌使用反复冻融的材料新鲜，切忌使用反复冻融的材料若材料来源困难，且实验需要一定的时间间若材料来源困难，且实验需要一定的时间间隔。可以先将材料贮存在隔。可以先将材料贮存在TRIzolTRIzol或或样品贮存样品贮存液中，于液中，于-70-70或或-20-20保存保存如要多次提取，请分成多份保存如要多次提取，请分成多份保存液氮长期保存，

30、液氮长期保存，-70-70短期保存短期保存影响影响RNARNA提取的因素提取的因素q 样品破碎及裂解样品破碎及裂解：根据不同材料选择不同的处理方法：根据不同材料选择不同的处理方法：培养细胞：培养细胞：通常可直接加裂解液裂解通常可直接加裂解液裂解酵母和细菌：一般酵母和细菌：一般TRIzolTRIzol可直接裂解，对于一些可直接裂解，对于一些特殊的材料可先用酶或者机械方法破壁特殊的材料可先用酶或者机械方法破壁动植物组织：动植物组织：先液氮研磨和匀浆，后加裂解液裂先液氮研磨和匀浆，后加裂解液裂解。期间动作快速，样品保持冷冻解。期间动作快速，样品保持冷冻样品量适当，保证充分裂解样品量适当，保证充分裂解

31、为减少为减少DNADNA污染，可适当加大裂解液的用量污染，可适当加大裂解液的用量q 纯化：纯化：在使用氯仿抽提纯化时，一定要充分混匀，在使用氯仿抽提纯化时，一定要充分混匀，且动作快速；且动作快速；经典的纯化方法，如经典的纯化方法，如 LiClLiCl 沉淀等，虽然经沉淀等，虽然经济，但操作时间长，易造成济，但操作时间长，易造成 RNA RNA 降解；降解；柱离心式纯化方法：抽提速度快，能有效去柱离心式纯化方法：抽提速度快，能有效去除影响除影响 RNA RNA 后续酶反应的杂质，是目前较后续酶反应的杂质，是目前较为理想的选择。为理想的选择。影响RNA提取的因素RNA提取常见问题q RNA RNA

32、 的降解的降解 q ODOD260260/OD/OD280280 比值偏低比值偏低q 电泳带型异常电泳带型异常q 下游实验效果不佳下游实验效果不佳RNARNA降解降解q 新鲜细胞或组织：新鲜细胞或组织：裂解液的质量、用量不足裂解液的质量、用量不足外源外源RNaseRNase的污染的污染另另外外某某些些富富含含内内源源酶酶的的样样品品 (如如脾脾脏脏，胸胸腺等腺等)，很难避免，很难避免 RNA RNA 的降解。的降解。建议在液氮条件下将组织碾碎，并且匀浆时使用建议在液氮条件下将组织碾碎，并且匀浆时使用更多裂解液。更多裂解液。RNARNA降解降解样样品品取取材材后后应应立立即即置置于于液液氮氮中中

33、速速冻冻，然然后后可可以移至以移至-70-70冰箱保存。样品要相对小一点；冰箱保存。样品要相对小一点；先用液氮研磨，再加裂解液匀浆；先用液氮研磨，再加裂解液匀浆；样样品品与与裂裂解解液液充充分分接接触触前前避避免免融融化化，研研磨磨用用具必须预冷，碾磨过程中及时补充液氮。具必须预冷，碾磨过程中及时补充液氮。q 冷冻样品：冷冻样品：ODOD260260/OD/OD280280 比值偏低比值偏低q 蛋白质污染：蛋白质污染：不不要要吸吸入入中中间间层层及及有有机机相相，加加入入氯氯仿仿后后首首先先混混匀匀，并并且且离离心分层的离心力和时间要足够。心分层的离心力和时间要足够。减少起始样品量，确保裂解完

34、全、彻底减少起始样品量，确保裂解完全、彻底解决办法解决办法:重新抽提一次，再沉淀，溶解。重新抽提一次，再沉淀，溶解。q 苯酚残留：苯酚残留：不不要要吸吸入入中中间间层层及及有有机机相相，加加入入氯氯仿仿后后首首先先混混匀匀，并并且且离离心分层的离心力和时间要足够。心分层的离心力和时间要足够。解决办法解决办法:重新抽提一次，再沉淀，溶解。重新抽提一次，再沉淀，溶解。q 抽提试剂残留：抽提试剂残留：确保洗涤时要彻底悬浮确保洗涤时要彻底悬浮 RNARNA，并且彻底去掉并且彻底去掉 75%75%乙醇。乙醇。解决办法解决办法:再沉淀一次后，溶解。再沉淀一次后，溶解。q 设备限制：设备限制：测测定定ODO

35、D260260 及及ODOD280280 数数值值时时，要要使使ODOD260260 读读数数在在 0.10 0.50 之之间。此范围线性最好。间。此范围线性最好。q 用水稀释样品：用水稀释样品：测测 OD OD 时时，对对照照及及样样品品稀稀释释液液请请使使用用 10 10 mMmM TrisTris，pH pH 7.57.5。用水作为稀释液将导致比值的降低。用水作为稀释液将导致比值的降低。ODOD260260/OD/OD280280 比值偏低比值偏低电泳带型异常电泳带型异常q 非变性电泳：非变性电泳：上样量超过上样量超过 3ug，电压超过电压超过 6V/cm，电泳缓冲液陈电泳缓冲液陈旧，均

36、可能导致条带分不开。旧，均可能导致条带分不开。q 变性电泳条带变淡：变性电泳条带变淡：EB 与单链的结合能力要差一些，故同样的上样量，与单链的结合能力要差一些，故同样的上样量，变性电泳比非变性电泳要淡一些；变性电泳比非变性电泳要淡一些；甲醛的质量不高甲醛的质量不高。下游实验效果不佳下游实验效果不佳q RNA RNA 降解降解 q 抽提试剂的残留抽提试剂的残留 75%75%乙醇洗涤乙醇洗涤 q 样品中杂质的残留样品中杂质的残留 多糖等杂质，再次沉淀多糖等杂质，再次沉淀 q DNA DNA 污染污染 使用使用RNaseRNase-Free-Free 的的 DNaseDNase I I 消化抽提消化抽提RNA RNA